一种酰胺化重组多肽及其制备方法

专利名称：一种酰胺化重组多肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种包含至少一种编码α-酰胺化酶的核酸序列以及待酰胺化的目标多肽的核酸序列之核酸构建体，本发明进一步涉及含有所述核酸构建体的表达载体、原核宿主细胞。本发明还涉及通过利用所述核酸构建体在原核宿主中表达，制备酰胺化重组多肽，尤其是酰胺化重组降钙素的方法。
众所周知，在神经和内分泌系统产生的具有生物学活性的多肽中，大多数其C末端需要被酰胺化，而且C末端α-酰胺基对多肽的生物活性至关重要，其可能延长多肽的半衰期或增强多肽与受体的亲和力(Fuhlendorff，J.等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，87182-186)。C端的α-酰胺基来自多肽前体的翻译后加工，由α-酰胺化酶(以下简称为α-AE，又称为肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM))催化，该反应是活性多肽生物合成过程中的限速步骤。属于这一类活性多肽的例子有降钙素、催产素、加压素、促皮质释放激素、促甲状腺释放激素、神经激肽、咽侧体抑制素、Lem-KI、红色素浓缩激素、促黄体激素释放激素、白细胞焦激肽、胃泌素、色素分散激素、皮啡肽、铃蟾肽、胃泌素释放肽、神经调节肽、胰抑制素、芋螺毒素M1、胰抑素、蜂毒肽、麻蝇毒素1A、VIP、α-MSH、MIF-1等，其C-末端的酰胺化对其生物活性至关重要。
现在已能利用重组DNA技术在原核生物中生产具有临床和商业使用价值的蛋白质和多肽，由于原核生物表达体系没有α-AE，因此不能用于生产酰胺化多肽，但可生产C-末端带有Gly的活性多肽前体。为了对这类重组活性多肽之前体进行酰胺化，目前一般采用下列方法1)利用从天然来源的动物组织中获得的α-AE体外催化多肽前体进行酰胺化
Engels，J.W.等(核苷与核苷酸(Nucleosides & Nucleotides)6185-195)将人生长激素释放因子前体(hGHCF-Gly)的基因在大肠杆菌中表达形成包涵体，经过一系列纯化步骤后得到hGHCF-Gly，同时从天然来源的牛垂体中分离纯化α-AE，利用纯化的α-AE催化hGHCF-Gly的体外酰胺化。由于天然来源的动物组织中α-AE含量很低，分离纯化困难，这种方法难以扩大用于活性多肽的商业化生产。2)利用基因工程方法获得的α-AE体外催化多肽前体进行酰胺化Ray等(Bio/Technology，1164-70)用CHO细胞分泌表达大鼠α-AE，经疏水层析和离子交换层析初步纯化后，利用纯化的α-AE催化大肠杆菌表达的鲑鱼降钙素前体(sCT-Gly)的体外酰胺化，反应的质量比(酰胺化产物的质量/酶的质量)能达到1000以上，可以用于鲑鱼降钙素的大规模生产。但是sCT-Gly和α-AE在两个不同的表达体系中分别表达，需要将所述酰胺化酶及目标多肽分别纯化后才能进行酰胺化反应，酰胺化反应完成后还需要将酰胺化的降钙素(sCT)进一步纯化，步骤繁多，工艺复杂，收率低，成本高。
李元等人在中国专利96105118.3中公开了用重组DNA技术在浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)中分泌表达鲑鱼降钙素的前体(sCT-Gly)的方法，然而该技术不能直接产生酰胺化的鲑鱼降钙素。
目前也有在真核宿主表达体系中成功制备酰胺化多肽的报道，Takahashi等(肽(Peptides)，18(3)439-44)公开了在COS-7和CHO细胞系中表达具有生物活性的酰胺化鲑鱼降钙素的方法。由于真核表达体系存在培养成本较高，对生产条件要求严格，且从培养液中回收目标多肽困难等方面的问题，不适于大规模工业生产。
目前临床上广泛使用的生物学活性依赖于酰胺化的多肽主要有降钙素、催产素、加压素等。随着具有潜在临床和商业使用价值的其它需要酰胺化的多肽日益增多，迫切要求一种更为经济、有效的多肽酰胺化技术。为了简化工艺步骤、降低成本，本发明设计了一种核酸构建体，所述核酸构建体至少含有一种编码酰胺化酶的核酸序列和编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列。通过基因工程方法将含有该核酸构建体的表达载体转化特定原核宿主，经表达可直接获得酰胺化的、具有生物活性的目标多肽。
本发明的一个方面涉及包含至少一种编码酰胺化酶的核酸序列和编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列之核酸构建体。
本发明另一个方面涉及含有所述核酸构建体的表达载体。本发明另一个方面涉及含有所述表达载体的宿主细胞。本发明还涉及所述表达载体和宿主细胞的制备方法。
本发明又一方面涉及通过在所得适当表达宿主中表达所述核酸构建体编码的目标多肽，制备酰胺化重组多肽的方法。
本发明的又一方面还涉及利用分别带有编码酰胺化酶的核酸序列以及编码待酰胺化的目标多肽不同的相容性表达载体，共转化同一原核宿主，制备酰胺化目标多肽的方法。
本发明的又一方面还涉及利用分别经编码酰胺化酶的核酸序列的表达载体以及编码待酰胺化的目标多肽的表达载体转化的原核宿主进行共培养，制备酰胺化目标多肽的方法。
为了获得具有生物活性的酰胺化多肽，本发明制备了一种包括至少一种编码α-酰胺化酶的核酸序列和编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列之核酸构建体。1.编码α-酰胺化酶的核酸序列本领域技术人员知晓，本发明中所用的α-酰胺化酶可来自多种来源，包括但不限于如猪、牛、小鼠、大鼠、蟾蜍等来源的α-酰胺化酶。α-酰胺化酶的选择一般取决于所要酰胺化的目标多肽以及采用的表达宿主。在本发明的一个优选实施方案中，所述α-酰胺化酶来自于大鼠的心房组织。在一个优选实施方案中，编码所述α-酰胺化酶的核酸序列如SEQ ID NO1所示。
如本领域技术人员知晓，由于α-酰胺化酶mRNA的多样性，在不同来源的生物甚至是同一生物的不同组织中存在多种形式的α-酰胺化酶。因此，本发明中所用的编码α-酰胺化酶之核酸序列可以由于密码子的简并性、mRNA的不同剪接形式的不同而具有多种形式。因此，本发明也包括编码具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述核酸序列可由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO1不同。本发明还包括编码这样一种α-酰胺化酶的核酸序列，其与SEQ IDNO1的核酸序列有一定程度的同源性，同源性至少约为80％、优选地约85％、更优选地约90％、甚至更优选地约95％、最优选地约97％。对于本发明而言，可通过Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美国国家科学院院报80726-730)，利用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，应用同一性表和所选多重对比参数测定两种核酸序列间同一性的程度。本发明也包括编码一种α-酰胺化酶的核酸序列，其在低度严格条件下、更优选地中度严格条件下、甚至更优选地高度严格条件下、最优选地极高严格条件下可与如此处所述的SEQ ID NO1的核酸序列或其互补链、或其等位变体及其亚序列杂交(Sambrook等人，1989，出处同上)。此处所述的“严格条件”对于长度至少为100的核苷酸，低度到极高度严格条件分别被定义为按照标准Southern印迹程序，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并变性的鲑精DNA和对于低度、中度、高度和极高度严格性分别为25％、35％或50％的甲酰胺中，42℃预杂交和杂交。对于长度至少为100的核苷酸的长探针，最后用2×SSC、0.2％SDS将该载体物质洗涤3次，每次15分钟，洗涤温度优选地至少45℃(极低严格性)，更优选地至少50℃(低严格性)，更优选地至少55℃(中严格性)，更优选地至少60℃(中-高度严格性)，甚至更优选地至少65℃(高严格性)，最优选地至少70℃(极高严格性)。对于长度为大约15个核苷酸到约70个的核苷酸，严格条件被定义为按照标准Southern印迹程序，在比按照Bolton和McCarthy(1962，美国国家科学院院报481390)计算的Tm低5℃-10℃的温度下，在每ml含0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA中预杂交、杂交和杂交后洗涤。