专利名称：保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组织细胞蛋白裂解液的提取方法，尤其涉及一种保持 蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液的提取方法，该方法在提取活体组织裂 解液的过程中同时抑制磷酸酶，从而保持其中蛋白质的磷酸化状态，及其 )IJ于该方法的装置。
背景技术：
迅速裂解动物组织是寻找和研究生物标记、抗体、蛋白表达、蛋白相互
作用以及ELISA和免疫沉淀等实验所必须的步骤。此外，生物体细胞内的磷 酸化和去磷酸化的蛋白表达能揭示-系列生物现象，包括与细胞内信号传递、 细胞凋亡、细胞分化和增殖相关联的分子开关。
目标蛋白通过蛋白激酶，在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上转移磷酸基 团，使得蛋白处理磷酸化状态，其键结合改变了蛋白的形态结构以及结合反 应能力。蛋白的磷酸化检测被广泛应用于疾病的的体外诊断。
除具用专业分子生物实验的部门外，如在医院镜检部门的日常活 体组织检验过程中，都是预先一周内由专业分子生物实验室制备磷酸酶抑 制剂，放入某种容器或试管内准备好，在使用时容器放置在冰上，预备在 镜检的操作室内，或把活检组织直接投入液氮。其制备过程繁琐并会对镜 检部门原有的设置和条件产生影响，此外，配制的磷酸酶抑制剂易受空气
中酸性物质(如二氧化碳等)的影响而使得其对酶的抑制失效，或者在 从液氮中复苏，蛋白磷酸化的状态也会有很大变化。由于采集到的活体组 织又需要快速裂解，以稳定其中蛋白质的磷酸化状态，而磷酸酶抑制剂不 宜长期保存，在检测过程中组织裂解液当中的磷酸化蛋白状态易发生改 变，都影响了被检测的蛋白磷酸化水平。
实验室配制的磷酸酶抑制剂其保存时间通常为两周左右，当其暴露
于空气中时，其抑制效果会显著下降。GENMED公司提供一种磷酸酶抑 制剂混合液，包括氟化钠(Sodium Fluoride )、钒酸钠(SodiumOrthovanadate )、 焦石粦酸纳 (Sodium Pyrophosphate )禾口甘油石粦酸 (Glycerophosphate)等化合物实现对组织提取液中磷酸化酶的抑制，使 样品中的各类蛋白质处理原始的生理状态。在4"C温度下，该抑制剂的稳 定性能保持12个月。
以医院镜检部门为例，其对活体组织的检验通常采用微阵列检测(即 蛋白或组织芯片)，这就要求活体组织细胞经常规方法裂解后，还必须要 经过测定和校正裂解液中的蛋白质浓度后，才能进行相应的蛋白磷酸化水
平检测。因此受到多种因素的影响(如裂解液制备时间过长，磷酸酶抑 制也会不稳定)，使得磷酸酶抑制剂的抑制效果下降，导致样品中蛋白质 的磷酸化状态发生改变，并进而影响检测结果。还有检测方法借助荧光技 术直接作用于被检测组织上，但其受细胞膜的阻碍作用，抗体效果会受表 达不稳定影响。
发明内容
本发明的 一 个目的在于提供 一 种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂 解液提取方法，尽可能地保护磷酸化状态并能使组织细胞尽快裂解的方 法，以适应于医院活检组织镜检的需要，简化和统一被检的样本的制备， 从而提高检测的通量、制备样本一致性和实时的准确性，来更好地评价生 命现象。
本发明的另 一 个目的在于提供 一 种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞 裂解液提取装置，配合本发明的提取方法，能实现不具备特殊实验室条件 的单位，如医院镜检部门对活检组织的蛋白磷酸化检测的样本制备。
镜检指通过纤维镜进行的检测，纤维镜是一种可随意弯曲、细小、柔 软的内腔镜，由导光性能良好的玻璃纤维制成，其外部有冷光源照明，能 按操作要求进入成角度的生理或病理性小腔道内，观察微小的病变，采取 组织或细胞样本。
在纤维气管镜或胃肠道镜检过程中，技术人员通常需要对活体器官进 行取样，以便于通过进一歩的组织检测分析病情。这些活体组织在离体后， 其中某些蛋白质的磷酸化水平会发生变化，使得其与生理状态不相一致，
比如在离体状态下，JNK蛋白的磷酸化程度在逐渐增加，而ERK蛋白的磷酸化程度则在减少。因此，在离体的组织或细胞样本中需要加入磷酸 酶抑制剂，减少活组织离体后某些蛋白磷酸化表达变化，保持活组织离体 后蛋白磷酸化原有状态，以确保检测的结果与实际的生命状况相一致，能 为生命现象和疾病的诊断提供依据。
在镜检的整个过程当中，实时的蛋白磷酸化状态是极其不稳定或易发 生改变，不仅需要对离体样本的及时处理，还需要对处理后样品制备及快 速地分析。因此，保持组织细胞的蛋白磷酸化状态的技术一直是很重要的。 一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取方法，包括如卜步
骤
将盛有冷冻液的容器冷冻至0 — 4"C，再将磷酸酶抑制剂和裂解液等 体积混合后按相同体积分装于微型离心管内，微型离心管置于容器中，将 容器密闭后，在其-一开口 (抽气口)处抽真空并使容器内的真空度至-5Pa 一-10Pa，再用橡胶软塞封闭该开口。
