用于治疗和/或限制糖尿病发展的方法
【专利说明】用于治疗和/或限制糖尿病发展的方法
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月18日提交的美国临时专利申请系列No. 61/738835的优 先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
[0003] 介绍
[0004] 电压门控的钙（Cav)通道在β细胞的生理学和病理生理学中是重要的。它们不仅 在胰岛素分泌的调节中处于中心阶段，而且还通过调节蛋白质的磷酸化、基因表达和细胞 周期而涉及β细胞的发育、生存和生长。β细胞〇^通道的功能和密度受到多种机制的调 节，这些机制是与其他类型的细胞所共有的，或者是β细胞所特有的，例如通道磷酸化、与 其他分子的相互作用以及葡萄糖代谢衍生的信号传递。功能失调的〇^通道导致β细胞 失效并且甚至死亡，这在大部分普通的代谢紊乱糖尿病中可证明。实际上，T淋巴细胞介导 的自体免疫攻击在1型糖尿病的β细胞死亡中起到关键作用。此外，1型糖尿病血清中的 因子迫使非生理学量的Ca2+通过β细胞Cav通道的过度活化而进入胰腺β细胞，导致β 细胞凋亡。毋庸置疑，该过程在自体免疫攻击之上加重了疾病的发展。此外，此类因子还可 见于在2型糖尿病的血清中，其中它们以与1型糖尿病血清中相同的方式起作用。事实上， 在2型糖尿病状况（例如在Goto-Kakizaki大鼠中的那些）中，出现β细胞质量的降低和 β细胞Cav通道的过度活化。
[0005] 发明概述
[0006] 在一个方面中，本发明提供了用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选 化合物的方法，其包含：
[0007] (a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加 Cav通道的密度和/或传导性的量的载脂蛋白CIII (Ap0CIII)相接触；
[0008] (b)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第二群体与有效增加 Cav通道的密度和/或传导性的量的Ap0CIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第二 群体与抑制B族I型清道夫受体（SRBI)的表达或活性的分子相接触；以及
[0009] (c)识别阳性测试化合物作为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的候选化 合物，其中所述的化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第二群体 中更高程度地抑制了 Cav通道的密度和/或传导性的、Ap0CIII诱导的增加。
[0010] 在一个实施方案中，所述的方法进一步包含在一种或多种候选化合物存在下，将 胰岛素分泌细胞的第三群体与有效增加 CavI通道的密度和/或传导性的量的Ap0CIII相 接触，以及进一步将胰岛素分泌细胞的第三群体与Cav2和/或Cav3通道阻断剂相接触，其 中所述的候选物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述 的候选物在胰岛素分泌细胞的第三群体中比在胰岛素分泌细胞的第一群体中更高程度地 抑制了密度和/或传导性的、Ap0CIII诱导的增加。
[0011] 在可以与本发明的任意一个实施方案结合的其他实施方案中，所述的方法进一步 包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第四群体与有效增加 CavI通道 的密度和/或传导性的量的Ap0CIII相接触，以及进一步将胰岛素分泌细胞的第四群体与 Src激酶抑制剂和/或蛋白质激酶A抑制剂（PKA)相接触，其中所述的这些候选化合物是用 于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的候选化合物在胰岛素 分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第四群体中更高程度地抑制了 CavI通道的 密度和/或传导性的、Ap0CIII诱导的增加。