对于长度为大约15个核苷酸到约70个的核苷酸，在比计算的Tm低5℃-10℃的温度下，将载体物质在6×SSC加0.1％SDS中洗一次15分钟，并用6×SSC洗两次，每次15分钟。2.α-酰胺化酶多肽由上述编码本发明的α-酰胺化酶之核酸序列可知，可用于本发明的α-酰胺化酶包括具有如SEQ ID NO1所述的氨基酸序列的α-酰胺化酶。本领域技术人员周知，可对所述多肽进行一个或多个氨基酸残基的保守性修饰，如插入、删除或替换，而基本上不会影响本发明α-酰胺化酶的生物学活性。因此，本发明还涉及上述α-酰胺化酶的变体、衍生物或其片段，其具有与SEQ ID NO2的氨基酸序列有一定程度同一性的氨基酸序列，至少约80％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％，甚至更优选地至少约95％，甚至最优选地至少约97％同一性多肽。在一个优选实施方案中，所述同一性多肽具有与SEQ ID NO2的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选地4个氨基酸、更优选地3个氨基酸、甚至更优选地2个氨基酸、最优选地1个氨基酸的氨基酸序列。对于本发明而言，通过Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，利用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)测定同一性。优选地，本发明的α-酰胺化酶多肽可为包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位变体；或其片段，只要该片段具有α-酰胺化酶活性。在一个更优选的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位变体；或其片段，只要该片段具有α-酰胺化酶活性。在一个更优选的实施方案中，本发明的α-酰胺化酶多肽由SEQ IDNO2的氨基酸序列组成。3.编码目标多肽的核苷酸序列及多肽的氨基酸序列本发明所述的待酰胺化的目标多肽涵盖多种多肽，这类多肽具有临床或医药用途，且其生物学活性均有赖于C-末端的酰胺化，包括但不限于降钙素、催产素、加压素、促皮质释放激素、促甲状腺释放激素、神经激肽、咽侧体抑制素、Lem-KI、红色素浓缩激素、促黄体激素释放激素、白细胞焦激肽、胃泌素、色素分散激素、皮啡肽、铃蟾肽、胃泌素释放肽、神经调节肽、胰抑制素、芋螺毒素M1、胰抑素、蜂毒肽、麻蝇毒素1A、VIP、α-MSH、MIF-1。本领域技术人员应理解，编码所述目标多肽的核苷酸序列可以为合成的、或天然来源的。只要所选目标多肽的C-末端具有与所用α-酰胺化酶发挥功能相适应的结构，从而可被α-酰胺化酶酰胺化。本领域技术人员还应知晓，待酰胺化的目标多肽的表达不应影响所选表达宿主的基本代谢、生理过程。在一个优选实施方案中，本发明所述目标多肽为降钙素，包括鲑鱼降钙素、鸡降钙素或猪降钙素。在一个优选实施方案中，本发明所述待酰胺化的目标多肽是鲑鱼降钙素。在又一个优选实施方案中，本发明所述待酰胺化的目标多肽是降钙素类似物、衍生物或其有等同的生物学活性的片段。在一个优选实施方案中，编码待酰胺化的鲑鱼降钙素的核苷酸序列含有SEQ ID NO3的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，待酰胺化的多肽是SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。4.核酸构建体如本发明所用，术语“核酸构建体”定义为单链或双链的核酸分子，其可为人工合成的或分离自天然存在的基因，或经修饰含有以自然界中不会存在的方式组合及并列的核酸片段。本发明所述核酸构建体可以为单链或双链的DNA或RNA分子。在一个优选实施方案中，本发明的核酸构建体包含至少一个编码α-酰胺化酶的核酸序列以及编码所述待酰胺化的目标多肽的核酸序列。本发明核酸构建体中所包含的编码α-酰胺化酶的核酸序列与编码所述待酰胺化的目标多肽的核酸序列在核酸构建体中的相互位置关系可以有多种情况，两种编码核酸序列可以位于同一核苷酸链上，也可以分别位于两条核苷酸链上。当两种核酸序列位于同一核苷酸链上时，二者可以相邻或不相邻，串联或不串联，且可以具有相同或不同的转录方向，只要所述α-酰胺化酶经表达后可以将待酰胺化的目标多肽酰胺化。此外，本发明中所述的两种核酸序列二者可各自独立地含有表达所需的控制序列，所述控制序列可以相同或不相同。所选控制序列主要取决于所控制的编码目标蛋白质之核苷酸序列以及采用的表达宿主。本领域普通技术人员知晓，可使用任何可在所选表达宿主中有效控制目标多肽表达的控制序列。另外，本发明构建体中还可分别包括一个或多个拷贝的本发明中所述的两种核酸序列。用于调节所述核酸序列表达的控制序列可位于核酸序列的5’末端或3’末端的任意一侧，优选地位于待表达的核酸序列之5’侧，只要该控制序列可有效地控制目的蛋白质的表达。在本发明的一个优选实施方案中，所用的控制序列分别为来自melC1基因的分泌信号肽编码序列及其上游序列。
如需要，核酸构建体中还可含有一个或多个与表达所含目标多肽编码序列相关的其它控制序列。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸构建体分别在编码α-酰胺化酶的核酸序列以及编码降钙素前体的核酸序列的5’侧带有用于分泌表达的信号肽序列。在另一个优选实施方案中，本发明核酸构建体中位于两种核酸序列的多肽之5’侧的用于分泌表达的信号肽序列均来自melC1基因。本发明的核酸构建体，其可包括与本发明所述编码α-酰胺化酶的核酸序列以及编码待酰胺化的多肽的核酸序列有效连接地一种或多种调节序列，用以引导本发明的编码序列在适当宿主细胞中表达。应当理解，表达包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“编码序列”在此定义为直接针对其蛋白质产物的氨基酸序列部分的核酸序列。编码序列可包括但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
可以用多种方式将所述编码α-酰胺化酶的核酸序列以及编码待酰胺化的多肽的核酸序列插入到适当的表达载体中，如需要，在插入载体之前可对核酸序列进行加工或修饰，这取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰核酸序列的技术在本领域中众所周知。
在此将术语“控制序列”定义为包括为本发明多肽的表达所必需的或有利的所有组分。每种控制序列对于编码多肽的核酸序列而言可以是自身的或外源的。这类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。控制序列可具有接头，旨在引入特定的限制酶切位点，以便于控制序列与编码目标多肽的核酸序列的编码区相连接。术语“有效连接”在此定义为一种构型，其中一种控制序列被适当地置于与DNA序列编码序列相关的位置，使得该控制序列引导多肽的产生。
控制序列可以是一种适当的启动子序列，即为了核酸序列的表达而由宿主细胞识别的一种核酸序列。启动子序列中含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并可从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。
在采用细菌表达宿主细胞的情况中，引导本发明的核酸构建体转录的适当启动子的实例是从下列基因中获得的启动子浅青紫链霉菌的β半乳糖苷酶基因、长孢链霉菌(Streptomyces longisporus)的丝氨酸蛋白酶抑制剂STI-II基因、弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)的氨基糖苷磷酸转移酶(aph)基因、刺糖链霉菌(Streptomyces erythraeus)的红霉素抗性基因(ermE)和唐德链霉菌(Streptomyces tendae)的α-淀粉酶抑制剂(tendamistat)基因的启动子，以及浅青紫链霉菌中tipA基因的可被硫链丝菌素诱导的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xyl A和xyl B基因、大肠杆菌lac操纵子、原核生物的β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院院报753727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报8021-25)。在《科学美国人》(Scientific American)，1980，24274-94中的“来源于重组细菌的有用蛋白质”；和Sambrook等人，1989，同上中描述了更多的启动子。对于链霉菌属的宿主中可用的启动子还包括但不限于aphD，tsr，ermE，ermE-up，ssi，vsi，STI-II，β-gal，vph，tipA等。
