专利名称：一株产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建及其定向改造方法
技术领域：
本发明包括采用基因工程技术构建精氨酸脱亚胺酶(ADI)重组菌及其定向改造的 方法，属于医药生物工程技术领域。
背景技术：
精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase，EC 3. 5. 3. 6，简称ADI)是一种极具潜 力的用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤的抗癌新药，包括目前尚缺乏有效药物治疗的肝细胞瘤 (hepatocellular carcinomas，简称 HCCs)以及黑素瘤(melanomas)。人们对 ADI 的抗癌活 性的认识始于精氨酸对肿瘤细胞生长所起的重要作用。精氨酸是一种对人类以及鼠的正常 细胞都是非基本氨基酸，因为精氨酸可以由瓜氨酸，通过尿素循环的过程中的两种酶，精氨 基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(AL)而生成。但是一些精氨酸缺陷型肿瘤细 胞不表达ASS，自身无法合成精氨酸。研究显示ADI对于精氨酸缺陷型肿瘤，特别是黑素瘤 以及肝细胞瘤，具有显著的抑制作用。目前，ADI基因已经从细菌和厌氧真核细胞中被分离出来，然而在高等真核细胞 中目前还没有发现有ADI基因和ADI活性的报道。目前，来源于Sti^ptococcus sanguis、 Mycoplasma arginini、Giardia intes finals, Pseudomonas aeruginosa 私 Lactococcus lactis的ADI编码基因被克隆并在大肠杆菌中表达。1966年，khimke等人发现由支原体 Mycoplasma hominis对肿瘤细胞的抑制作用是通过一种降解精氨酸的酶引起的，这种酶就 是ADI。1971年，日本的Kakinoto等人筛选出一株具有很高ADI酶活性的恶臭假单胞菌 (.Pseudomonas /^iiife)；并纯化得到ADI的蛋白质晶体。但是真正将ADI应用于癌症治疗 是最近二十年来才为人们所接受并关注。2002年，Ensor等发现在大肠杆菌中重组表达的 支原体ADI对精氨酸营养缺陷型的23种人的黑素瘤以及16种人的肝细胞瘤在体外和体内 都具有活性，通过对ADI进行聚乙二醇(PEG)化提高了 ADI在体内的半衰期。2004年，他们 将ADI-PEG-20用于肝癌的临床实验，结果成功使患者血浆中的精氨酸的可检测浓度降为 零。目前，栉⑶/？办Pharmacologic公司开发的支原体来源的ADI-PEG-20制剂用于肝细胞 癌和黑素瘤(药品名称分别为Ifepacid和Melanocid)的II期和III期临床试验正在美国和意 大利进行。本研究室通过筛选得到一株具有较高ADI活性的变形假单胞菌M /^ ^ο^7ο·5·^ Κ6Μ(Χ2039，通过 PCR 扩增获得该 ADI 基因(中国专利200710107822. X) 并构建重组菌。研究表明，该重组ADI的最适pH为6. 0，生理pH7. 4的残余酶活低于10%， 且&较高(2. 88mmol/L,pH6. 0)，限制了该重组ADI酶作为抗癌药物的应用前景。为解决这 一问题，本发明对该重组ADI进行定向改造以提高其在生理中性条件pH下的活性并降低其 乙值，采用 error-prone PCR (易错 PCR)突变技术，从 A plecoglossicida CGMCC 2039 的 ADI编码基因出发，基于改良的二乙酰一肟硫胺脲(测定瓜氨酸)方法，建立了简便灵敏的96 孔板高通量筛选模型。
发明内容
本发明的目的本发明的目的是采用PCR扩增获得P. plecoglossicida CGMCC 2039的ADI编码基因，构建重组质粒并于大肠杆菌中表达选取具有改良酶活的ADI突变体， 对其进行定向改造。本发明的技术方案一种产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建方法，步骤如下
1)由产精氨酸脱亚胺酶ADI的变形假单胞菌G^ewi/offloaasplecoglossicida ) CGMCC No. 2039，扩增ADI的编码基因arcA ；
2)将arcA基因连接在表达质粒pET2^上，酶切位点为MfeI及损ο I，获得重组质粒 pET24a-ADI ；
