BI/β 1整联蛋白-依赖的、PKA 和Src的共活化而过度活化β细胞CavI通道
[0084] 结果
[0085] 载脂蛋白CIII增加了 β细胞的CaVl通道的密度和传导性。我们之前的工作表 明在小鼠小岛β细胞中，Ap0CIII温育显著增强了全细胞Ca2+电流5。为了弄清β细胞 Cav通道的类型以及密度或传导性是否受影响，我们在小鼠小岛β细胞（图la)和RINm5F 细胞（图lc)中在ApoCIII温育后中分析了单位CavI通道电流，其表征为单位Ba2+的传导 系数更大，并且开放延长。在使用小鼠小岛β细胞的试验中，我们观察到在Ap0CIII处理 的细胞的质膜片中比那些对照细胞中具有更多的CavI通道，这可通过更多层的单位Ba2+电 流所反映（图la)。在ApoCIII处理的细胞（η = 32)中，单位CavI通道的平均数量、开放 几率和平均开放时间比暴露于对照媒介物的细胞（η = 33)的那些明显更高（图lb)。在 ApoCIII温育的细胞的质膜片中所记录的单位CavI通道的平均关闭时间比对照质膜片的平 均关闭时间明显更短（图lb)。同样，ApoCIII的相似的作用发生在胰岛素分泌RINm5F细 胞的CavI通道上。与媒介物处理的细胞相比，ApoCIII温育的细胞的质膜片容纳了更多的 CavI通道（图Ic)。在ApoCIII温育的细胞的质膜片中的CavI通道比媒介物处理的细胞的 CavI通道更频繁地开放（图Ic)。与使用媒介物溶液的温育（η = 34)相比，ApoCIII温育 (η = 35)显著地增加了 CavI通道的通道数量、提高了开放几率、延长了平均开放时间和缩 短了平均关闭时间（图Id)。显然，数据表明ApoCIII增加了 β细胞CavI通道的密度和传 导性。
[0086] 药理学消除CavI通道会防止β细胞Cav通道发生载脂蛋白CIII诱导的过度活 化。通过单一通道分析证明ApoCIII对CavI通道的作用并非一定是指ApoCIII仅攻击CavI 通道。为了检查所述的作用是否还发生在其他类型的Cav通道上，我们在CavI通道阻断剂 尼莫地平缺乏和存在下，分析了在ApoCIII温育后的RINm5F细胞中的全细胞Ca2+电流。在 与ApoCIII温育的细胞中的全细胞Ca2+电流比使用媒介物溶液处理的细胞的电流更大（图 2a)。在ApoCIII组中观察到电压范围为10至30mV的全细胞Ca2+电流密度比对照组中的 电流密度明显更高（图2b)。显著相反的是，在尼莫地平存在下，在对照细胞和与ApoCIII 温育的细胞之间，全细胞Ca2+电流是相似的（图2c)。在2种处理之间，全细胞Ca 2+电流密 度无显著性差异（图2d)。所述的数据证明ApoCIII仅作用于β细胞CavI通道。
[0087] 载脂蛋白CIII通过PKA和Src激酶的共活化而使β细胞0&、通道过度活化。β 细胞CavI通道通过ApoCIII的作用而使得开放几率增加、以及蛋白质激酶在ApoCIII信号 传递中的调节作用表明ApoCIII可能向一些蛋白质激酶的上游发出信号，从而过度活化β 细胞Cav通道16'1922。因此，我们探索了 PKA、PKC和Src激酶在β细胞Cav通道的ApoCIII 诱导的过度活化中的关联。
[0088] 首先，我们检查了在RINm5F细胞中，PKA抑制剂H-89对β细胞Cav通道的ApoCIII 诱导的过度活化的作用。在对照细胞中登记的全细胞Ca2+电流比在使用Ap0CIII处理的细 胞的电流更高，而在使用Ap0CIII加 H-89温育的细胞中记录的全细胞Ca2+电流大小在2者 之间（图3a)。在10至50mV的电压下，在ApoCIII处理的细胞中测量的平均Ca2+电流密 度（实心圈，η = 36)比在媒介物处理的对照细胞中的电流密度（空心圈，η = 36)明显更 高（图3b)。但是，ApoCIII和Η-89共处理后的细胞（实心三角形，η = 36)在Ca2+电流密 度方面与使用ApoCIII处理的细胞或对照细胞无显著性差异（图3b)。此外，在基础条件 (即在ApoCIII缺乏下）下，H-89处理不会显著影响Ca2+电流密度（图8a，b)。结果表明 PKA抑制会少量地降低β细胞Cav通道的ApoCIII诱导的过度活化。