控制序列也可以是适当的转录终止序列，即由宿主细胞识别而终止转录的一种序列。终止序列与编码多肽的核酸序列的3′端有效连接。在所选宿主细胞中有功能的任何终止子均可用于本发明。
控制序列也可以是合适的前导序列，即对于宿主细胞翻译至关重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5′端有效连接。在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列均可用于本发明。
控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基端相连接的氨基酸序列，该氨基酸序列能引导编码的多肽进入细胞的分泌途径。核酸序列编码序列的5′端可固有地含有一种信号肽编码区，该编码区与编码分泌多肽的编码区片段在翻译读框内天然连接。此外，编码序列的5′端可含有一种对于编码序列为外源的信号肽编码区。当编码序列不是正常地含有信号肽编码区时，可能需要外源的信号肽编码区。此外，外源信号肽编码区可简单地替换天然信号肽编码区以获得增强的多肽分泌。然而，能引导表达的多肽进入所选宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区均可用于本发明。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是例如在链霉菌宿主中有效的唐德链霉菌的α-淀粉酶抑制剂基因、长孢链霉菌丝氨酸蛋白酶抑制剂STI-II基因、α-淀粉酶基因、葡激酶基因、β-半乳糖苷酶基因以及酪蛋白酶melC1基因的信号肽、从芽孢杆菌NCIB 11837的产麦芽淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)或枯草芽孢杆菌prsA基因中获得的信号肽编码区。Simonen和Palva，1993，微生物学综述(Microbiological Reviews)57109-137描述了更多的信号肽。
控制序列也可以是前肽编码区，其编码一种位于多肽氨基端的氨基酸序列。得到的多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或者有时称为酶原(zymogen))。多肽原通常无活性，通过从多肽原上催化或自催化地切割前肽可转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT)、酿酒酵母α-因子基因中获得。
加入能够调节与宿主细胞生长有关的多肽表达的调节序列也是所希望的。调节系统的实例是那些应答化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而引起基因表达被打开或关闭的调节系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统等。
构建体的调节序列可包含一种或多种启动子、增强子、负调节元件、转录结合位点或这些序列的组合。5.表达载体本发明另一个方面涉及含有所述核酸构建体的表达载体，其中优选地还含有启动子和转录及翻译终止信号等控制序列。上述多种核酸和控制序列可以有效连接在一起产生一种重组表达载体，该载体还优选地包含一种或多种适宜的限制酶切位点，以便于目的核酸序列在这些位点的插入或置换。此外，也可通过向合适的表达载体中插入核酸序列或含有该序列的核酸构建体来表达本发明的核酸序列。在构建表达载体中，应使编码序列位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列有效连接。
重组表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作并能导致核酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与待引入载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或闭合环状的质粒。
载体可以是自主复制性载体，即，作为一种染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可含有保证自复制的任何元件。另外，载体也可以是这样一种载体，当引入宿主细胞后，它整合到基因组中并与所整合的染色体一起复制。此外，也可使用一种载体或质粒或者两种或多种载体或质粒，它们一起含有被引入到宿主细胞基因组中的总DNA。
本发明的载体优选地含有一种或多种使转化细胞能得到方便筛选的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，其产物提供抗生素抗性、杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性等等。细菌选择性标记的实例是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或是赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记或用于链霉菌筛选的硫链丝菌素抗性。
本领域技术人员知晓，适当的表达载体的选择取决于待表达的目标多肽及所选原核宿主细胞。适用于本发明的表达载体包括但不限于pIJ101衍生质粒pIJ680，pGM16，pSGL1，或它们的衍生物，例如对于链霉菌属的表达宿主，可为带有强启动子aph的pIJ680，其它优选的表达载体参见Kieser等，链霉菌遗传学实践(PracticalStreptomyces Genetics，The John Innes Foundation，Norwich，2000)，例如pIJ486/487，pIJ702，pFD666；对于大肠杆菌宿主，优选的表达载体为pUR278，pEX2，pMR100，pKC30，pET-3a等，如Sambrook等人，分子克隆(第二版，1989，纽约Cold Spring Harbor LabortoryPress)中所述；对于芽孢杆菌表达宿主，优选的表达载体可以为例如pWVO1，pGA14等。
对于自主复制而言，载体可进一步含有使载体能在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，允许在链霉菌中复制的pIJ101、pJV1、pSG5、pSGL1的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。复制起点可以具有使其在宿主细胞内的作用变成温度敏感的突变(见例如，Ehrlich，1978，美国国家科学院院报751433)。
本领域技术人员周知可以将超过一个拷贝的本发明的目标核酸序列插入宿主细胞中来增强目的产物的产生。获得核酸序列拷贝数增加的方法包括，将该序列的至少另一个拷贝整合到宿主细胞基因组中，或者使核酸序列含有可扩增的选择性标记基因，通过在适当选择剂的存在下培养细胞，能筛选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、并因而含有另外拷贝的核酸序列的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法为本领域的技术人员所周知(Sambrook等人，出处同上)。6.宿主细胞本发明也涉及含有具有本发明的核酸构建体之重组表达载体的宿主细胞，其用于目标酰胺化多肽的重组生产。将含有本发明的核酸构建体之表达载体引入宿主细胞中，使载体作为染色体整合体或作为如前所述的自复制的染色体外载体而保持于其中。术语“宿主细胞”还包括由于复制期间发生突变而与亲代细胞不同的亲代细胞的任何子代。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
