专利名称：：相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法
技术领域：
：本发明涉及一种分析方法，具体而言，本发明涉及一种相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法。
背景技术：
：随着2000年6月国际人类基因组计划的完成，人类开始从基因组时代步入后基因组时代，在后基因组时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，基因的功能是靠其功能的执行者-蛋白质来实施的，因而对蛋白质的表达量、定位、修饰状态以及蛋白质之间相互作用的研究成为后基因组时代的热点研究领域。在生命体内，蛋白质在发挥功能之前需要经过基因的转录、翻译、翻译后修饰过程，并转运到细胞或组织内特定的部位发挥功能。大多数蛋白质在发生翻译后修饰之前是没有活性的，也就是说，蛋白质的翻译后修饰对于执行蛋白质特定的功能是极其重要的，它使特定蛋白质的结构更加复杂、功能更加完备、调控机制也更加精细。目前在真核细胞中存在20多种翻译后修饰的形式，比较常见的有磷酸化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰等。磷酸化修饰是一种广泛存在于生命体内的蛋白质翻译后修饰，细胞内许多具有关键功能的蛋白质都会发生磷酸化修饰，它参与和调控生物体内的许多生命活动。在真核细胞内，磷酸化修饰主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等氨基酸残基上，人类蛋白质组中含有10万多个潜在的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，对细胞内的各种活性调控均发挥着重要的作用。随着蛋白质组学的飞速发展，对蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。由于磷酸化蛋白质是各种磷酸化形式的复合物，而且是动态变化的，对磷酸化蛋白质组的定量研究突显出尤为重要的意义。目前，采用相对定量蛋白质磷酸化修饰的方法来表征蛋白质磷酸化水平的变化，一直以来，蛋白质组学面临的一个重要任务就是不同样本中蛋白质的相对定量问题。具体而言，相对定量蛋白质磷酸化修饰方法是一种比较不同条件下蛋白质各个修饰位点上磷酸化水平的相对差异的方法。定量分析的前提是检测蛋白质的磷酸化，所依赖的常规技术是32P放射性同位素标记法和磷酸化抗体的免疫印迹技术。检测磷酸化蛋白最经典的生化方法是32P放射性标记法，可以对活体细胞或者纯化好的蛋白质进行标记。以标记活细胞为例，具体过程为:培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，此时用不含磷酸盐标记的培养液(如DMEM)替换原来的细胞培养液，并加入32P标记的磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激酶利用被放射性标记的ATP使底物磷酸化，而后裂解细胞提取蛋白质，随后进行凝胶电泳分离蛋白质混合物，使用32P的放射自显影信号检测磷酸化蛋白质。磷酸化抗体的免疫印迹技术是使用抗磷酸化蛋白的抗体特异性得识别电泳凝胶上的蛋白条带，并通过显色反应来检测与抗体结合的磷酸化蛋白。目前，抗酪氨酸磷酸化与抗丝氨酸/苏氨酸磷酸化的抗体(广谱性抗体)是应用较广泛的抗体，理论上它们能够识别和结合多种蛋白质上带磷酸根的特定氨基酸残基。对于组成非常复杂的蛋白质组样品(例如全细胞的蛋白提取液)，通常先使用针对目标蛋白质的抗体首先对该蛋白进行免疫沉淀，而后使用抗磷酸化蛋白的抗体检测目标蛋白上的磷酸化信号。某些情况下，也可使用针对特定蛋白质磷酸化基团制作的抗体来检测该蛋白的磷酸化信号。磷酸化抗体产生的信号的强弱反映出目标蛋白质的磷酸化水平的高低。但32P放射性同位素标记法和磷酸化抗体的免疫印迹技术多数情况下只能检测蛋白质整体的磷酸化水平，无法分辨修饰的位点，也就难以对每个位点的修饰水平加以定量。