[0089] 第二，我们测试了在RINm5F细胞中，PKA抑制剂卡弗他丁 C(CalpC)对β细胞Cav通道的ApoCIII诱导的过度活化的作用。我们观察到与ApoCIII温育的细胞和ApoCIII/ CalpC共处理的细胞展示出相似的全细胞Ca2+电流，该电流比在媒介物处理的细胞中所获 得的电流更大（图3c)。与媒介物处理的对照细胞（空心圈，η = 33)相比，在10-50mV电 压下在ApoCIII处理的细胞（实心圈，η = 33)中和在20至50mV电压下暴露于ApoCIII/ CalpC的细胞（实心三角形，η = 33)中的平均Ca2+电流密度显著升高（图3d)。就Ca2+电 流密度而言，在ApoCIII处理的细胞与ApoCIII/CalpC共处理的细胞之间无差异（图3d)。 此外，在Ca2+电流密度方面，暴露于对照媒介物的细胞与CalpC处理的细胞相似（图8c，d)。 这些数据证明PKC抑制不会影响β细胞Cav通道的ApoCIII诱导的过度活化。
[0090] 第三，我们评价了在RINm5F细胞中Src激酶抑制剂PP2对β细胞Cav通道的 ApoCIII诱导的过度活化的作用。我们分别在与媒介物溶液温育后的细胞和ApoCIII温 育的细胞中发现更小和更大的全细胞Ca2+电流（图3e)。就全细胞Ca2+电流而言，暴露于 ApoCIII和PP2的细胞落入了媒介物对照细胞和使用ApoCIII处理的细胞之间（图3e)。 与在媒介物对照细胞（空心圈，η = 40)中测定的全细胞Ca2+电流密度相比，在10-50mV电 压下使用ApoCIII处理的细胞（实心圈，η = 40)中定量得到的全细胞Ca2+电流密度明显 升高（图3f)。与媒介物处理的对照细胞（空心圈，η = 40)相比，经历ApoCIII和ΡΡ2共 处理的细胞（实心三角形，η = 40)在20-40mV的电压下显示明显更高的Ca2+电流。但是， Ap〇CIII/PP2共处理的细胞和与媒介物溶液温育的细胞之间的Ca2+电流密度的差异不如使 用ApoCIII处理的细胞与媒介物处理的对照细胞之间的差异那样突出（图3f)。此外，媒介 物处理的细胞（空心圈，η = 20)和与PP2温育的细胞（实心圈，η = 19)展现出相似的Ca2+电流密度（图8e，f)。所述的结果表明Src激酶抑制具有降低β细胞Cav通道的ApoCIII 诱导的过度活化的趋势。
[0091] PKA、PKC或Src激酶抑制剂对β细胞Cav通道的、ApoCIII诱导的过度活化的微 小及零值作用使我们好奇如果对所有这些激酶施加更复杂的抑制会发生什么。为了解决该 问题，我们表征了在RINm5F细胞中蛋白质激酶抑制剂混合物H-89、CalpC和PP2对β细胞 Cav通道的ApoCIII诱导的过度活化的作用。在ApoCIII处理的细胞中显示较大的全细胞 Ca2+电流，而在H-89, CalpC和PP2存在下，在媒介物处理的对照细胞和使用ApoCIII处理的 细胞中，形成较小的全细胞Ca2+电流（图4a)。与媒介物处理的对照细胞（空心圈，η = 35) 以及ApoCIII与H-89，CalpC和ΡΡ2-起的处理（实心三角形，η = 34)相比，在10-50mV 的电压下，ApoCIII处理（实心圈，η = 35)会显著地增加 Ca2+电流密度。在H-89, CalpC 和PP2存在下，在暴露于Ap0CIII的细胞中，Ca2+电流密度的图谱与媒介物处理的对照细胞 相似（图4b)。此外，在基础条件（即Ap0CIII缺乏下）下，使用蛋白质激酶抑制剂混合物 H-89, CalpC和PP2处理对照细胞对全细胞Ca2+电流无显著影响（图9a，b)。结果证明PKA、 PKC和Src激酶的结合抑制会有效地消除β细胞Cav通道的Ap0CIII诱导的过度活化。