本发明中所用的宿主细胞可以是单细胞微生物，如原核生物。可用于本发明的有用的单细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性菌，包括但不限于链霉菌属的种类，例如，浅青紫链霉菌的菌株，包括例如浅青紫链霉菌1326、TK21、TK24、TK54、TK64，天蓝色链霉菌或鼠灰链霉菌，芽孢杆菌属的菌株，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或者是革兰氏阴性菌，如大肠杆菌和假单胞菌属的种类。在一个优选实施方案中，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌TK24。在另一个优选实施方案中，所用宿主细胞是浅青紫链霉菌TK54。
向细菌宿主细胞中引入重组表达载体的方法可以是例如原生质体转化(见，例如，Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学(MolecularGeneral Genetics)168111-115)、使用感受态细胞(见，例如，Young和Spizizin，1961，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志56209-221)、电穿孔法(见，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技术(Biotechniques)6742-751)或接合法(见，例如，Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志1695771-5278)。对于利用相容性质粒共转化同一原核表达宿主的方法可参见Sambrook等人，出处同上以及Hopwood，D.A.等人，链霉菌遗传操作(Genetic Manipulationof Streptomyces)，The John Innes Foundation，Norwich，1985中所述的方法。7.重组酰胺化多肽的制备方法本发明也涉及制备具有生物学活性的酰胺化多肽的方法，包括(a)在适当的条件下培养如上所述获得的带有重组表达载体的宿主细胞，产生含有目标酰胺化多肽的培养上清液；和(b)从培养上清液中回收该多肽。
在本发明的一个优选实施方案中，获得具有生物学活性的酰胺化重组降钙素方法包括(a)在有利于α-酰胺化酶以及降钙素产生的条件下培养链霉菌宿主细胞，其中该所述宿主细胞已经用含有如SEQ ID NO1和3所示的核苷酸序列或其变体的表达载体转化；以及(b)直接从培养上清液中回收酰胺化降钙素。
本发明的又一方面还涉及利用分别含有编码酰胺化酶的核酸序列的表达载体以及相容性的编码待酰胺化目标多肽的核酸序列之表达载体共转化同一原核宿主，例如链霉菌属、芽孢杆菌属或大肠杆菌的菌株，制备酰胺化目标多肽的方法。其中分别含有所述编码酰胺化酶的核酸序列以及编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列的表达载体是相容性的。此处所述的相容性是指不同质粒可以在同一宿主细胞中共存。判断是否为相容性质粒的实验属于本领域技术人员知识范围中。本发明中可选的用于表达目标酰胺化多肽的相容性质粒，对于链霉菌属的菌株而言，包括但不限于pIJ101及其衍生质粒和pSGL1及其衍生质粒，pIJ101及其衍生质粒和pJV1及其衍生质粒，pIJ101及其衍生质粒和pSG5及其衍生质粒；对于大肠杆菌属的菌株而言，包括但不限于pUC18及其衍生质粒和p15A及其衍生质粒，pUC18及其衍生质粒和pSC101及其衍生质粒。不同载体对宿主的转化可同时进行，或依次进行。本领域技术人员知晓，所选表达载体应当与所选表达宿主相适应。在本发明的又一优选实施方案中，获得具有生物学活性的酰胺化降钙素方法，包括(a)用含有编码酰胺化酶的核酸序列的表达质粒以及相容性的含有编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列之表达质粒共转化原核宿主细胞；(b)在有利于α-酰胺化酶以及目标多肽产生的条件下，培养所得原核宿主细胞；以及(c)从培养物中回收酰胺化目标多肽。
在本发明的又一优选实施方案中，获得具有生物学活性的酰胺化降钙素方法包括(a)在有利于α-酰胺化酶以及降钙素产生的条件下，混合培养由分别含有编码酰胺化酶的核酸序列以及编码待酰胺化目标多肽的核酸序列之不同表达载体转化的独立的链霉菌宿主细胞；以及(b)从共培养物中回收酰胺化降钙素。本发明中共培养的经分别转化的链霉菌宿主细胞可为如前面所列举的多种链霉菌表达宿主中任一种类型之一的相同类型或不同类型的菌株，只要所选表达宿主细胞在共培养过程中能有效产生酰胺化降钙素。
在本发明的酰胺化多肽产生方法中，用本领域公知的方法在适于多肽产生的营养培养基中和需氧培养条件下培养细胞。例如，可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培养细胞，在合适的培养基中和使多肽能表达和/或分离的条件下进行。用本领域公知的方法在含有适当量的碳源和氮源以及无机盐等的适当营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商处得到或根据公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所公开的)制备，也可参见Hopwood，D.A.等人，出处同上)中所述的那些适于链霉菌属的菌株生长的培养基。对于多肽分泌到发酵培养基中的情况，则可直接从发酵培养基中回收该多肽。在本发明中，所述适于在链霉菌表达宿主中进行α-酰胺化酶以及降钙素表达的条件基本上如Hopwood，D.A.等人，出处同上)中所述的方法中所述，采用如YEME培养基、TSB培养基、LB培养基，在20-37摄氏度，优选在22-30摄氏度，更优选在25-28摄氏度下于含有该培养基的摇瓶中和/或实验室规模的自动发酵罐中培养由上述所制备的链霉菌宿主。在所述条件下发酵进行大约30-200小时后，优选进行60-180小时后，更优选进行80-140小时后结束发酵。在发酵终点优选地通过监测发酵培养液中累积的酰胺化目标多肽的量以及监测表达宿主的生长状况决定。
在本发明的一个实施方案中，使用多种本领域公知的方法直接或间接地检测酰胺化降钙素及其生物活性。这些检测方法可包括HPLC、飞行质谱法、N-端氨基酸序列测定、放射免疫(RIA)或酶免疫(EIA)方法、体内血清钙水平测定等。
得到的酰胺化目标多肽可通过本领域公知的方法回收。例如，可用常规方法从营养培养基中回收多肽，这些方法包括但不局限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在本发明的一个实施方案中，采用离心除去培养液中表达宿主链霉菌的菌丝体，回收上清液。为保证所得目标多肽的活性，调节所得上清液的pH至适当的范围。经过硫酸铵沉淀得到酰胺化多肽。
本发明的多肽可用本领域公知的多种方法纯化，这些方法包括但不局限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(见，例如，《蛋白质纯化》(ProteinPurification)J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，纽约，1989)。在本发明的一个实施方案中，采用多步体积排阻层析方法进行纯化。8.发明的有益效果本发明通过基因工程方法，构建了一种含有至少一种编码α-AE和编码待酰胺化的目标多肽核酸序列的核酸构建体。在本发明的一个实施方案中，通过构建了含有编码大鼠α-AE(SEQ ID NO1)和鲑鱼降钙素前体(SEQ ID NO3)的核酸构建体，将所得核酸构建体经基因工程方法导入构建的表达载体pIJ-mel-AE/mel-sCT，用该表达载体转化浅青紫链霉菌TK54，得到重组菌株浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]，获得可以直接分泌产生酰胺化鲑鱼降钙素的基因工程菌。此外，本发明还通过共转化法，用相容性的分别具有α-酰胺化酶及鲑鱼降钙素前体编码序列之不同表达载体共转化同一链霉菌宿主细胞，得到重组菌株浅青紫链霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]。通过培养如上述所得的重组菌株，或者通过共培养分别由含有酰胺化酶表达载体及含有重组降钙素表达载体的链霉菌重组菌株浅青紫链霉菌[pMS680]和浅青紫链霉菌[pSGLN-mel-AE]，直接从发酵液中回收所得酰胺化鲑鱼降钙素，简化了获得酰胺化目标多肽的工艺步骤，提高了收率，从而大大降低了生产成本。