磷酸化抗体的免疫印迹技术的缺点如下:首先，检测蛋白质磷酸化的广谱性抗体的选择性很低，无法区分是何种蛋白质带有修饰，因此只能用于检测纯化或富集后的单一蛋白质的磷酸化，难以直接分析组成复杂的蛋白质混合物；其次，广谱性的抗体检测的是蛋白质整体的磷酸化水平，难以辨别不同位点的修饰差异，再次，这类广谱性的抗体亲和力也较弱，导致磷酸化比例低的蛋白无法被检测到。因此，免疫印迹只可用于半定量分析，定量的准确性和动态范围都很有限。32P放射性同位素标记法的大部分缺点与免疫印迹是重合的，例如选择性低，无法检测蛋白质上不同位点的磷酸化水平，定量的准确性和动态范围都有限等。另外，放射自显影的实验需要使用专门的防辐射设备，使得实验成本大幅度增加，操作的复杂性增高。其次，对某些磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质，只能渗入少量的放射性磷酸盐，有可能检测不到。最后，不同蛋白质上的氨基酸其磷酸化和去磷酸化的代谢速率有差异，所以掺入32P磷酸盐的速率也是不一样的，从而给定量比较引入误差。目前用于鉴定蛋白质磷酸化的最有效的技术是质谱方法，该方法通常采用依赖母离子的串级质谱分析(data-dependentMS/MS)对蛋白质的酶解片段进行序列解析并鉴定带有修饰的氨基酸残基。将该方法与稳定同位素标记技术(isotope-labeling)相结合即可对不同条件下的蛋白质组的定量变化进行精细的分析(MichelaTomaiuoloa,GennaroVecchione.Stable-1sotopedilutionLC-ES1-MS/MStechniquesforthequantitativeoftotalhomocysteineinhumanplasma.JournalofChromatographyB2009，3292-3299.)。目前，在以液相色谱-质谱串联系统为基础的技术流程中，最常用的定量技术是采用稳定同位素标记的方法使两个样本中的同一蛋白质分别带上不同的质量标签，利用该质量标签在质谱分析中产生的不同信号的强度差异，可以研究多个样本中的特定蛋白质的相对定量变化。但是这种同位素标记的定量的质谱方法需要消耗较大量的标记试剂，造成实验成本和操作的复杂程度均明显上升。
发明内容现有技术中，使用同位素标记的定量方法需要消耗较大量的标记试剂，造成实验成本和操作的复杂程度均明显上升，为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法，该方法包括:将蛋白质酶解成肽段，利用不依赖母离子的串级质谱技术确定具有磷酸化位点的肽段，以及利用无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析。由于直接从蛋白质的酶解肽段中鉴定磷酸化肽段并确定其位点具有很高的难度，这是因为:第一，磷酸化蛋白质含量一般很低，化学计量值低，磷酸化的肽段很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中；其次，磷酸化的肽段本身所具有的负电性使其在正离子模式的质谱分析中信号受到抑制；再次，磷酸化基团在串级质谱分析中容易从肽链上断裂，这使得发现磷酸化位点遇到很高的挑战。为此，本发明对蛋白质酶解产物中的磷酸化肽段首先进行高效的富集，去除那些非磷酸化的肽段。因此，在上述无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平方法中，在将蛋白质酶解成肽段的步骤和利用data-1ndependentMS/MS方法确定具有磷酸化位点的肽段的步骤之间还包括富集磷酸化肽段的步骤。本发明采用以二氧化钛或金属铁/金属锆氧化物为基质制作的亲和纯化柱对磷酸化肽段进行富集。首先将待分析的蛋白质样品酶解，使之转化为肽段的混合物。该肽段样品直接上样到亲和柱上，其中含有的磷酸化肽段会被基质特异性地吸附，而大部分的非磷酸化肽段则不被保留而流出。为了彻底去除非特异性肽段的吸附，还需要用含有2，5_二羟基苯甲酸或谷氨酸的溶液多次润洗柱子，最后使用氨水溶液将结合在基质上的磷酸化肽段洗脱下来，收集洗脱液并浓缩。由于本发明中使用亲和富集的方法富集磷酸化肽段，去除了非磷酸化肽段的干扰，因此能显著提高相对定量分析方法的灵敏度和准确度。