[0012] 在可以与本发明的任意一个实施方案结合的另一个实施方案中，所述的方法进一 步包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第五群体与有效增加 CavI通 道的密度和/或传导性的量的Ap0CIII相接触，以及进一步将胰岛素分泌细胞的第五群体 与抑制β 1整联蛋白表达或活性的分子相接触，其中那些候选化合物是用于限制糖尿病发 展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的那些候选化合物在胰岛素分泌细胞的 第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第五群体中更高程度地抑制了 CavI通道的密度和/或 传导性的、ApoCIII诱导的增加。
[0013] 在第二个方面中，本发明提供了用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候 选化合物的方法，其包含：
[0014] a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加 CavI通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触；以及
[0015] b)识别那些阳性测试化合物，与对照相比，该化合物在胰岛素分泌细胞的第一群 体中抑制了 SRBI的表达或活性，其中所述的阳性测试化合物为用于限制糖尿病发展和/或 治疗糖尿病的候选化合物。
[0016] 在一个实施方案中，所述的对照包含在一种或多种测试化合物缺乏下，将胰岛素 分泌细胞的第二群体与有效增加 CavI通道的密度和/或传导性的量的ApoCIII相接触。该 实施方案可以包含例如将细胞的第二群体与配制物（例如缓冲剂）相接触，其中所述的配 制物与溶解有测试化合物的配制物相似或一致。
[0017] 在本发明这些方面的任意一个方面的多种实施方案中（除非上下文另外作出明 确说明，否则所述的这些实施方案可以结合），所述的方法包含将所述的细胞与ApoCIII接 触至少6个小时；所述的候选化合物为用于抑制I型糖尿病的发展和/或治疗I型糖尿病 的候选化合物；和/或其中所述的候选化合物为用于抑制2型糖尿病的发展和/或治疗2 型糖尿病的候选化合物。
[0018] 在第三个方面中，本发明提供了用于治疗或限制糖尿病的发展的方法，其包含向 有需要的受试对象给药有效量的SRBI表达和/或活性的抑制剂。在多种实施方案中，所述 的抑制剂选自抗SRBI抗体，抗SRBI适体，SRBI siRNA，SRBI shRNA，SRBI反义寡核苷酸， 和抑制SRBI表达和/或活性的小分子。
【附图说明】
[0019] 图1.载脂蛋白CIII温育会增加 β细胞中CavI通道的密度和传导性。（a)在与 媒介物溶液（作为对照）或载脂蛋白CIII (ApoCIII)温育的小鼠小岛β细胞的质膜片中 检测到的单位CavI通道电流的实例。（b)在质膜片中测量的单位CavI通道的平均数量、开 放几率、平均关闭时间和平均开放时间，其中所述的质膜片附着在暴露于对照媒介物（η = 33)或ApoCIII (η = 32)的小鼠小岛β细胞上。（c)在质膜片中记录的单位CavI通道电 流的实例，其中所述的质膜片附着于对照RINm5F细胞或使用ApoCIII处理的细胞上。（d) 在对照RINm5F细胞（η = 34)或与Ap0CIII温育的细胞（η = 35)的质膜片上检测的单位 CavI通道的平均数量、开放几率、平均关闭时间和平均开放时间。与对照比，*P〈0. 05并且 **P〈0. 01。
[0020] 图2.载脂蛋白CIII温育会增加全细胞Ca2+电流，并且在RINm5F细胞中，与Ca vI 通道阻断剂尼莫地平共温育会废除载脂蛋白CIII温育的作用。（a)由与媒介物溶液（作 为对照）温育的细胞（细胞电容：10.1 pF)和载脂蛋白CIII (Ap0CIII)处理的细胞（细胞 电容：11. IpF)得到的样品全细胞Ca2+电流追踪。（b)在对照细胞（空心圈，η = 26)和使 用Ap0CIII处理的细胞（实心圈，η = 26)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。与对照比， *Ρ〈0· 05并且**Ρ〈0· 01。（c)由尼莫地平（Nim)温育的细胞（细胞电容：IOpF)以及一起暴 露于Nim和ApoCIII(Nim/ApoCIII)的细胞（细胞电容：11.9pF)得到的样品全细胞Ca2+电 流追踪。（d)在Nim处理的细胞（空心圈，η = 20)以及与Nim/ApoCIII温育的细胞（空心 圈，η = 21)中，平均Ca2+电流密度-电压的关系。与单独的Nim比，*P〈0. 05和#P〈0. 01。