现结合下面的附图和具体实施例对本发明进行详细说明。


图1为分别带有控制序列的α-AE基因和鲑鱼降钙素前体基因的核酸构建体之示意图。
图2为含有核酸构建体的重组表达载体pIJ-mel-AE/mel-sCT的示意图。
图3为单独含有鲑鱼降钙素前体编码基因及控制序列的重组表达载体pMS680的示意图。
图4为单独含有α-AE编码基因及控制序列的重组表达载体pSGLN-mel-AE的示意图。
图5为酰胺化降钙素的高压液相色谱分析结果。图中本发明所得酰胺化鲑鱼降钙素的保留时间为16.61分钟，市售的酰胺化鲑鱼降钙素(Sigma公司，标准品)的保留时间为16.79分钟。两者的保留时间差异在测量的系统误差范围之内。
图6为酰胺化鲑鱼降钙素的飞行质谱分析结果。
BcllP25’TGCACTGCAGGCGCGGGCGGCGGGAAG 3’(SEQ IDNO6) PstI利用上述引物对P1和P2，以抗生链霉菌ATCC 10382的总DNA为模板，通过如下PCR反应扩增得到一个370bp的DNA片段以总体积50μl进行PCR反应，95℃变性10分钟后加Taq DNA聚合酶，按94℃变性1分钟，36℃退火1.5分钟，72℃延伸1.5分钟循环反应5次，然后再按94℃变性1分钟，42℃退火1分10秒，72℃延伸1.5分钟，循环反应25次，最后在72℃延伸10分钟。从聚丙烯酰胺凝胶电泳上回收所得PCR反应片段，经限制性内切酶PstI和BclI酶切，用T4连接酶连接，克隆入经Pst I和Bam HI酶切的pUC19的Pst I和Bam HI位点处，其中BamHI与BclI的酶切粘性末端互补，获得带有melC1分泌信号肽及其上游序列的重组质粒pUC19-mel，经ABI公司自动测序仪(仪器型号373A)测定该片段序列，表明扩增序列与文献报道的序列完全相符。2.带有melC1分泌信号肽及其上游序列的鲑鱼降钙素前体sCT-Gly编码序列(mel+sCT-Gly)之核酸构建体的制备利用基本上如中国专利96105118.3中所述的方法，通过PCR扩增，使用如下引物P35’TGCACTGCAGCAACCTCAGCACCTGT 3’(SEQ ID NO7)P45’GCGGATCCTACTAGCCCGGCGTACCACTTCCCG 3’(SEQID NO8)从鲑鱼DNA模板中扩增得到一个117个碱基对的DNA片段。将所得PCR产物经Pst I和Bam HI酶切后克隆于大肠杆菌质粒pUC19的相应酶切位点，获得重组质粒pUC19-sCT，经ABI公司自动测序仪(仪器型号373A)测定该片段序列，表明扩增序列与已知鲑鱼降钙素编码序列完全相符。
参照如中国专利96105118.3中所述的方法，将如上所得pUC19-sCT用PstI和BamHI酶切，前述制备的pUC19-mel用EcoRI和PstI酶切，与通过EcoRI和BamHI酶切的大肠杆菌质粒pUC19连接，得到带有melC1分泌信号肽及其上游序列的鲑鱼降钙素前体sCT-Gly编码序列(mel+sCT-Gly)的重组质粒pUC19-mel-sCT。3.带有melC1分泌信号肽及其上游序列的鲑鱼降钙素前体sCT-Gly编码序列(mel+sCT-Gly)的链霉菌表达质粒pMS680的制备利用Hopwood，D.A.等人，出处同上，中所述的PEG介导的原生质体转化方法，制备浅青紫链霉菌TK54的原生质体，参照中国专利96105118.3中所用的方法，将链霉菌质粒载体pIJ680用Sac I和Xba I双酶切得到的4.6kb的片段，同时将如上所得pUC19-mel-sCT用Sac I和Xba I双酶切得到的0.5kb的融合基因，连接后转化经处理成为原生质体的浅青紫链霉菌TK54，获得了具有硫链丝菌素抗性(50μg/ml)的转化子。提取转化子中的质粒进行酶切鉴定，结果表明转化子中含有带有melC1分泌信号肽及其上游序列的鲑鱼降钙素前体sCT-Gly编码序列(mel+sCT-Gly)的链霉菌表达质粒pMS680。在表达质粒pMS680中，融合基因处于新霉素磷酸转移酶基因(aph)的强启动子下游，除了利用本身的melC1的启动子外，还可利用aph的强启动子来表达鲑鱼降钙素。带有如上所述构建的重组表达质粒pMS680的重组浅青紫链霉菌菌株MS680已于1996年4月24日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏号CGMCC0262。实施例2带有melC1分泌信号肽编码序列及其上游序列的α-酰胺化酶编码序列(mel+α-AE)之核酸构建体的制备1.大鼠α-AE编码序列的制备利用本领域周知的酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从大鼠心房组织中提取总RNA(参照Chomczynski P等，分析生物化学(AnalBiochem.)，162156-159)。将大鼠心房组织(约1克)置于预冷的溶液D(GIT 4mol/L，柠檬酸钠25mmol/L，pH7.0，十二烷基肌氨酸钠0.5％，2-巯基乙醇0.1mol/L)中，冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，然后转移到离心管中，依次加入1ml 2mol/L NaAc(pH4.0)，10ml水饱和酚以及2ml氯仿-异戊醇(49∶1)，每加入一种成分之后都充分混匀，最后剧烈振摇10秒，冰浴冷却15分钟，4℃下12,000转/分离心20分钟，吸取水相并加入10ml异丙醇，-20℃沉淀1小时后，4℃下12,000转/分离心20分钟。将所得沉淀用3ml溶液D溶解，加入2倍体积的乙醇，-20℃沉淀1小时，4℃下12,000转/分离心20分钟，用80％乙醇洗涤两次，真空抽干，溶于DEPC处理过的双蒸水中，-70℃保存备用。
反转录采用GIBCO/BRL公司的SuperscriptTMPreamplificationSystem for First Strand cDNA Synthesis试剂盒。将如上述所得总RNA12μl(1-5μg)、20U RNasin和2μg随机六聚体引物，混匀后70-80℃变性10-20分钟，冰浴1分钟，再依次加入30U RNasin，2μl 10×缓冲液，1μl 10mmol/L dNTPs，2μl 0.1mmol/L DTT，1μl逆转录酶(200U)，20℃温浴10分钟后，42℃延伸50分钟，99℃加热6分钟，最后95℃加热5分钟终止反应，冰浴降温，加入1μl RNase H(2U)，37℃保温20分钟，得到逆转录产物，-20℃保存备用。
根据已知的大鼠α-AE之cDNA序列(Eipper BA等人，生物化学杂志，2674008-4015)和大鼠心房组织中成熟α-AE的氨基端序列，设计正向引物P3和反向引物P4。
P55’AGCCCACTTTCTGTCTTTAAG3’(SEQ ID NO9)P65’TCAAACTGACCGATGCTCCATT3’(SEQ ID NO10)以如上所得逆转录产物为模板进行PCR扩增。50μl反应体系中含有逆转录产物2-3μl，引物P3和P4分别为10pmol，dNTP各10nmol，1×PCR缓冲液(Mg++浓度为1mmol/L)，Taq聚合酶2U。置于PCR扩增仪(MJ Research，Inc.)按如下条件进行扩增94℃变性5分钟后进入循环反应，93℃变性40秒，59℃退火35秒，70℃延伸2.5分钟，15个循环；93℃变性40秒，59℃退火35秒，70℃延伸2分钟(每个循环后增加10秒)，20个循环；最后70℃延伸8.5分钟。通过PCR扩增得到2.1kb的编码α-AE的cDNA片段。将所得PCR扩增片段用T4 DNA聚合酶修平，克隆入SmaI酶切并经CIAP脱磷酸化的pUC18中，得到带有编码α-酰胺化酶的核苷酸序列之重组载体pUC18-AE，经ABI公司自动测序仪(仪器型号373A)测定目标片段，证明该DNA片段的序列与预期的α-AE编码基因完全相符。