相对于依赖母离子的串级质谱分析(data-dependentMS/MS)技术,不依赖母离子的串级质谱技术不依赖母离子的串级质谱(data-1ndependentMS/MS)是一种灵敏度更高，对蛋白质组鉴定的通量和覆盖率更高的分析方法，该分析方法在低碰撞能和高碰撞能之间进行交替扫描，不需要如常规方法一般选择特定的肽段母离子，而是将所有母离子都打碎，在数据检索中找到母离子和相应碎片离子的对应关系。本发明将富集的磷酸化肽段样品进行纳升流高效液相色谱-串级质谱(nanoLC-MS/MS)分析，采用data-1ndependentMS/MS技术得到各个肽段的母离子和碎片离子的两张谱图。通过分析谱图中的母离子和相应碎片离子的精确质量数之间的差别，可以得知肽段上携带的磷酸根的数目，而谱图中的碎片离子能够直接指示磷酸化的位点。图1为使用不依赖母离子的串级质谱方法技术得到的某种磷酸化肽段的串级质谱图，其中丢失磷酸根(-H3PO4)产生的若干碎片离子指示出具体的修饰位点。由此解得的肽段序列为ELQVASDNFpSNK，pS表示该丝氨酸残基S携带一个磷酸化基团。Data-1ndependentMS/MS技术能够准确鉴定肽段的氨基酸序列，并定位具体的修饰位点。这一步骤是进行下述磷酸化相对定量分析步骤的先决条件。本发明利用操作简单、成本低廉的无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析。无标记定量方法(Label-freequantitation)利用被鉴定的磷酸化肽段的离子提取色谱图作为其定量的具体质谱信号，相同序列的肽段所产生的质谱信号与它的实际浓度呈比例关系，因此本发明利用不同样品中的同一磷酸化肽段的质谱信号强度作为其相对定量的依据。相对定量分析即为比较同一肽段母离子在不同样品中得到的离子提取色谱图中的色谱峰面积，从而知晓其相对含量的变化。需要指出的是，相对定量不需要测定目的肽段在每个样品中的实际浓度，而只需测量其浓度相对于某个基准样品上升或下降的趋势。为了减少实验过程中引入的系统误差，本方案在蛋白的酶解样品中加入适量的内标物质(通常为磷酸化水平较高的α/β-酪蛋白的酶解产物)，而后可利用该内标产生的质谱信号来校正待分析的各种磷酸化肽段的信号。为评价实验数据的重现性，每一个样品都要把整个制样过程重复三遍，计算出待研究的磷酸化肽段相对含量的标准偏差，经过统计分析(student’st-test)判断其差异是否具统计学意义。另外，本发明也使用已知相对比例的样品进行质量控制的检测，评价定量的准确性。综上，本发明提供了一种将磷酸化肽段的亲和富集方法、不依赖于肽段母离子选择的MS/MS技术与无需同位素标记的定量方法组合起来的用于蛋白质磷酸化的相对定量分析的方法。相对于现有的依赖母离子的串级质谱分析与稳定同位素标记技术相结合的方法，该方法不需要同位素标记试剂，因此具有降低实验成本和操作复杂程度的优势。本发明提出的新技术流程能够对蛋白质上各个位点的磷酸化水平进行精确的相对定量分析，为深入研究以磷酸化修饰为基础的细胞内信号转导和基因表达的调控机制提供了关键的技术。该新型的定量方法很大程度得解决了常规方法的低选择性、操作复杂、耗样量大等缺陷，而且可以对复杂混合物中的不同蛋白质上的不同修饰位点同时进行定量分析，显著提高了磷酸化分析的通量。预计该技术方法能够明显推进蛋白质磷酸化的生物学研究。图1为使用不依赖母离子的串级质谱方法技术得到的磷酸化肽段ELQVASDNFpSNK的的串级质谱图。图2中的上图显示的是突变体激酶中的磷酸化肽段S290的提取离子色谱峰，下图显示的是野生型激酶中的磷酸化肽段S290的提取离子色谱峰。具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实验样品:某种蛋白激酶的突变体(mut)和野生型(Wt)实验方法:1、用膜蛋白酶酶解这两个实验样品mut和wt,将蛋白转化为多妝混合物。2、在两个蛋白的酶解样品中加入适量的内标物质酪蛋白的酶解产物)一起进行磷酸化肽段的富集。3、分别用溶液Α(80%乙腈、0.4%三氟乙酸)和溶液B(25%乳酸、60%乙腈、0.3%三氟乙酸)平衡二氧化钛亲和柱，然后将混合好的酶解样品与溶液B—起上样到亲和柱上，在离心的过程中，使磷酸化肽段结合到二氧化钛介质上，非磷酸化肽段流出来。