3)将重组质粒pET2^-ADI转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得产ADI的大肠杆菌重组菌； 该重组菌产生的重组ADI基因全长1254bp，编码417个氨基酸，蛋白质分子量为92. 6kDa, 由两个相同的亚基组成。所述产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的定向改造方法，步骤如下
1)采用易错PCR技术，以所述重组质粒pET2^-ADI为模板，设计引物，扩增获得ADI突 变基因；
2)将步骤(1)所得易错PCR产物及表达质粒pET2^用NdeIRXho I双酶切后连接， 连接产物转入大肠杆菌BL21 (DE3)构建重组ADI基因突变库；
3)采用改良的二乙酰一肟硫胺脲测定瓜氨酸方法，建立96孔板高通量筛选模型，用于 筛选生理pH条件下酶活9. 02U/mg以上和Λ；值低于0. 65mmol/L的ADI，获得重组菌ADI M314。所述重组ADI突变株M314携带三个突变位点分别为AU8T，H404R和I410L ；在 生理pH条件下即pH7. 4下较野生ADI酶活提高20倍以上，达到9. 02U/mg, Km值下降至 0. 65mmol/L,最适 pH 从 6. 0 提高至 6. 5。所述重组ADI M314，经过酶活和酶学性质改善后应用于医药方面。所述重组ADI酶活测定方法如下
将适量酶液加入到L-精氨酸盐酸盐-磷酸缓冲液中，37°C反应30min，100°C水浴 终止反应，测定瓜氨酸含量。酶活定义37°C时，每分钟转化IMfflOl精氨酸盐酸盐生成瓜氨酸所需的酶量。二乙酰一肟硫氨脲溶液Ig 二乙酰一肟，30mg硫氨脲，蒸馏水定容至IOOmL ；十六 烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB) =Ig CTAB,蒸馏水定容至IOOOmL ；混酸量取70mL浓磷酸， 160mL浓硫酸，缓缓加于600mL蒸馏水中，冷却后加入IOmL 10 g/L的三氯化铁溶液，加蒸 馏水定容至IOOOmL ；L-精氨酸盐酸盐-磷酸缓冲液0. 2mol/L pH6. 0磷酸钠缓冲液1L，加 0. Olmol/L-精氨酸盐酸盐。本发明的有益效果原有技术将变形假单胞菌0°.编码基 因于大肠杆菌中表达。重组菌诱导培养后，经阴离子交换和凝胶过滤层析得到电泳纯重组 ADI,比酶活为20. 85U/mg (pH 6. 0，37°C)。对该酶进行酶学性质研究，其Λ；为2. 88mmol/L (ρΗ6· 0) ；Visax 为 31. 68 μ mol/min · mg ；最适反应 pH 为 6. 0，当 pH 升高至生理 pH (7. 4)时， 其酶活下降超过90%。该ADI在生理pH条件下较低的酶活和较高的Λ；值成为其抗癌活性 研究的限制性因素。
本发明基于改良的二乙酰一肟硫胺脲(测定瓜氨酸)方法，建立了简便灵敏的96孔 板高通量筛选模型，用于获得生理PH条件下具有高酶活和低乙值的ADI。通过一轮易错 PCR,筛选获得一株优良的突变株M314。将该重组菌诱导培养后，经阴离子交换和凝胶过滤 层析得到电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶，其生理PH条件下比酶活提高20倍以上，&值下降至 0. 65mmol/L (pH7. 4)，最适pH从6. 0提高至6. 5。本发明为获得优良的ADI突变株提供了 有效的定向改造方法并对开发有市场前景和自主知识产权的抗癌新药有重要实践价值。
图1重组ADI突变株M314和野生型ADI在不同pH条件下的活性变化。
具体实施例方式实施例1重组ADI的构建 根据该ADI的基因序列，设计引物
F :5，- GCTCATATGTCCGCTGAAAAACAGAAGTACG -3，{Ndel) R 5' - ATCTCGAGTTAGTAGTTGATCGGGTCGCGCA -3，{Xhol)
上下游分别引入MfeI和损ol酶切位点(下划线标出)，本发明中所用引物均由上海生 工生物工程技术服务有限公司合成。以变形假单胞菌菌体为模板，PCR扩增ADI基因片段，反应体系50 μ ,如表1所 示
表1 PCR扩增ADI基因片段反应体系
IOXEx Taq Buffer5 μ 2. 5 mM dNTPs4 μ F-Primer (20 μΜ)1 μ R-Primer (20 μΜ)1 μ 菌体-Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ 0. 5 μ ddH2038.5 μ