[0021] 图3.在RINm5F细胞中，PKA或Src激酶抑制少量地降低了全细胞Ca2+电流的、载 脂蛋白CIII诱导的增强，但是PKC抑制不影响该增强。（a)由与媒介物溶液（作为对照） 温育的细胞（细胞电容：8. 5pF)、载脂蛋白CIII (Ap0CIII)处理的细胞（细胞电容：8. 2pF) 和暴露于ApoCIII加 PKA抑制剂H-89的细胞（ApoCIII/H-89,细胞电容：8. 4pF)得到的样 品全细胞Ca2+电流追踪。（b)在对照细胞（空心圈，η = 37)和使用Ap0CIII处理的细胞 (实心圈，η = 36)或使用ApoCIII/H-89处理的细胞（实心三角形，η = 36)中平均Ca2+电 流密度-电压的关系。与对照比，*Ρ〈〇. 05并且**Ρ〈0. 01。（c)由对照细胞（细胞电容： 12. 5pF)、ApoCIII温育的细胞（细胞电容：12. OpF)和经过ApoCIII和PKC抑制剂卡弗他 丁（calphostin)C共处理的细胞（ApoCIII/CalpC，细胞电容：12. IpF)中登记的样品全细胞 Ca2+电流追踪。（d)在对照细胞（空心圈，η = 33)、ApoCIII处理的细胞（实心圈，η = 33) 和暴露于ApoCIII/CalpC的细胞（实心三角形，η = 33)中平均Ca2+电流密度-电压的关 系。ApoCIII 与对照比，*Ρ〈(λ 05 并且#Ρ〈(λ 01。ApoCIII/CalpC 与对照比，*Ρ〈(λ 05 并且 **Ρ〈0· 01。（e)由对照细胞（细胞电容：9. 5pF)、ApoCIII温育的细胞（细胞电容：9. 2pF) 以及一起暴露于ApoCIII和Src激酶抑制剂PP2的细胞（ApoCIII/PP2,细胞电容：10.0 pF) 中获得的样品全细胞Ca2+电流追踪。（f)在对照细胞（空心圈，η = 40)和使用ApoCIII 温育的细胞（实心圈，η = 40)或使用Ap〇CIII/PP2温育的细胞（实心三角形，η = 40)中 平均Ca2+电流密度-电压的关系。ApoCIII与对照比，**Ρ〈0. 01。ApoCIIΙ/ΡΡ2与对照比，+Ρ〈0. 05。
[0022] 图4.在RINm5F细胞中，PKA、PKC和Src激酶的结合抑制会抵消全细胞Ca2+电流 的、载脂蛋白CIII诱导的增益，并且PKA和Src激酶的共抑制足以获得这种抵消。（a)由 媒介物温育的细胞（对照，细胞电容：7. 9pF)、在载脂蛋白（ApoCIII)处理后的细胞（细胞 电容：7. OpF)以及在H-89,卡弗他丁 C和PP2的蛋白质激酶抑制剂混合物存在下暴露于 ApoCIII的细胞（ApoCIII/H-89/CalpC/PP2,细胞电容：7. 2pF)中登记的样品全细胞Ca2+电 流追踪。（b)在对照细胞（η = 35)和暴露于ApoCIII的细胞（η = 34)或暴露于ApoCIII/ H-89/CalpC/PP2的细胞（η = 35)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。与对照和apoCIII/ H-89/CalpC/PP2比，*Ρ〈0· 05。（c)由对照细胞（细胞电容：8. 5pF)、ApoCIII处理后的细 胞（细胞电容：8. 2pF)和在蛋白质激酶抑制剂H-89和PP2存在下暴露于ApoCIII的细胞 (Ap〇CIII/H-89/PP2,细胞电容：8. 7pF)中得到的样品全细胞Ca2+电流追踪。（d)在对照细 胞（η = 26)和经历 ApoCIII 的细胞（η = 26)或经历 ApoCIII/H-89/PP2 的细胞（η = 27) 中平均Ca2+电流密度-电压的关系。与对照比，*Ρ〈0. 05和#P〈0. 01 ;与ApoCIII/H-89/ PP2 比，+Ρ〈0· 05〇
[0023] 图5.载脂蛋白CIII温育不能改变β细胞CavI通道的表达。（a) RINm5F细胞细胞 匀浆的代表性印迹，其中所述的匀浆经过与媒介物（作为对照）或载脂蛋白CIII (ApoCIII) 温育，在分别使用抗CavL 2,抗CavL 3和抗GAPDH抗体探测。（b)在RINm5F细胞匀浆中， 与对照相比（空心柱，η = 6)，CavL 2 (条纹柱，η = 6)和CavL 3亚单元（实心柱，η = 6) 的相对丰度的免疫印迹定量，其中所述的匀浆经过ApoCIII温育。在对照细胞和与ApoCIII 温育的细胞之间，总的CavL 2和CavL 3亚单元的相对丰度不具有显著的差异（P>0. 05)。
