专利名称：模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法
技术领域：
本发明涉及生命物质的检测，尤其涉及对生命特征物质的检测。
背景技术：
一方面，呼吸道疾病由RNA (核糖核酸)病毒、DNA (脱氧核糖核酸)病毒或细菌引起。确定病原体种类对选择针对性药物至关重要。由于标本中病原体核酸量少，需要用模板扩增如PCR (聚合酶链反应)或信号放大如bDNA技术(枝链核酸信号放大技术)来进行检测。PCR是最常用于诊断的方法。不过，由于PCR应用过程中的一些缺陷，如非线性扩增、假阳性以及实时PCR检测时的高成本，其不是应用的最理想的方式。呼吸道疾病的诊断可选择性的通过模板扩增来达到，但模板扩增后，通常需要杂交过夜检测，这样对于临床就不是一个很合适的方法。另一方面，中国专利CN101792800A所公开的一种多生物素信号放大方法，通过一多生物素分子的连接对待检测信号进行放大以提升核酸检测的灵敏度，该多生物素分子包括通过杂交识别连接物分子的单链核酸分子和用于生物素标记的载体分子。从而一个靶分子可以与连接分子、载体分子和多个生物素以及相应的标记物连接而使检测的信号得到放大。在靶分子的不同区域连接上多个连接物分子，可获得更大的放大效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述现有技术的不足而提出一种成本低、数据更可靠并且敏感性和检测时间与PCR方法类似的放大方法。本发明解决上述技术问题采用的技术方案是，设计制造一种模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法，其包括步骤有核酸分离，从标本中分离核酸；T7 RNA聚合酶线性扩增，得到RNA产物；以及，将线性扩增的RNA产物捕获到微孔板上，进行信号放大。在本发明中，对于该核酸是DNA的情况，在线性扩增之前还包括在加入转录酶之前采用加热或NaOH/HCl进行变性；与第一条引物退火后，DNA聚合酶可用于第一链和第二链的合成一带有一设定启动子的dsDNA (双链DNA)。在本发明中，对于该核酸是RNA的情况，在线性扩增之前还包括将该RNA转化为 dsDNA的过程。将该RNA转化为dsDNA的过程包括以带有一设定启动子的引物用反转录酶AMV (来自禽成纤维病毒逆转录酶)或MMLV (来自鼠白血病逆转录酶)将该RNA转变成cDNA (complementary DNA，互补 DNA)，再用 RNase H (RNA 酶 H)处理，使 RNA/DNA 变成单链的 cDNA，在DNA聚合酶和第二条引物作用下，以合成该dsDNA。将该RNA转化为dsDNA的过程包括以带有一设定启动子的引物用反转录酶AMV 或MMLV将该RNA转变成cDNA ；该cDNA通过92度加热变性，与第二条引物退火后，用DNA聚合酶制备该dsDNA。
将该RNA转化为dsDNA的过程包括以带有一设定启动子的引物用反转录酶AMV 或MMLV将该RNA转变成cDNA ；该cDNA通过92度加热变性，与第二条引物退火后，通过PCR 的一个循环以合成该dsDNA。将该RNA转化为dsDNA的过程包括通过一设定启动子制备dsDNA是采用NASBA (nucleic acid sequence based amplification，基于核酸序列的扩增技术)描述的步骤， 其具体包括AMV反转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶与二条引物一起加入，其中一条引物带有T7启动子。该设定启动子为T7、T3或SP6启动子，或者T7、Τ3或SP6 RNA聚合酶。在本发明中，该信号放大的过程具体包括通过一多生物素分子的连接对该RNA 产物进行放大，该多生物素分子包括通过杂交识别连接物分子的单链DNA分子和用于生物素标记的载体分子。该载体分子上的生物素为通过酶反应或化学反应杂交标记的生物素。同现有技术相比，本发明的模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法，成本低、数据更可靠并且敏感性和检测时间与PCR方法类似。
具体实施例方式以下结合各附图
所示之最佳实施例作进一步详述。本发明的模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法，是一种结合Τ7扩增和多生物素信号放大(MBSA)的双扩增方法。其中，靶核酸先由Τ7线性扩增，扩增产物通过 MBSA分析。与PCR不同，Τ7 RNA线性扩增不改变核酸模板的比例，其扩增的终产物是单链的RNA，RNA再用MBSA定量检测。MBSA是一种高敏的检测方法，通过杂交过夜，其可以检测到100个靶分子。但是靶通过T7RNA聚合酶扩增后，杂交就可缩短在2小时以内。该双重放大方法，包括的步骤有 1、核酸分离
从标本中分离核酸。无论RNA还是DNA，用商品化的核酸分离试剂盒，如核酸抽提用 NucliSens Extractor(BioMerieux, Boxtel, The Netherland)。2、T7 扩增
