专利名称：一种富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的开管毛细管柱及方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，是在利用质谱技术分析鉴定磷酸肽或磷酸化蛋白质之前，首 先对其进行选择性富集的一种方法，即一种利用功能化修饰的开管毛细管柱实现离线及在线 选择性富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法。
背景技术：
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰之一，对细胞的增殖、分化、信号转导、 细胞凋亡等生命过程具有重要的调控作用。近几年来，质谱(MS)已经广泛用于磷酸化蛋白 质的鉴定。由于细胞/组织内磷酸化蛋白质的化学计量值较低，以及质谱分析时非磷酸化肽段 对磷酸肽存在信号抑制，使得直接质谱分析磷酸化蛋白质或磷酸肽存在很大的困难。因此发 展高选择性的分离富集技术，对于磷酸化肽段的鉴定是十分必要的，可以促进磷酸肽的质谱 检测。
目前，最常用的富集磷酸肽的方法包括固相金属离子亲和色谱(IMAC)。在IMAC中， 利用磷酸肽的磷酸基与IMAC填料表面螯合的金属离子如F^+、 G^+等之间特异性的吸附作 用，使得磷酸肽被保留在固相化的金属螯合离子上。 一些金属氧化物如Ti02， Zr02， A1203 等也用于磷酸肽的富集。在最近的研究中，人们将磷酸锆(ZrP)基团修饰在多晶硅的表面， 用于磷酸化蛋白的富集分离，并结合基质辅助激光解析电离质谱技术(Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-MS)，取得了良好的富集效果[Houjiang Zhou, Songyun Xu, Mingliang Ye, Shun Feng, Chensong Pan, Xiaogang Jiang, Xin Li， Guanghui Han， Yu Fu, and Hanfa Zou. Zirconium phosphonate-modified porous silicon for highly specific capture of phosphopeptides and MALDI-TOF MS analysis(利用磷酸锆基团修饰的多晶硅高选择性富集磷 酸肽及基质辅助激光解析离子化质谱分析).J. Proteome Res， 2006， 5:2431-2437]。同样，在 聚甲基丙烯酸縮水甘油酯[poly(glycidyl methacrylate~co-ethylene dimethacrylate), GMA-EDMA] 珠子表面修饰ZrP基团，用于磷酸化蛋白富集分离的方法也见报道。由于ZrP基团与磷酸肽的 磷酸基团之间的强的配位作用，使得富集效果显著提高。但这些富集方法要么操作步骤非常 烦琐，同时处理多个样品困难。要么由于在离心管内手工操作，转移过程导致样品损失，一 次最多只能处理几个样品，无法满足蛋白组学大规模、高通量分析的要求。这些缺点限制了 其在大规模磷酸化蛋白质组分析中的进一步应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的开管毛细管柱，及选择性富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法。该方案的原理如下
制备一种功能化的开管毛细管柱，其内壁具有可选择性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质的功能基团。加样后可直接对磷酸肽或磷酸化蛋白质进行富集，再利用清洗缓冲液除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白质和盐，清洗完成后利用洗脱液对磷酸肽或磷酸化蛋白质进行洗脱，洗脱的磷酸肽或磷酸化蛋白质可在线或离线进行质谱分析。
发明使用的毛细管柱是一种功能化的开管毛细管柱，其内壁具有可选择性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质的功能基团。具体的说，是利用毛细管开管柱内表面的硅羟基与磷酸肽或磷酸
化蛋白质吸附材料化学连接的方式制得，该吸附材料优选的为磷酸锆(ZrP)。
为实现发明的目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤
(1) 制备功能性开管毛细管柱；