4、用含有2，5_二羟基苯甲酸或谷氨酸的溶液多次润洗柱子，去除非特异性结合。最后使用氨水溶液将结合在基质上的磷酸化肽段洗脱下来，收集洗脱液并浓缩。5、使用nanoLC-MS/MS分别分析两个样品富集得到的磷酸化肽段，使用data-1ndependentMS/MS方法采集肽段的碎片离子信息。实验结果分析:1、使用质谱软件检索实验数据，并结合串级质谱图确定mut和wt两个蛋白分别的磷酸化修饰位点。2、选取要进行相对定量的磷酸化肽段如S290ELQVASDNFpSNK，在总离子色谱图中提取出它的色谱峰，计算峰面积，色谱峰面积反应目的肽段的相对含量，并用内标肽段的强度进行矫正，得到的相对强度即为目的肽段的相对定量结果。3.将该目的肽段在突变体(mut)中的相对含量与在野生型(wt)中的相对含量进行比较，就可以确定当特定位点突变以后对该激酶的磷酸化水平的影响。如图2中所示出的，上图显示的是突变体激酶中S290这条磷酸化肽段的提取离子色谱峰，色谱峰面积反应该磷酸化肽段的含量，下图显示的是野生型激酶中S290这条磷酸化肽段的提取离子色谱峰，将两样品中的色谱峰面积分别用内标信号强度进行矫正然后比较就能得到关于磷酸化相对变化的结果。数据表明，相对于野生型激酶，定点突变导致S290这个位点的磷酸化水平下降了88%。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。权利要求1.一种无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法，包括:将蛋白质酶解成肽段，利用不依赖母离子的串级质谱方法确定具有磷酸化位点的肽段，以及利用无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析。2.根据权利要求1所述的方法，其中在将蛋白质酶解成肽段的步骤和利用不依赖母离子的串级质谱方法确定具有磷酸化位点的肽段的步骤之间还包括富集磷酸化肽段的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述富集磷酸化肽段的步骤包括:利用亲和纯化柱吸附肽段中的磷酸化肽段；从亲和纯化柱洗脱磷酸化肽段；以及收集洗脱的磷酸化肽段。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述亲和纯化柱的基质为二氧化钛或金属铁/金属锆氧化物。5.根据权利要求3所述的方法，其中在从亲和纯化柱洗脱磷酸化肽段之前还包括使用含有2，5-二羟基苯甲酸或谷氨酸的溶液润洗亲和纯化柱的步骤。6.根据权利要求1所述的方法，其中利用无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析的步骤中还包括加入内标物质。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述内标物质是α/β-酪蛋白的酶解产物。8.根据权利要求1所述的方法，其中还包括将所述无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法重复三次，进行统计分析的步骤。9.根据权利要求1所述的方法，其中还包括评价所述无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法的定量准确性的步骤。全文摘要本发明提供了一种无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法，包括将蛋白质酶解成肽段，利用不依赖母离子的串级质谱方法方法确定具有磷酸化位点的肽段，以及利用无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析。相对于现有的依赖母离子的串级质谱分析与稳定同位素标记技术相结合的方法，该方法不需要同位素标记试剂，因此具有降低实验成本操作复杂程度的优势。文档编号G01N1/40GK103163010SQ20111041803公开日2013年6月19日申请日期2011年12月14日优先权日2011年12月14日发明者水雯菁,杨诚,刘丹,魏晓超,徐金华申请人:天津市国际生物医药联合研究院,南开大学生命科学学院