如果模板是RNA的话，有许多方法可用来转化，在T7RNA扩增前使之成为dsDNA。Α、以带有T7启动子的引物用反转录酶AMV或MMLV将RNA转变成cDNA，再用RNase H处理，使RNA/DNA变成单链的cDNA，在DNA聚合酶和第二条引物作用下，其可做为合成 dsDNA的模板。B、cDNA通过92C加热变性，与第二条引物退火后，用DNA聚合酶制备dsDNA，也可通过PCR的一个循环达到。C、第三种方法，通过T7启动子制备dsDNA是用NASBA描述的方法步骤。在这个方法中，AMV反转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶与二条引物一起加入，其中一条引物带有T7
启动子。如果靶是DNA，在加入转录酶之前需要变性，变性可通过加热或NaOH/HCl ；与第一条引物退火后，DNA聚合酶可用于第一链和第二链的合成。带有T7启动子的dsDNA就可以在T7 RNA聚合酶作用下转录成RNA。
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上述的T7启动子或T7 RNA聚合酶可用其它启动子如T3和SP6以及T3和SP6 RNA聚合酶。3、信号放大
扩增的RNA产物捕获到微孔板上，用多生物素信号放大或其它信号放大方法检测。该信号放大的过程具体包括通过一多生物素分子的连接对该RNA产物进行放大，该多生物素分子包括通过杂交识别连接物分子的单链DNA分子和用于生物素标记的载体分子。该载体分子上的生物素为通过酶反应或化学反应杂交标记的生物素。本发明的模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法，与实时PCR相比，具有许多优点成本低，该方法不需要贵重仪器和昂贵的荧光探针；该方法在扩增中不会改变模板的比例，因而数据更可靠；敏感性和检测时间与PCR类似。以上，仅为本发明之较佳实施例，意在进一步说明本发明，而非对其进行限定。凡根据上述之文字和附图所公开的内容进行的简单的替换，都在本专利的权利要求保护范围之内。
权利要求
1.一种模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法，其特征在于，包括步骤有核酸分离，从标本中分离核酸；T7 RNA聚合酶线性扩增，得到RNA产物；以及，将线性扩增的RNA产物捕获到微孔板上，进行信号放大。
2.如权利要求1所述的双重放大方法，其特征在于，对于该核酸是DNA的情况，在线性扩增之前还包括在加入转录酶之前采用加热或NaOH/HCl进行变性；与第一条引物退火后，DNA聚合酶可用于第一链和第二链的合成一带有一设定启动子的dsDNA。
3.如权利要求1所述的双重放大方法，其特征在于，对于该核酸是RNA的情况，在线性扩增之前还包括将该RNA转化为dsDNA的过程。
4.如权利要求3所述的双重放大方法，其特征在于，将该RNA转化为dsDNA的过程包括以带有一设定启动子的引物用反转录酶AMV或MMLV将该RNA转变成cDNA，再用RNase H处理，使RNA/DNA变成单链的cDNA，在DNA聚合酶和第二条引物作用下，以合成该dsDNA。
5.如权利要求3所述的双重放大方法，其特征在于，将该RNA转化为dsDNA的过程包括以带有一设定启动子的引物用反转录酶AMV或MMLV将该RNA转变成cDNA ；该cDNA通过92度加热变性，与第二条引物退火后，用DNA聚合酶制备该dsDNA。
6.如权利要求3所述的双重放大方法，其特征在于，将该RNA转化为dsDNA的过程包括以带有一设定启动子的引物用反转录酶AMV或MMLV将该RNA转变成cDNA ；该cDNA通过92度加热变性，与第二条引物退火后，通过PCR的一个循环以合成该dsDNA。
7.如权利要求3所述的双重放大方法，其特征在于，将该RNA转化为dsDNA的过程包括通过一设定启动子制备dsDNA是采用NASBA描述的步骤，其具体包括AMV反转录酶、 RNase H和T7 RNA聚合酶与二条引物一起加入，其中一条引物带有T7启动子。
8.如权利要求2、4、5、6或7所述的双重放大方法，其特征在于，该设定启动子为T7、T3 或SP6启动子，或者Τ7、Τ3或SP6 RNA聚合酶。
9.如权利要求1所述的双重放大方法，其特征在于，该信号放大的过程具体包括通过一多生物素分子的连接对该RNA产物进行放大，该多生物素分子包括通过杂交识别连接物分子的单链DNA分子和用于生物素标记的载体分子。
10.如权利要求9所述的双重放大方法，其特征在于，该载体分子上的生物素为通过酶反应或化学反应杂交标记的生物素。
全文摘要
一种模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法，包括步骤有核酸分离，从标本中分离核酸；T7RNA聚合酶线性扩增，得到RNA产物；以及，将线性扩增的RNA产物捕获到微孔板上，进行信号放大。成本低、数据更可靠并且敏感性和检测时间与PCR方法类似。
文档编号C12Q1/68GK102485906SQ201010572588
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者姜昕, 李先强 申请人:武汉中帜生物科技有限公司