(2) 将样品注入到开管毛细管柱中，孵育以选择性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质；
(3) 将洗脱液注入开管毛细管柱，对磷酸肽或磷酸化蛋白质进行洗脱；
(4) 对洗脱后的磷酸肽或磷酸化蛋白质进行质谱分析。孵育吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质时，可采用连续注射形式或进样后静态孵育。为提高分析的准确性，在富集含盐生物样品时，在步骤(2)和(3)之间还应进行脱盐
操作。具体的说，是将清洗液注入开管毛细管柱，除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白质和盐。
进行质谱分析时可采用离线或在线方式。离线富集磷酸肽或磷酸化蛋白质时的洗脱液中
可加入基质进行点靶并在MALDI-TOF-MS上进行分析；为便于操作，离线富集磷酸肽或磷酸化蛋白质时可采用微量进样泵，并可以保证上样溶液、清洗溶液及洗脱溶液流速的稳定性。自动在线富集分析磷酸肽或磷酸化蛋白质时，可以将开管毛细管柱接在微升或纳升级毛细管高压液相色谱-质谱(LC-ESI-MS)的液相部分上，直接进行ESI-MS/MS分析，提高操作的自动化水平和样品的利用率。
本发明提供的技术方案具有以下优点
1、操作简便高效，适用范围广。本发明对磷酸肽或磷酸化蛋白质的富集是基于磷酸锆功能基团与磷酸肽或磷酸化蛋白质的磷酸基团之间的强的配位作用，因而具有很高的富集效率。操作上，既可以利用微量进样泵离线富集磷酸肽或磷酸化蛋白质，整个操作过程非常简单、方便；又可以接在微升或纳升级ESI-MS的液相部分上，实现自动在线富集分析磷酸肽或磷酸化蛋白质，大大提升其分析效率。在与质谱分析器的联用方面，既可以结合MALDI-MS分析，又可以结合ESI-MS/MS分析，满足不同的样品分析需求。
2、 成本低，易于重复使用。本发明所用开管毛细管柱制备简单，价廉易得，并可以制成不同类型规格的富集柱，满足不同的分析需求。对使用过的开管毛细管柱，可以通过注入含游离锆离子溶液的方式进行功能修复，从而延长其使用寿命。
3、 特别适用于大样本的处理。本发明所用开管毛细管柱可以一次批量处理多个样品。无论采用离线富集的方式，还是采用在线富集的方式，不同样品可以依次分别负载在开管毛细管柱上，孵育完成后通过依次清洗及洗脱，进而对洗脱下来的磷酸肽进行质谱分析。尤其当采用在线富集方式时，可以通过自动化的控制软件，轻松实现大批量样本的自动上样、清洗、洗脱及质谱分析，其分析效率远远高于目前常用的磷酸肽或磷酸化蛋白质富集方法。
4、 特别适用于复杂样品处理分析。本发明利用开管毛细管柱富集复杂样品中的磷酸肽或磷酸化蛋白质时，复杂样品前处理常用的一些组分不会被柱子保留，也不会干扰磷酸肽或磷酸化蛋白质的富集。整个过程不需要对样品进行脱盐前处理，极大地降低了样品损失，适合处理微量的样品，如二维凝胶电泳的胶内酶解肽段等。
图1是发明技术方案的流程图。(a)为未修饰的开管毛细管柱；(b)为修饰氨丙基的开管毛细管柱；(c)为修饰磷酸基团的开管毛细管柱；(d)为修饰磷酸锆基团的开管毛细管柱；(e)为磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱富集磷酸肽的示意；(f)为富集的磷酸肽被洗脱后的示意。l为上样操作，2为清洗操作，3为洗脱操作。
图2是a-酪蛋白质酶解产物的MALDI-TOF-MS图。(a)酶解产物不富集直接MS分析；(b)酶解产物利用磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱富集后MS分析。
图3是卩酪蛋白质酶解产物的MALDI-TOF-MS图。(a)酶解产物不富集直接MS分析；(b)酶解产物利用磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱富集后MS分析。
图4是a-酪蛋白质酶解产物利用磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱富集后的MALDI-TOF-MS图。(a)酶解产物溶液中不含尿素、SDS及氯化钠；(b)酶解产物溶液中含IM尿素；(c)酶解产物溶液中含1%SDS; (d)酶解产物溶液中含1M氯化钠。
图5是不同量的P-酪蛋白与牛血清白蛋白酶解产物混合物直接分析及利用磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱富集后的MALDI-TOF-MS图。(a) (5-酪蛋白:牛血清白蛋白，1:1，直接分析；(b) P-酪蛋白:牛血清白蛋白，1:1，富集后分析；(c) P-酪蛋白:牛血清白蛋白，1:10，直接分析；(d)P-酪蛋白:牛血清白蛋白，1:10，富集后分析；(e) P-酪蛋白:牛血清白蛋白，1:100，直接分析；(f) P-酪蛋白:牛血清白蛋白，1:100，富集后分析。