在活检取材后，打开封闭容器盖，将组织直接放入各个微型离心管内， 用小型硬塑料制成的研磨棒研磨组织后，离心取上清液，即组织细胞裂解 液。
优选的，取相同体积和相同类型的活体组织置于各个试管内，研磨并 离心后取上层组织裂解液。提取得到的组织裂解液中的蛋白浓度为l一 4(ig l，即可直接用于微阵列比较(即检测)。
磷酸酶抑制剂独立地选自于氟化钠、钒酸钠、焦磷酸钠和甘油磷酸或 二个以上化合物任意比例的组合。优先选择pH值为10，浓度为2mmol/L 的钒酸钠溶液。
裂解液为浓度为1一2% (w/v)的十二烷基磺酸钠(Sodium lauryl sulfate, SDS)溶液。
为了避免溶解于溶液中气体的影响，实现对磷酸酶更好的抑制效果， 可以通过超声的方式将配制后的磷酸酶抑制剂和裂解液中的气体排除。具 体方法如将溶液先超声10 — 30分钟后，静置20 — 60分钟，再振摇后 超声5 — 15分钟后，静置10 — 30分钟。
微型离心管为1.8ml Eppendorf离心管。
冷冻液为试管提供低温环境，.具体为水。活检组织源自于活体动物器官的细胞或形态相似、功能相同的细胞群
及其细胞间质。活体动物包括人、野生动物和家畜(Livestock)。野生动
物为自然状态下未经人工驯化的动物。家畜是为了提供食物来源而人工饲
养的动物，如狗、鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、公牛、绵羊、山羊、 鹅和鸡等，活体动物器官的具体类型，但不仅限于，如鼻、喉、食管、 支气管、胃、十二指肠、胆道、结肠、膀胱或宫腔等。
为配合上述提取方法，先预冷冻装置盒0至-6t:—个小时，再进行蛋
白磷酸酶抑制剂和裂解液制备及分装在微型离心管内，然后将其微型离心
管置于真空容器中，在0 — 4。C避光条件下的制剂能有效保存14一16个月， 以实现医院等镜检部I'—]对活检组织的快速检测。
一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，包括
密闭容器，由顶盖和容器腔体组成，腔体内盛有冷冻液体，液体的体积
小于腔体的容积；12至24个大小相同的微型离心管，置于密闭容器的腔体 内，各个试管中盛有相同体积的裂解液及磷酸酶抑制剂。
另一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，包括
由顶盖和双层容器腔体组成的密闭容器，容器腔体内盛有冷冻液体，液
体的体积小于腔体的容积；管槽与容器腔体侧面内壁固定连接，将腔体分为
上下两层，12至24个大小相同的微型离心管垂直放置于管槽内；各个微型
离心管中盛有相同体积的裂解液及磷酸酶抑制剂。
容器腔体侧面和顶盖面至少设有一个与内腔向连通的开口。
裂解液为l一2。/。(w/v)十二烷基磺酸钠溶液，磷酸酶抑制剂2mmol/L 钒酸钠溶液(pH10)，裂解液和磷酸酶抑制剂按等体积混合后分装于微 型离心管内。
真空装置通过密闭容器上的开口与容器连接，将内腔中的空气排除， 使其真空度至少小于-1Pa，优先选择真空度为-5Pa — -10Pa。之后将开口 密闭并将装置置于4。C保存。使用时，打开容器顶盖，将相同体积和相同 类型的活检组织样本置于试管内，研磨并离心后得到上清组织裂解液，直 接用于蛋白的微阵列检测。本发明所涉及的术语与其在本领域的一般概念相同。 所述的"真空度"为相对真空度。
本发明技术方案实现的有益效果
本发明通过置于盛有冷冻液的真空度小于-5Pa密闭容器中的磷酸酶 抑制剂裂解液能较长时间保存，使得裂解和抑制磷酸化在0 — 4 。C下同时 进行，实现了保持原有的蛋白磷酸化状态和组织细胞裂解液的快速制备。 再取相同体积和相同类型的活体组织置于盛有相同体积裂解液的试管中， 提取得到的裂解液中的蛋白浓度为1 一 4pg/W ，不必测定和校正蛋白浓度， 即可以直接用于磷酸化蛋白质的微阵列检测。该方法不仅能使磷酸酶抑制 剂保持稳定，而且能适应医院大量活体组织镜检的需要，简化检测步骤， 从而提高检观lj准确性和稳定性。
为了配合本发明的提取方法，采用了提取活体组织裂解液的装置，可
用于医院活体组织中磷酸化蛋白微阵列的检测，减少对医院纤维镜检部r」
原有的设置影响和条件要求。该装置能在5 — 6小时内完好保存蛋白的生 理状态，可集中收集多个活体组织，还能稳妥护送组织样本到分子生物实 验中心进行磷酸化蛋白微阵列的检测。置于该装置的磷酸酶抑制剂可在0 一4'C的冷藏柜里避光保存1年半。
图1为提取活体组织裂解液的装置一实施例的示意图。
具体实施例方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案，本发明实施例仅用以说明 本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说 明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或 者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发 明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛一奥德里奇 (Sigma— Aldrich)。实施例1