[0024] 图6.在RINm5F细胞中，敲除β 1整联蛋白会废除全细胞Ca2+电流的、载脂蛋白 CIII诱导的扩大。（a)在β 1整联蛋白siRNA#l-、阴性对照siRNA(NC siRNA)-和β 1整联 蛋白siRNA#2-转染的细胞中，β 1整联蛋白-和GAPDH-免疫反应条带的代表性印迹。（b) 在NC siRNA-(空心柱，η = 6)，β 1整联蛋白siRNA#l-(条纹柱，η = 6)和β 1整联蛋白 siRNA#2-转染的RINm5F细胞中，β 1整联蛋白的免疫印迹定量。（c)分别在模拟转染和与 对照媒介物温育（无 siRNA/对照，细胞电容：12. IpF)、NC siRNA转染和对照媒介物处理 (NC siRNA/对照，细胞电容：11. 4pF)、NC siRNA转染和载脂蛋白Cin(ApoCIII)温育（NC siRNA/ApoCIII，细胞电容：12. lpF)、β 1整联蛋白siRNA转染和暴露于媒介物溶液（β 1 整联蛋白siRNA/对照，细胞电容：11. 9pF)、以及β 1整联蛋白siRNA转染和ApoCIII暴露 (β 1整联蛋白siRNA/ApoCIII，细胞电容：12. 4pF)后，在单个细胞中登记的样品全细胞Ca2+电流追踪。（d)在经历无 siRNA/对照（实心圈，η = 29)、NC siRNA/对照（空心圈，η = 28)、NC siRNA/apoCIII (实心三角形，η = 28)、β 1整联蛋白siRNA/对照（空心三角形，η =29)和β 1整联蛋白siRNA/ApoCIII (实心方形，η = 29)的细胞中，Ca2+电流密度-电 压的关系。与无 siRNA/对照，NC siRNA/对照和β 1整联蛋白siRNA/对照比，*Ρ〈0. 05和 **Ρ〈0· 01。与 β 1 整联蛋白 siRNA/ApoCIII 比，+Ρ〈0· 05。
[0025] 图7.在RINm5F细胞中，敲除SRBI会防止全细胞Ca2+电流的、载脂蛋白CIII诱 导的增强。（a)在SRBI siRNA-和阴性对照siRNA (NC siRNA)-转染的细胞中，GAPDH-和 GAPDH-mRNA条带的代表性印迹。（b)在NC siRNA-(空心柱，η = 6)和SRBI siRNA-转染 的RINm5F细胞（实心柱，η = 6)中，SRBI蛋白质的定量免疫印迹测量。与NC siRNA比， **Ρ〈0. 01。（c)在 SRBI siRNA-和阴性对照 siRNA (NC siRNA)-转染的细胞中，SRBI-和 GAPDH-免疫反应条带的样品印迹。（d)在NC siRNA-(空心柱，η = 7)和SRBI siRNA-转染 的 RINm5F 细胞（实心柱，η = 7)中，SRBI mRNA 的定量。与 NC siRNA 比，**Ρ〈0· 01。（e) 分别在模拟转染和与对照媒介物温育（无 siRNA/对照，细胞电容：13. 87pF)、NC siRNA转 染和对照媒介物处理（NC siRNA/对照，细胞电容：13. 18pF)、NC siRNA转染和载脂蛋白 CIII(ApoCIII)温育（NC siRNA/ApoCIII，细胞电容：13.53pF)、SRBI siRNA 转染和暴露于 媒介物溶液（SRBI siRNA/对照，细胞电容：12. 90pF)、以及SRBI siRNA转染和ApoCIII暴露 (SRBI siRNA/ApoCIII，细胞电容：13. OlpF)后，由单个细胞得到的代表性全细胞Ca2+电流 追踪。（f)在经历无 siRNA/对照（实心圈，η = 30)、NC siRNA/对照（空心圈，η = 29)、NC siRNA/apoCIII (实心三角形，η = 30)、SRBI siRNA/ 对照（空心三角形，η = 29)和 SRBI 以1^^/^?〇(：111(实心方形，11 = 30)的细胞中，0&2+电流密度-电压的关系。与无以1^^/对 照，从：811?熟/对照和51?1811?熟/对照比，扑〈0.05和*扑〈0.01。与51?1811?熟/^口〇(：111 比，+P〈0. 05。