图6是30pL牛奶蛋白提取物酶切液利用磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱富集前后的MALDI-TOF-MS图。(a)富集前，(b)富集后。
图7是与纳升级LC-ESI-MS结合实现自动在线富集分析磷酸肽。
具体实施例方式
实施例1
将0.1MHC1溶液用微量进样泵推入毛细管柱，以lpL/min左右流速冲洗10min，然后将毛细管注满HC1溶液后用橡胶塞封住末端，常温静置30min。将HC1溶液推出，用水冲洗至流出液pH为7左右，将0.1M NaOH溶液注入毛细管，以lnL/min左右流速冲洗10min，然后将毛细管注满NaOH溶液后用橡胶塞封住末端，常温静置2h。将NaOH溶液推出，用水冲洗至流出液pH为7左右。
将10%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)甲醇溶液(Wv)推入毛细管中，密封毛细管两端，将毛细管浸入7(TC水浴中加热8h。然后将APES溶液推出，用20nL甲醇溶液冲洗毛细管，氮气吹干。
用注射器快速将P0Cl3溶液推入毛细管柱中，封住末端，常温反应12h。将POCl3溶液推出，用20pL甲醇溶液冲洗毛细管，氮气吹干。
称取lmg的ZrOCl2粉末，将其溶于lml水中，则ZrOCl2快速水解，充分振荡后，用注射器推入石英毛细管中，静置反应4h。将管中溶液推出，用纯水冲洗毛细管柱至流出液pH为7。
实施例2
将标准磷酸化蛋白质a-酪蛋白质的酶切液用50%ACN， 0.1%TFA溶液稀释至2pmol4iL后，用微量进样泵以0.2pL/min的流速推入磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱(内径50^im，长150cm)中，共进样20)aL。用50pL的50%ACN， 0.1TFAQ/。溶液及50pL纯水以1.0pL/min的流速先后冲洗毛细管柱内壁，以除去内壁上黏附的非磷酸肽及盐等杂质。用0.1M氨水溶液lOpL以0.2pL/min流速注入毛细管柱中洗脱被特异吸附的磷酸肽，将洗脱下的溶液点于MALDI-TOF靶上，自然风干后点上DHB溶液(50%ACN， 0.1%H3PO4)，待结晶后进行质谱分析。不富集时，有很多非磷酸肽出现，仅检测到7个磷酸肽，如图2a，而在利用磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱富集之后，大部分非磷酸肽被除去，检测到了 16个磷酸肽，如图2b所示。检测到的磷酸肽在图中进行了标记。
6实施例3
利用磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱负载|3酪蛋白质酶解产物，重复实施例2的操作进行富集、MALDI-TOF-MS分析。不富集时，信噪比很低，而富集后，大部分非磷酸肽消失，检测到两个磷酸肽，成为谱图中两个最强的峰，如图3a-b所示。
实施例4
将分别含1M尿素、1%SDS和lMNaCl的a-酪蛋白质酶解产物20pL (2pmol4iL)分别推入磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱(内径75tim，柱长50cm)，重复上述富集步骤，进行MALDI-TOF-MS分析。同时利用20|iL不含尿素、SDS和NaCl的a-酪蛋白质酶切液进行对照。它们富集效果之间没有明显差别，如图4a-d所示。检测到的磷酸肽在图中进行了标记。
实施例5
将a-酪蛋白质与牛血清白蛋白质的酶切肽段溶液分别以物质的量比率1:1, 1:10, 1:100的比例相混合，牛血清白蛋白质浓度保持2pmol4iL， a-酪蛋白质浓度依次降低。利用磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱(内径50pm，柱长50cm)按照上述步骤对三种比例的混合物进行富集，MALDI-TOF-MS分析。对a-酪蛋白质与牛血清白蛋白质以物质的量比率1:100比例混合的样本，仍然可以富集检测到4个磷酸肽，而对照样品只能检测到1个磷酸肽，如图5a-f所示。
实施例6