用限制性酶DpnI切割所得的pUC18-AE，从低熔点琼脂糖凝胶中分离纯化2.02kb的DNA片段；类似地，用限制性酶PstI切割如上所述得到的pUC19-mel，用T4 DNA聚合酶修平，再用CIAP脱去5’磷酸基团。将上述两片段以3-5∶1的浓度比混合，加入T4 DNA连接酶按厂家推荐的条件进行连接。所用大肠杆菌JM109感受态细胞的制备、转化及质粒提取步骤均按Sambrook等人，出处同上，中所述方法进行。将上述连接产物转化至大肠杆菌JM109的感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB琼脂平板，37℃培养过夜，挑取菌落，提取其中的质粒进行酶切鉴定，根据酶切结果鉴定插入片段的大小和方向。选择具有期望大小和正确方向的插入片段，从而得到编码带有melC1分泌信号肽的α-AE片段的重组质粒pUC19-mel-AE。由于质粒pUC19-mel-AE中融合基因两侧可供利用的酶切位点不多，为了便于表达载体的构建，用SmaI/HindIII把上述编码melC1分泌信号肽及α-AE片段的融合基因从pUC19-mel-AE中切下来，并用Klenow补平，然后依类似于上面的连接条件，与SmaI切割并经CIAP脱磷酸化处理的pUC18连接，得到带有编码melC1分泌信号肽的α-酰胺化酶片段的重组质粒pUC18-mel-AE。实施例3含有mel+α-AE片段以及mel+sCT-Gly片段之核酸构建体的链霉菌表达载体的制备用XbaI酶切实施例1中所得表达质粒pMS680，与同一内切酶酶切并脱磷酸化处理的pUC18-mel-AE连接，转化大肠杆菌后筛选重组子，酶切鉴定重组质粒中插入片段的大小和方向，得到pUC18-mel-AE/MS680，在该质粒中melC1分泌信号肽编码序列及其上游序列与α-AE的融合基因插入sCT-Gly基因的下游，其转录方向与sCT-Gly基因一致。用EcoRI/HindIII酶切pUC18-mel-AE/MS680，分离纯化大片段，Klenow酶补平后加入T4 DNA连接酶连接，用于转化浅青紫链霉菌TK54，获得了具有硫链丝菌素抗性的转化子。提取转化子中的质粒进行酶切鉴定，结果表明转化子含有表达质粒pIJ-mel-AE/mel-sCT，将所得转化子命名为基因工程菌浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]。实施例4产生酰胺化降钙素的基因工程菌浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]的发酵培养及酰胺化降钙素的分离纯化1.基因工程菌浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]的发酵培养将如实施例3所述制备的基因工程菌浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]接种于下列发酵培养基中，其组分为葡萄糖5.5％，酪蛋白水解物3％，酵母提取物3％，微量元素3％(ZnCl2.7H2O 0.02％，FeSO4.H2O 0.1％，CuCl2.H2O 0.0025％，H3BO3.10H2O 0.00056％，MnSO4.7H2O 0.1％，CaCl2.H2O 0.01％，(NH4)6Mo7O24.4H2O0.001％)。28℃振荡培养35小时，再以10％的接种量接种于新鲜的同种培养基中，于28℃继续培养65小时左右。2.酰胺化降钙素的分离、纯化按上述条件培养工程菌65小时后，3000转/分离心12分钟，取上清液弃菌丝，进行大孔吸附树脂X5柱层析脱色(发酵液∶树脂(体积)＝1∶12.5)，收集流出液，进一步进行疏水柱层析(Phenyl SepharoseHigh Performance柱，流出液∶介质(体积)＝1∶25)，以50mM磷酸缓冲液(含1.5M(NH4)2SO4)进行洗脱。以实施例5中所述的EIA检测监视流出液中的酰胺化降钙素，合并含有酰胺化降钙素的级分，经截流分子量为1000的超滤膜利用Amicon(美国)超滤仪(操作条件参照仪器说明书)进行超滤，将所得级分浓缩并脱盐。超滤得到的样品经冷冻干燥，于-20℃保存备用。进而采用制备型高压液相色谱进行进一步纯化。制备柱为SupelcosilTMLC-308，25cm×10.0mm。流动相A乙腈，B0.05％ 三氟乙酸。流速2ml/分，梯度A10％-80％，B90％-20％，时间0分-60分，紫外检测波长220nm。以实施例5中所述的EIA检测监视流出液中的酰胺化降钙素，收集含有酰胺化降钙素的级分。实施例5酰胺化鲑鱼降钙素的检测及鉴定1.酰胺化鲑鱼降钙素的高压液相色谱分析采用分析型高压液相色谱分析检测酰胺化降钙素，所用分析柱为SupelcosilTMLC-308，5cm×2.6mm。流动相A乙腈，B0.05％三氟乙酸；流速1.15ml/分，梯度A5％-80％，B95％-20％；时间0分-50分，检测波长220nm。酰胺化鲑鱼降钙素标准品购自美国Sigma公司，图5是如实施例4所述制备的酰胺化鲑鱼降钙素的高压液相色谱分析图，结果显示，所得酰胺化鲑鱼降钙素与标准品保留时间一致，表明本发明基因工程菌株浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]可分泌表达酰胺化的鲑鱼降钙素。2.酰胺化鲑鱼降钙素的飞行质谱分析采用MALDI-TOF质谱法测定鲑鱼降钙素分子量。如实施例4所得酰胺化鲑鱼降钙素分子量经测定显示与Sigma公司标准品一致，分子量为3430.7。已知非酰胺化鲑鱼降钙素分子量为3492，这表明本发明的基因工程菌株浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]分泌表达鲑鱼降钙素为C端酰胺化的。图6是本发明所得酰胺化鲑鱼降钙素的飞行质谱分析结果。3.酰胺化鲑鱼降钙素的N端氨基酸序列分析采用ABI公司Procise 491型氨基酸自动分析仪进行酰胺化鲑鱼降钙素的N端氨基酸序列分析。由此对本发明所得基因工程鲑鱼降钙素N端15个氨基酸进行序列分析，其N端1-15位氨基酸依次为Cys，Ser，Asn，Leu，Ser，Thr，Cys，Val，Leu，Gly，Lys，Leu，Ser，Gln，Glu。结果表明本发明所得酰胺化鲑鱼降钙素与天然鲑鱼降钙素完全一致。4.酰胺化鲑鱼降钙素的生物活性测定A.采用酶免疫测定法(EIA)测定降钙素的体外活性酶免疫测定法用EIA检测试剂盒(购自美国PENISULALABORATORIES公司)，按照公司提供操作步骤进行。分别取50μl待测样品溶液和含不同浓度的鲑鱼降钙素(sCT)标准品溶液，加样至96孔酶标板的不同孔内(平板预先用蛋白A包被)，随后依次向每孔中加入25μl sCT的抗体和25μl生物素标记的sCT，于4℃放置过夜。室温下用检测试剂盒提供的缓冲液300μl/孔洗涤平板5次，然后于每样品孔加入链亲和素-辣根过氧化物酶试剂100μl，室温放置1小时，再以缓冲液300μl/孔洗涤平板5次，每样品孔加入100μl底物溶液(H2O2，TMB)，室温下放置1小时，向各孔分别加入100μl 2N盐酸以终止反应，于半小时内用酶标比色计450nm比色测定结果。采用如上方法检测实施例4中所得的酰胺化鲑鱼降钙素，实验结果显示，基因工程菌株浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]可分泌表达酰胺化鲑鱼降钙素，在培养至70-90小时时分泌量达到峰值。酰胺化降钙素在6个不同批次的发酵样本中的平均分泌表达水平为10.3mg/L。B.采用降低大鼠血清钙水平方法测定降钙素的体内活性已知鲑鱼降钙素的生理功能为降低血清中游离钙水平。本发明中降钙素体内活性实验按照英国药典98年版中所述的方法进行。实验动物为SD大鼠，雄性，体重158.9±9.2克，25只动物随机分为5组进行。钙液体试剂盒为北京中生生物工程高科技公司产品，采用OCPC方法(Ray Sarkar，BC和Chauhan，UPS，分析生物化学20155)测定血清中钙离子含量。待测样品及标准品分别以生理盐水溶解。实验大鼠给药前夜禁食，不限饮水，皮下注射药物1小时后，以3％戊巴比妥钠麻醉，取主动脉血，不抗凝，室温静置后取血清，采用OCPC法测定血清中的钙水平。采用如上所述方法测定实施例4所述获得的降钙素，结果表明本发明的基因工程菌株浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]分泌表达的基因工程鲑鱼降钙素比活＞4000IU/mg，与天然鲑鱼降钙素活性基本一致。鉴于未酰胺化鲑鱼降钙素活性低于200IU/mg，上述实验结果表明，本发明的基因工程菌株浅青紫链霉菌[pIJ-mel-AE/mel-sCT]所分泌的降钙素为酰胺化的鲑鱼降钙素。实施例6与表达质粒pMS680相容的带有melC1分泌信号肽编码序列及其上游序列的α-酰胺化酶编码序列(mel+α-AE)的表达质粒pSGLN-mel-AE的构建利用Hopwood等人，出处同上，中所述的方法从球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)C-1027(FERM BP-1299)中提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳及酶切鉴定确认所得质粒为pSGL1(李晓平和李元，中国抗生素杂志，1992，17(5)326-332)。