结合图1，本发明的一保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装 置，包括由顶盖11和容器腔体12组成的密闭容器1，腔体内盛有冷冻液
体13，其体积小于容器腔体容积。管槽4与容器腔体12侧面内壁固定连 接，将腔体分为上下两层，12至24个大小相同的微型离心管2设置于管 槽内，各个离心管中盛有裂解液和磷酸酶抑制剂按相同体积混合的溶液 21。
容器腔体侧面设有一个与内腔向连通的抽气口 3。 真空装置通过密闭容器上的开口与容器内腔连接，将内腔中的空气排除， 使其真空度小于一lPa，最后用橡胶塞将抽气口 3封闭。
实施例2
1) 制备裂解液配制2mM钒酸钠(pH=10)禾n 1% (w/v)十二烷基 磺酸钠溶液。分别取200微升加入1.8毫升的微量离心管(Eppendorf管)，
然后置于盛有水的温度为o — 4r的密闭容器中。
2) 水循环真空泵与密闭容器上的抽气孔相连接，使容器内的真空度 为-5Pa。然后，用橡皮塞封闭抽气孔。
3) 将密闭容器放到低温条件下，于0 — 4匸条件下避光保存。
4) 使用时，打开容器盖，把等体积的相同类型的活体组织置入预备 好的微量离心管内，该容器能保持在3小时内将温度维持在0 —4°C。待 取样完成后研磨，13,000rpm离心20分钟后得到上清组织裂解液。裂解 液中的蛋白浓度在l一4pg尔l，直接用于磷酸化蛋白的微阵列检测。
权利要求
1. 一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取方法，包括如下步骤将磷酸酶抑制剂和裂解液等体积混合后冷冻至0—4℃，按相同体积分装于微型离心管中，然后置于盛有冷冻液的容器中，将容器密闭后，在其一开口处抽气并使其内的真空度为-5Pa—-10Pa，之后将冷冻液温度降至0—4℃，再取相同体积和相同类型的活体组织置于各个微型离心管内，研磨并离心后取上清液为组织裂解液。
2. 根据权利要求1所述的保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取方 法，其特征在于所述磷酸酶抑制剂为2mmol/L钒酸钠溶液，所述裂解液为1 一2%， w/v十二垸基磺酸钠溶液。
3. 根据权利要求1所述的保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取方 法，其特征在于所述上层组织裂解液，其中的蛋白浓度为l一4吗/pl。
4. 一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，其特征在于， 包括密闭容器，由顶盖和容器腔体组成，腔体内盛有冷冻液体，液体的体积 小于腔体的容积；12至24个大小相同的微型离心管，置于密闭容器的腔体内，各个试管 中盛有相同体积的裂解液及磷酸酶抑制剂。
5. —种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，其特征在于，包括密闭容器，由顶盖和双层容器腔体组成，容器腔体内盛有冷冻液体，液 体的体积小于腔体的容积；管槽，与容器腔体侧面内壁固定连接，将腔体分为上下两层，12至24个大小相同的微型离心管设置于管槽内；各个微型离心管中盛有相同体积的裂解液及磷酸酶抑制剂。
6. 根据权利要求4或5所述的保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取装置，其特征在于所述磷酸酶抑制剂为钒酸钠溶液，所述裂解液为十二烷 基磺酸钠溶液。
7. 根据权利要求4或5所述的保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提 取装置，其特征在于容器腔体侧面和顶盖面设有一个与容器内腔相连通的抽气口。
8. 根据权利要求4或5所述的保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提 取装置，其特征在于所述密闭容器，腔体内的真空度为一l 一10Pa。
全文摘要
一种保持蛋白磷酸化状态的组织细胞裂解液提取方法和装置，将磷酸酶抑制剂和裂解液等体积混合后冷冻至0-4℃，按相同体积分装于微型离心管中，置于盛有冷冻液的密闭容器中，真空抽气到-5Pa下，再密封保存。本装置磷酸酶抑制剂及裂解液有效期14-16个月。使用本装置，能使活检在抑制磷酸酶同时还同步进行组织细胞裂解，蛋白浓度为1-4μg/μl，不测定和校正蛋白浓度，即可直接用于磷酸化蛋白微阵列检测。该方法和装置能保持被检测组织的蛋白磷酸化状态，适合医院等部门的组织镜检需要，简化样本制备步骤及缩短时间，能保证检测组织质和量的一致性，从而能提高了检测速度和数量。实现了快速制备组织细胞裂解液。
文档编号G01N1/28GK101545836SQ20091005060
公开日2009年9月30日 申请日期2009年5月5日 优先权日2009年5月5日
发明者吴建乾, 吴达龙, 周新妹, 宋柱芹, 尹满香, 张成文, 张高忠, 斌 李, 杜开齐, 林雪平, 顾旭东 申请人:嘉兴学院;张成文