一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法
【专利摘要】一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法，以甘蔗幼叶切片作外植体，接种到MS精胺Spm.2.5mg·L-1、pH 5.8-6.0的固体培养基，培养20d诱导并获得甘蔗愈伤组织团块；在不做任何变动的情况下，再继续培养15d和20d，陆续有形态各异的胚状体发生；或者将上述已培养20d并诱导出愈伤组织的团块转移到新鲜的原培养基再培养10d和15d，即有大量胚状体发生。本发明用于甘蔗胚状体的诱导速度快，效率高，品质好；所得胚状体容易继续再分化出根、叶器官和完整再生植株，总体效果既优于用2,4-D诱导甘蔗胚状体的传统技术，也优于用LFS诱导甘蔗胚状体的新技术，生产成本更低。
【专利说明】一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属植物生物技术的组织培养【技术领域】，尤其是一种用精胺诱导甘蔗胚状体 的方法。 技术背景
[0002] "胚状体"是由愈伤组织中的部分薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接再分化形成 具有胚的功能的结构，也叫做"体细胞胚"或"体胚"，以区别于"合子胚"。"胚状体"在生产 上可以直接用于制造人工种子和生产再生植株（试管苗）；在理论研究上，是探索细胞分 化、器官建成、个体发育，及其相关的解剖学和生理生化变化过程的重要材料。因此，如何 获得胚状体是植物学界关心的热门【技术领域】之一。对于甘蔗胚状体的研究已有一些报导， 但是诱导剂都是使用2, 4-D(2, 4-二氯苯氧乙酸），在获得愈伤组织之后，再转移到较低浓 度2, 4-D、甚至不含2, 4-D的培养基中，以减少2, 4-D对培养材料的毒害导致胚状体诱导的 失败。即使如此，诱导率也仅有10%左右【甘蔗体细胞培养中的胚状体发生[J].植物生理 学报曾吉恕1979,5(4) :411-416】；【甘蔗幼叶切段培养中的体细胞胚胎发生[J]广西植物 李春瑶等，1989, 9(3) :243-246】。还有人再复配6-BA(N6-苄基腺嘌呤）、NAA(萘乙酸）或 乳蛋白，把诱导率提高到30%-50%【激素对甘蔗心叶胚状体发生的影响[J]吉林师范大 学学报（自然科学版）孙颖2004,8(3) :93-94】。李松和许鸿源等曾用LFS(灵发素，代号 PGR-08)把甘蔗胚状体的诱导率提高到90%以上【一种用灵发素诱导甘蔗胚状体的方法中 国专利ZL201010216154. 6】。遗憾的是，灵发素在国内没有厂家生产，进口价格十分昂贵，导 致应用受到极大限制。精胺（Spermine,，Spm.)是多胺的一种，普遍存在于高等植物界，是 纯天然的植物生长调节物质【多胺是植物生长发育的调节物[J]植物生理学通讯，潘瑞炽 1985(6) :63-68】，而且价格低廉，易于在科学研究和规模化生产中推广应用。人们对其促进 植物生长、延缓衰老、增强抗逆能力，等生理活性的研究，已经有不少报导。但是，还未能检 索到精胺用于诱导甘蔗胚状体的研究资料。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法。
[0004] 本发明以如下技术方案解决上述技术问题：
[0005] -种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法，包括如下步骤：
[0006] 以常规方法获得的甘蔗幼叶切片作外植体，常规消毒后，接种到MS+精胺 (Spm.) 2. 5mg ? I71 (该浓度为优选后的适宜浓度），pH 5. 8-6. 0的固体培养基，在常规培养 条件下培养20d诱导并获得甘蔗愈伤组织团块。
[0007] 将上述愈伤组织团块在不做任何变动的情况下，再继续培养15d和20d，总计培养 时间分别达到35d和40d。陆续有形态各异的胚状体发生。
[0008] 或者将上述已经培养20d并诱导出愈伤组织的团块小心转移到新鲜的原培养基， 尽量避免伤损培养物，每瓶4-5团培养物，每批试验不少于6瓶。在常规培养条件下再培养 IOd和15d，总计培养时间分别达到30d和35d。即有大量胚状体发生。胚状体的发生速度 更快，总数更多。
[0009] 本发明的突出优点是：
[0010] 本发明用于甘蔗胚状体的诱导，速度快，效率高，品质好。所得胚状体容易继续再 分化出根、叶器官和完整再生植株，总体效果既优于用2, 4-D诱导甘蔗胚状体的传统技术， 也优于用LFS诱导甘蔗胚状体的新技术，生产成本更低。
【具体实施方式】
[0011] 以下通过实施案例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0012] 本发明所述用精胺诱导甘蔗胚状体的方法包括以下步骤：
[0013] 依常规方法剥取甘蔗末梢靠内部的蛋黄色幼叶，分切成大约0. 5cmX0. 5cm的切 片，接种到含有Spm. 2. 5mg吨41 (该浓度为优选后的适宜浓度）的改良型MS固体培养基中， 每批试验不少于10瓶，每瓶4-5片。在常规培养条件下培养20d诱导并获得甘蔗愈伤组织 团块。在不做任何变动的情况下，继续培养15d和20d，总计培养时间分别达到35d和40d。 陆续有形态各异的胚状体发生。
[0014] 或者将上述已经培养20d并诱导出愈伤组织的团块小心转移到新鲜的原培养基， 尽量避免伤损培养物，每瓶4-5团培养物，每批试验不少于6瓶。在常规培养条件下再培养 IOd和15d，总计培养时间分别达到30d和35d，即有大量胚状体发生，胚状体的发生速度更 快，效率更高，成本更低。
[0015] 在附表中，例1-4为在MS+Spm. 2. 5mg ? I71培养基上，不同培养时间和2种不同培 养程序，对诱导甘蔗胚状体的结果。各案例所用外植体材料、培养基及培养条件皆相同。 [0016]表1.用精胺诱导甘蔗胚状体的实施案例
[0017]
【权利要求】
1. 一种用精胺诱导甘蔗胚状体的方法，其特征是其步骤为： ⑴以常规方法获得的甘蔗幼叶切片作外植体，常规消毒后，接种到MS+精胺 Spm. 2. 5mg ? L'pH 5. 8-6. 0的固体培养基，在常规培养条件下培养20d诱导并获得甘蔗愈 伤组织团块； ⑵将上述愈伤组织团块在不做任何变动的情况下，再继续培养15d和20d，总计培养时 间分别达到35d和40d，陆续有形态各异的胚状体发生； 或者将上述已经培养20d并诱导出愈伤组织的团块小心转移到新鲜的原培养基，尽量 避免伤损培养物，每瓶4-5团培养物，每批试验不少于6瓶；在常规培养条件下再培养10d 和15d，总计培养时间分别达到30d和35d ;即有大量胚状体发生；胚状体的发生速度更快， 总数更多。
【文档编号】A01H4/00GK104351058SQ201410679435
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】许鸿源, 周凤珏, 蓝桃菊, 龚银花, 梁琼月, 许皓翔 申请人:广西大学