用Xba I酶切并脱磷酸化处理实施例2中所得pUC18-mel-AE，与如上述所得质粒pSGL1经Sal I/Xba I双酶切的大片段(约4.4kb)以及质粒pIJ680经Xho I/Xba I双酶切的小片段(新霉素抗性基因，约1.2kb)连接，其中XhoI与SalI的酶切粘性末端互补，连接产物转化大肠杆菌JM109，经重组子筛选，酶切鉴定重组质粒中插入片段的大小和方向，得到质粒pUC18-mel-AE/SGLN，用EcoRI/HindIII酶切pUC18-mel-AE/SGLN，分离纯化大片段，Klenow酶补平后加入T4DNA连接酶连接，用于转化浅青紫链霉菌TK54，按照类似实施例1的方法利用带有10μg/ml新霉素的培养基筛选具有新霉素抗性的转化子，得到能够表达大鼠α-酰胺化酶的重组浅青紫链霉菌[pSGLN-mel-AE]。提取转化子中的质粒进行酶切鉴定，结果表明转化子中确实含有α-AE的表达质粒pSGLN-mel-AE。实施例7用分别表达降钙素和酰胺化酶的相容性质粒pMS680和pSGLN-mel-AE共转化链霉菌制备原核重组表达菌株根据文献报道，pIJ101及其衍生质粒和pSGL1及其衍生质粒为相容性质粒(洪斌和李元，微生物学报，38(4)256-260)。按照类似于实施例1中所述的方法，将如上述实施例1和6中所得的重组表达质粒pMS680和pSGLN-mel-AE共转化浅青紫链霉菌TK54，利用带有50μg/ml硫链丝菌素和10μg/ml新霉素的培养平板，筛选同时具有硫链丝菌素和新霉素抗性的转化子。所得转化子即为在不同的相容性质粒上分别具有α-AE基因和鲑鱼降钙素前体基因的重组表达菌株浅青紫链霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]。实施例8重组表达菌株浅青紫链霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]的发酵培养及酰胺化降钙素的分离纯化1.重组表达菌株浅青紫链霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]的发酵培养将如实施例7所述制备的基因工程菌浅青紫链霉菌[pMS680+pSGLN-mel-AE]接种于如实施例4中所述发酵培养基中。28℃振荡培养35小时，再以10％的接种量接种于新鲜的同种培养基中，于28℃继续培养65小时左右。2.酰胺化降钙素的分离、纯化按上述条件培养该基因工程菌65小时后，3000转/分离心12分钟，取上清液弃菌丝，进行大孔吸附树脂X5柱层析脱色(发酵液∶树脂(体积)＝1∶12.5)，收集流出液，进一步进行疏水柱层析(Phenyl SepharoseHigh Performance柱，流出液∶介质(体积)＝1∶25)，以50mM磷酸缓冲液(含1.5M(NH4)2SO4)进行洗脱。以实施例5中所述的EIA检测监视流出液中的酰胺化降钙素，合并含有酰胺化降钙素的级分，经截流分子量为1000的超滤膜利用Amicon(美国)超滤仪(操作条件参照仪器说明书)进行超滤，将所得级分浓缩并脱盐。超滤得到的样品经冷冻干燥，于-20℃保存备用。进而采用制备型高压液相色谱进行进一步纯化。制备柱为SupelcosilTMLC-308，25cm×10.0mm。流动相A乙腈，B0.05％三氟乙酸。流速2ml/分，梯度A10％-80％，B90％-20％，时间0分-60分，紫外检测波长220nm。以实施例5中所述的EIA检测监视流出液中的酰胺化降钙素，收集含有酰胺化降钙素的级分。酰胺化降钙素在6个不同批次的发酵样本中的平均分泌表达水平为9.8mg/L。实施例9利用重组浅青紫链霉菌[pSGLN-mel-AE]和重组浅青紫链霉菌[pMS680]的共培养制备酰胺化降钙素按照实施例1中所述的方法，分别用pSGLN-mel-AE和pMS680转化浅青紫链霉菌TK24和TK54，利用带有50μg/ml硫链丝菌素和10μg/ml新霉素的培养平板，分别筛选具有硫链丝菌素和新霉素抗性的转化子，得到重组菌株浅青紫链霉菌TK24[pSGLN-mel-AE]和重组菌株浅青紫链霉菌TK54[pMS680]。参照实施例4中的发酵培养条件，分别于28℃培养浅青紫链霉菌TK24[pSGLN-mel-AE]和浅青紫链霉菌TK54[pMS680]的种子35小时，然后所得两种接种培养物以1∶1-5的体积比接种于如实施例4中所述的发酵培养基中，于28℃培养65小时。按照实施例5中所述的EIA检测方法测定共培养物中酰胺化降钙素的表达。待表达量达到最高值时，终止发酵，按照实施例4中所述的分离纯化方法，从共培养物中分离纯化所得酰胺化鲑鱼降钙素，在6个不同批次的发酵样本中的平均分泌表达水平为9.2mg/L。
序列表SEQ ID NO1编码大鼠酰胺化酶的核苷酸序列AGCCCACTTTCTGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACCAGATCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCAGATTTTGCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATACTTCTGCATGTCCATGCGTCTGCCTGTGGATGAGGAAGCCTTCGTGATTGACTTCAAGCCTCGTGCCAGCATGGATACTGTCCACCATATGCTGCTGTTTGGATGCAATATGCCCTCGTCCACTGGAAGTTACTGGTTTTGTGATGAAGGAACCTGTACAGATAAAGCCAATATTCTATATGCCTGGGCAAGGAATGCTCCCCCCACCCGGCTCCCGAAAGGTGTTGGATTCAGAGTTGGAGGAGAAACTGGAAGCAAATACTTCGTCCTTCAAGTTCACTATGGCGATATCAGTGCTTTTCGAGATAATCACAAAGACTGCTCTGGCGTGTCCGTACATCTCACACGTGTGCCCCAGCCTTTAATTGCGGGCATGTACCTTATGATGTCTGTTGACACTGTCATACCACCAGGAGAGAAAGTAGTGAATGCTGACATTTCGTGCCAATACAAAATGTATCCAATGCATGTGTTTGCCTACAGAGTCCACACTCACCATTTAGGTAAGGTGGTGAGCGGATACAGAGTAAGAAACGGACAGTGGACACTGATTGGACGCCAGAACCCCCAGCTGCCACAGGCTTTCTACCCTGTGGAACACCCCGTTGATGTTACTTTTGGTGATATACTGGCAGCCAGATGTGTGTTCACTGGTGAAGGGAGGACAGAGGCCACCCACATCGGCGGCACTTCTAGTGACGAAATGTGTAACCTGTACATCATGTATTACATGGAAGCCAAATATGCACTTTCCTTCATGACCTGTACAAAGAACGTGGCTCCAGATATGTTCAGAACTATCCCAGCAGAGGCCAATATCCCAATTCCTGTCAAACCGGACATGGTTATGATGCACGGGCATCACAAAGAAGCAGAAAACAAAGAAAAGAGTGCTTTAATGCAGCAGCCAAAACAGGGAGAGGAAGAAGTATTAGAGCAGGATTTCCATGTGGAAGAAGAACTGGACTGGCCTGGAGTGTACTTGTTACCAGGCCAGGTTTCTGGGGTGGCCCTGGATTCTAAGAATAACCTAGTGATTTTCCACAGAGGTGACCATGTTTGGGATGGAAACTCTTTTGACAGCAAGTTTGTTTACCAGCAAAGAGGTCTTGGGCCAATTGAAGAAGACACCATCCTGGTCATTGACCCAAATAATGCTGAAATCCTCCAGTCCAGTGGCAAGAACCTGTTTTATTTACCACACGGCTTGAGCATAGATACAGATGGAAATTATTGGGTCACAGATGTGGCTCTCCACCAGGTGTTCAAATTGGACCCGCATAGCAAAGAAGGCCCGCTCTTAATTCTGGGAAGGAGCATGCAACCTGGGAGTGACCAAAATCATTTCTGCCAGCCCACCGATGTGGCTGTGGAGCCCAGTACTGGAGCTGTCTTCGTGTCAGACGGTTACTGTAACAGTCGGATTGTGCAGTTTTCACCAAGCGGAAAGTTCGTCACCCAGTGGGGAGAAGAGTCCTCTGGAAGCAGTCCTAGGCCAGGCCATTTCAGTGTTCCTCACAGTTTGGCCCTTGTGCCTCATTTGGACCAGTTGTGTGTGGCAGACAGGGAAAATGGCCGAATCCAATGCTTCAAAACTGACACCAAAGAATTTGTGAGAGAGATTAAGCACGCATCATTTGGAAGGAATGTCTTTGCCATTTCATATATACCAGGTTTCCTCTTTGCCGTAAACGGGAAGCCTTACTTTGGAGACCAAGAGCCCGTGCAAGGATTTGTGATGAACTTTTCCAGTGGGGAAATTATAGACGTCTTCAAGCCAGTACGCAAGCACTTCGACATGCCTCATGATATTGTGGCTTCTGAAGATGGGACTGTGTACATTGGAGACGCACACACAAACACCGTGTGGAAGTTCACCCTGACTGAAAAAATGGAGCATCGGTCAGTCTGASEQ ID NO2大鼠酰胺化酶的氨基酸酸序列SPLSVFKRFKETTRSFSNECLGTIGPVTPLDASDFALDIRMPGVTPKESDTYFCMSMRLPVDEEAFVIDFKPRASMDTVHHMLLFGCNMPSSTGSYWFCDEGTCTDKANILYAWARNAPPTRLPKGVGFRVGGETGSKYFVLQVHYGDISAFRDNHKDCSGVSVHLTRVPQPLIAGMYLMMSVDTVIPPGEKVVNADISCQYKMYPMHVFAYRVHTHHLGKVVSGYRVRNGQWTLIGRQNPQLPQAFYPVEHPVDVTFGDILAARCVFTGEGRTEATHIGGTSSDEMCNLYIMYYMEAKYALSFMTCTKNVAPDMFRTIPAEANIPIPVKPDMVMMHGHHKEAENKEKSALMQQPKQGEEEVLEQDFHVEEELDWPGVYLLPGQVSGVALDSKNNLVIFHRGDHVWDGNSFDSKFVYQQRGLGPIEEDTILVIDPNNAEILQSSGKNLFYLPHGLSIDTDGNYWVTDVALHQVFKLDPHSKEGPLLILGRSMQPGSDQNHFCQPTDVAVEPSTGAVFVSDGYCNSRIVQFSPSGKFVTQWGEESSGSSPRPGQFSVPHSLALVPHLDQLCVADRENGRIQCFKTDTKEFVREIKHASFGRNVFAISYIPGFLFAVNGKPYFGDQEPVQGFVMNFSSGEIIDVFKPVRKHFDMPHDIVASEDGTVYIGDAHTNTVWKFTLTEKMEHRSVSEQ ID NO3编码鲑鱼降钙素前体的核苷酸序列5’TGC TCC AAC CTC AGC ACC TGT GTG CTG GGC AAA CTG TCC CAA GAG CTG CATAAA TTG CAG ACG TAC CCC CGC ACC AAC ACG GGA AGT GGC ACG CCT GGC 3’SEQ ID NO4鲑鱼降钙素的氨基酸酸序列Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro ArgThr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro GlySEQ ID NO5引物15’GCTGATCACGTCAGTTTTCG3’SEQ ID NO6引物25’TGCACTGCAGGCGCGGGCGGCGGGAAG3’SEQ ID NO7引物35’TGCACTGCAGCAACCTCAGCACCTGT3’SEQ ID NO8引物45’GCGGATCCTACTAGCCCGGCGTACCACTTCCCG3’SEQ ID NO9引物55’AGCCCACTTTCTGTCTTTAAG3’SEQ ID NO10引物65’TCAAACTGACCGATGCTCCATT3’
权利要求
1.一种核酸构建体，其中包括至少一种编码酰胺化酶的核酸序列和编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列。
2.权利要求1所述的核酸构建体，其中所述待酰胺化的目标多肽为降钙素、催产素、加压素、促皮质释放激素、促甲状腺释放激素、神经激肽、咽侧体抑制素、Lem-KI、红色素浓缩激素、促黄体激素释放激素、白细胞焦激肽、胃泌素、色素分散激素、皮啡肽、铃蟾肽、胃泌素释放肽、神经调节肽、胰抑制素、芋螺毒素M1、胰抑素、蜂毒肽、麻蝇毒素1A、VIP、α-MSH、MIF-1。
3.权利要求1所述的核酸构建体，其中所述目标多肽为鲑鱼降钙素。
4.权利要求1所述的核酸构建体，其中所述的酰胺化酶为大鼠α-酰胺化酶。
5.一种含有权利要求1所述的核酸构建体的重组表达载体，其中所述表达载体还含有表达控制序列，包括启动子、增强子、终止序列。
6.一种含有权利要求5所述表达载体的原核表达宿主，其选自链霉菌属、芽孢杆菌属的菌株以及大肠杆菌。
7.权利要求6所述原核表达宿主，其为浅青紫链霉菌TK54、TK24、TK21、TK64或1326。
8.权利要求7所述的原核表达宿主，其中所述表达载体为来源于pIJ101的质粒或者是来源于pSGL1的质粒。
9.权利要求8所述的原核表达宿主，其中所述重组表达质粒为pIJ-mel-AE/mel-sCT。
10.一种制备酰胺化多肽的方法，其包括(1)用带有权利要求1中所述的核酸构建体之重组表达载体转化适当的原核宿主；(2)在有利于α-酰胺化酶以及目标多肽产生的条件下培养所得的原核表达宿主细胞，(3)从培养物中回收酰胺化目标多肽。
11.权利要求10的方法，其中所述待酰胺化的目标多肽为鲑鱼降钙素。
12.权利要求10的方法，其中所述原核宿主为浅青紫链霉菌TK54、TK24、TK21、TK64或1326。
13.权利要求10的方法，其中所述重组表达宿主中含有pIJ-mel-AE/mel-sCT。
14.一种制备酰胺化多肽的方法，其包括(a)用含有编码酰胺化酶的核酸序列的表达质粒以及相容性的含有编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列之表达质粒共转化原核宿主细胞；(b)在有利于α-酰胺化酶以及目标多肽产生的条件下，培养所得原核表达宿主细胞；以及(c)从培养物中回收酰胺化目标多肽。
15.权利要求14的方法，其中所述待酰胺化的目标多肽为鲑鱼降钙素。
16.权利要求14的方法，其中所述原核宿主为浅青紫链霉菌TK54、TK24、TK21、TK64或1326。
17.权利要求14的方法，其中所述表达宿主含有pMS680及pSGLN-mel-AE。
18.一种制备酰胺化多肽的方法，其包括(a)分别用含有编码酰胺化酶的核酸序列的表达质粒以及含有编码待酰胺化的目标多肽的核酸序列之表达质粒转化两个独立的原核宿主细胞；(b)在有利于α-酰胺化酶以及目标多肽产生的条件下，共培养所得原核表达宿主细胞；以及(c)从培养物中回收酰胺化目标多肽。
19.权利要求18的方法，其中所述待酰胺化的目标多肽为鲑鱼降钙素。
20.权利要求18的方法，其中所述原核宿主各自独立地选自浅青紫链霉菌TK54、TK24、TK21、TK64或1326。
21.权利要求18的方法，其中所述两种表达宿主中分别含有pMS680或pSGLN-mel-AE。
全文摘要
本发明涉及一种包含至少一种编码α－酰胺化酶的核酸序列以及待酰胺化的目标多肽的核酸序列之核酸构建体,本发明进一步涉及含有所述核酸构建体的表达载体、原核宿主细胞。本发明还涉及通过利用所述核酸构建体在原核宿主中表达,制备酰胺化重组多肽,尤其是酰胺化重组鲑鱼降钙素的方法。
文档编号C12N15/63GK1370838SQ0110490
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月23日 优先权日2001年2月23日
发明者李元, 洪斌, 武兵元, 刘伯英, 郭连宏, 王醒, 姜蓉, 李宝义, 吴剑波 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所