将30nL牛奶溶于900|aL 50mM的NH4HC03溶液中，振荡混匀，在16000r/min离心15分钟。取清液，重复离心3次。将清液在含有尿素(8M)和DTT U0mM)的溶液中37 °C水浴还原4h,加入IAA (lOmM)暗处放置0.5h进行烷基化，37 。C水浴孵育酶解。
将30pL牛奶蛋白质酶切液用微量进样泵以0.3pL/min的流速推入磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱(内径50pm，长150cm)，按照上述步骤进行富集，MALDI-TOF-MS分析。可以富集检测到10个磷酸肽，而对照样品只能检测到4个磷酸肽，如图6a-b所示。
实施例7
将磷酸锆基团修饰的开管毛细管柱(内径5C)^n，长150cm)接在纳升级LC-ESI-MS液相的预柱之前，利用自动进样器，通过自动化的控制软件，轻松实现大批量样本的自动上样、清洗、洗脱及质谱分析，如图7所示。
权利要求
1.一种用于富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的开管毛细管柱，其特征为内壁具有可选择性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质的功能基团。
2. 根据权利要求1所述的开管毛细管柱，其特征为其内表面硅羟基与磷酸肽或 磷酸化蛋白质吸附材料化学连接。
3. 根据权利要求2所述的开管毛细管柱，其特征在于连接的磷酸肽或磷酸化蛋 白质吸附材料为磷酸锆。
4. 一种富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤(1) 制备权利要求1所述的功能性开管毛细管柱；(2) 将样品注入到开管毛细管柱中，孵育以选择性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质；(3) 将洗脱液注入开管毛细管柱，对磷酸肽或磷酸化蛋白质进行洗脱；(4) 对洗脱后的磷酸肽或磷酸化蛋白质进行质谱分析。
5. 根据权利要求4所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法，其特征在于步骤 (2)选择性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质时，可采用连续注射形式或进样后静态孵育。
6. 根据权利要求4所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法，其特征在于步骤 (2)完成后，将清洗液注入开管毛细管柱，除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白质和盐，再进行步骤(3)。
7. 根据权利要求4所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法，其特征在于步骤 (4)为将洗脱后的磷酸肽或磷酸化蛋白质样品点于MALDI靶上，加入基质进行MALDI-TOF-MS分析。
8. 根据权利要求4所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法，其特征在于步骤 (4)为与电喷雾质谱结合，自动在线富集分析磷酸肽或磷酸化蛋白质。
9. 根据权利要求8所述的富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法，其特征在于自 动在线富集磷酸肽或磷酸化蛋白质分析时使用微升或纳升级电喷雾质谱。
全文摘要
本发明涉及一种功能化修饰的开管毛细管柱离线及在线富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的方法制备一种内壁具有可选择性吸附磷酸肽或磷酸化蛋白质的磷酸锆功能基团的开管毛细管柱，负载样品后可以对磷酸肽或磷酸化蛋白质进行富集，再利用清洗缓冲液除去非磷酸肽或非磷酸化蛋白质和盐，清洗完成后利用洗脱液对磷酸肽或磷酸化蛋白质进行洗脱，洗脱的磷酸肽或磷酸化蛋白质可点在MALDI靶上，进行正常的MALDI-TOF-MS分析。也可以接在微升或纳升级LC-ESI-MS的液相部分上，结合ESI-MS/MS自动在线富集分析磷酸肽或磷酸化蛋白质。
文档编号G01N1/40GK101685051SQ20081021172
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月23日 优先权日2008年9月23日
发明者卫军营, 张养军, 薛彦峰, 钱小红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所