[0026] 图8.在基础条件下，在RINm5F细胞中，PKA、PKC或Src激酶抑制不会改变全细胞 Ca2+电流。（a)由媒介物处理的细胞（作为对照）（细胞电容：8. 8pF)和暴露于H-89的细 胞（细胞电容：8. 5pF)得到的样品全细胞Ca2+电流追踪。（b)在对照细胞（空心圈：η = 20)和与Η-89温育的细胞（实心圈，η = 20)中，平均Ca2+电流密度-电压的关系。（c)在 对照细胞（细胞电容：10. 4pF)和经过卡弗他丁 C温育的细胞（CalpC，细胞电容：11. OpF) 中记录的样品全细胞Ca2+电流追踪。（d)在对照细胞（空心圈：η = 29)和暴露于CalpC的 细胞（实心圈，η = 29)中平均Ca2+电流密度-电压的关系。（e)在对照细胞（细胞电容： 9. OpF)和PP2-处理的细胞（细胞电容：9. IpF)中获得的样品全细胞Ca2+电流追踪。（f) 在对照细胞（空心圈m = 20)和与PP2温育的细胞（实心圈，η = 19)中的平均Ca2+电流 密度-电压的关系。
[0027] 图9.在基础条件下，在RINm5F细胞中，PKA、PKC和Src激酶的结合抑制、或者PKA 和Src激酶的共抑制不会影响全细胞Ca2+电流。（a)由与媒介物溶液温育的细胞（对照，细 胞电容：10. 8pF)中、以及在使用H-89,卡弗他丁 C和PP2的蛋白质激酶抑制剂混合物处理 的细胞（H_89/CalpC/PP2,细胞电容：9. 7pF)中获得的样品全细胞Ca2+电流追踪。（b)在对 照细胞（空心圈：η = 30)和使用H-89/CalpC/PP2处理的细胞（实心圈，η = 30)中，平均 Ca2+电流密度-电压的关系。（c)在媒介物处理的细胞（对照，细胞电容：9. 4pF)中和使用 蛋白质激酶抑制剂H-89和PP2处理的细胞（H-89/PP2,细胞电容：9. IpF)中获得的样品全 细胞Ca2+电流追踪。（d)在对照细胞（空心圈：η = 24)和使用H-89/PP2处理的细胞（实 心圈，η = 24)中，平均Ca2+电流密度-电压的关系。
[0028] 发明详述
[0029] 所述的所有参考文献均以引用方式全文并入本文。在本申请中，除非另外说 明，否则所用的技术可以在多个公知的参考文献的任意一个中找到，例如：Mo I e c u I ar Cloning:A LaboratoryManual(Sambrook, et al. , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology(Methods in Enzymology, Vol. 185,edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification''in Methods in Enzymology(M. P. Deutshcer, ed. , (1990)Academic Press, Inc.) ；PCR Protocols : A Guide to Methods andApplications(Innis, et al. 1990.Academic Press, San Diego, CA), Culture ofAnimal 细胞 s: A Manual of Basic Technique, 2ndEd. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc. , Clifton, N. J.),和 theAmbion 1998Catalog(Ambion, Austin, TX)〇
[0030] 除非上下文另外明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语"comprise"、 "comprising"等解释成包含一切的含义，这与专用的或详尽的含义相反，换言之，是"包含 但不限于"的含义。此外，使用单数或复数的词语分别包含复数或单数的数量。此外，当词 语"此处"、"上文"和"下文"以及类似意义的词语用于本申请中时，将是指本申请作为一个 整体，而不是指本申请的任何特定的部分。
[0031] 如本文所用，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式"a"、"an"和"the"包含 复数指示物。如本文所用，除非另外明确说明，否则"和"与"或"可交换使用。
[0032] 除非上下文另外清楚地指出，否则本发明的任何方面的所有实施方案都可以结合 使用。
[0033] 在第一个方面中，本发明提供