反应程序在94 °C变性10 min ；以94 V 1 min、56 V 45 s、72 V 2 min的条件反 应30循环后，72 °C延伸10 min，得到PCR产物ADI。将PCR产物ADI进行切胶纯化处理后，与pMD18-T Simple Vector载体连接并转 入大肠杆菌JM109感受态细胞。感受态细胞制备采用CaCl2法将宿主菌五coli JM 109 接种于LB液体培养基中，37°C、200 r/min条件下培养过夜；转接，培养至OD6tltl 0.4左右， 冰浴 10 min;离心(4 "C >4000 r/min 10 min)收集菌体；将细胞用 0.1 mol/L 的 MgCl2/ CaCl2溶液悬浮；离心(4 4000 r/min 10 min)收集菌体，去上清液；加入0. 1 mol/ L CaCl2 lmL，分装至1.5 mL离心管内，每管100 μ , -80 °C保存。将100 μ 感受态细胞冰浴，加入已连接的重组质粒，轻柔混勻，于冰浴中静置30 min ；42 °C热转化90 s后，冰浴2 min ；加入890 μ SOC培养基(室温)，培养1 h，涂布 LB/Amp平板37 °C培养过夜。将重组pMD18-T-ADI质粒与表达pET2^双酶切，重组质粒pMD18_T_ADI的酶切反 应体系组成如表2所示，表达载体pET2^的酶切反应体系如表3所示。
权利要求
1.一种产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建方法，其特征在于(1)由产精氨酸脱亚胺酶ADI的变形假单胞菌iFseudomonasplecoglossicida )CGMCC No. 2039，扩增ADI的编码基因arcA ；(2)将arcA基因连接在表达质粒pET2^上，酶切位点为MfeI RXho I，获得重组质 粒 pETMa-ADI ；(3)将重组质粒pET2^-ADI转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得产ADI的大肠杆菌重组菌； 该重组菌产生的重组ADI基因全长1254bp，编码417个氨基酸，蛋白质分子量为92. 6kDa, 由两个相同的亚基组成。
2.—种权利要求1所述方法构建的产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的定向改造方法，其特 征在于步骤如下(1)采用易错PCR技术，以权利要求1所述重组质粒pET2^-ADI为模板，设计引物，扩 增获得ADI突变基因；(2)将步骤(1)所得易错PCR产物及表达质粒pET2^用Mfe\lXho I双酶切后连 接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE!3)构建重组ADI基因突变库；(3)采用改良的二乙酰一肟硫胺脲测定瓜氨酸方法，建立96孔板高通量筛选模型，用 于筛选生理pH条件下酶活9. 02U/mg以上和&值低于0. 65mmol/L的ADI，获得重组菌ADI M314。
3.根据权利要求2所述的定向改造方法，其特征在于所述重组菌ADIM314携带三个 突变位点分别为AU8T，H404R和I410L ；在生理pH条件下即pH7. 4下较野生ADI酶活提高 20倍以上，达到9. 02U/mg,4值下降至0. 65mmol/L，最适pH从6. 0提高至6. 5。
4.权利要求2所述的定向改造方法获得的重组菌ADIM314的应用，其特征在于所述重 组ADI M314，经过酶活和酶学性质改善后应用于医药方面。
全文摘要
一株产精氨酸脱亚胺酶(ADI)的重组菌的构建及其定向改造方法，属于医药生物工程技术领域。其中包括采用PCR方法，扩增变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)CGMCC No.2039的ADI编码基因arcA，构建ADI重组表达菌种，对该重组ADI酶进行酶学性质研究，其Km为2.88mmol/L(pH6.0)，最适反应pH为6.0，比酶活为20.85U/mg，当pH升高至生理pH(7.4)时，比酶活下降超过90%。采用易错PCR突变技术，对该重组ADI酶进行定向改造以提高其在生理中性条件pH下的活性及底物亲和力。通过一轮定向改造，筛选获得一株优良的突变株ADIM314，ADIM314酶和野生酶相比其生理pH条件下比酶活提高20倍以上，Km值下降至0.65mmol/L(pH7.4)，最适反应pH从6.0提高至6.5。
文档编号C12N9/78GK102061283SQ20101057285
公开日2011年5月18日 申请日期2010年12月5日 优先权日2010年12月5日
发明者倪晔, 孙志浩, 郑璞 申请人:江南大学