[0092] PKA或Src激酶抑制剂单独地对全细胞Ca2+电流的微小作用不可避免地提出了这 样的问题：PKA和Src激酶的共抑制是否足以防止β细胞Cav通道的Ap0CIII诱导的过度 活化。我们通过分析经过Η-89和ΡΡ2的共处理后的RINm5F细胞中的全细胞Ca2+电流来回 到上述问题。我们观察到在ApoCIII处理的细胞中全细胞Ca2+电流比对照细胞或在H-89和 PP2存在下经历Ap0CIII处理的细胞中的电流更大（图4c)。与对照组（空心圈，η = 26) 或在Η-89和ΡΡ2存在下经历ApoCII I温育的组（实心三角形，η = 27)相比，在ApoCII I组 (实心圈，n = 26)中显示全细胞Ca2+电流的密度显著更高（图4d)。此外，对照细胞中全 细胞Ca2+电流与在使用H-89和PP2处理的细胞中所观察到的电流相似（图9c，d)。这些 数据表明Ap0CIII通过PKA或Src激酶的共活化而增强全细胞Ca2+电流。
[0093] 载脂蛋白CIII不影响β细胞CavI通道的表达。与Ap0CIII过夜温育可以影响β 细胞CavI通道的表达。为了测试这种可能性，我们在ApoCIII温育后的RINm5F细胞中分析 β细胞CavI通道的表达。我们发现抗CavL 2、抗CavL 3和抗GAPDH抗体分别检测到清楚 的CavL 2、CavL 3和GAPDH免疫反应条带。对照和ApoCIII处理的样品给出相似的CavL 2、 CavL 3和GAPDH免疫反应性的强度（图5a)。图5b显示在经历ApoCIII温育的RINm5F细 胞匀浆中，与媒介物温育的细胞（空心柱，η = 6)相比，CavL 2 (条纹柱，η = 6)和CavL 3 亚单元（实心柱，η = 6)的相对丰度无显著性差异（Ρ>0. 05)。所述的数据表明ApoCIII温 育未在蛋白质水平下改变β细胞CavI通道的表达。
[0094] 载脂蛋白CIII通过β 1整联蛋白上调节β细胞Cav通道。已经证明β 1整联蛋 白在ApoCIII和某些数量的蛋白质激酶（包含PKA和Src激酶）之间起到中介物的作用16，19 22。这与我们的上述结果（ApoCIII通过PKA和Src激酶的共活化而过度活化β细胞 Cav通道）一起提出这样的可能性：β?整联蛋白介导了 β细胞Cav通道的ApoCIII诱导的 过度活化。我们通过在RINm5F细胞中实施RNA干扰并结合全细胞Ca2+电流分析来调查上 述可能性。证明使用2种β 1整联蛋白SiRNA的转染会在蛋白质水平显著降低β 1整联蛋 白的表达（图6a，b)。重要的是，β 1整联蛋白SiRNA预转染会有效地防止β细胞Cav通道 的ApoCII I诱导的过度活化（图6c，d)。在β 1整联蛋白siRNA预转染的细胞（与ApoCII I 温育）（β 1整联蛋白siRNA/ApoCIII)中的全细胞Ca2+电流比暴露于ApoCIII的阴性对照 siRNA预传染的细胞（NC siRNA/apoCIII)的电流明显更小，但是与3组对照细胞的电流相 似（图6c)。这些对照细胞分别经历了模拟（无 siRNA/对照）、阴性对照siRNA (NC siRNA/ 对照）和β 1整联蛋白siRNA预转染（β 1整联蛋白siRNA/对照），然后与对照媒介物温育 (图 6c)。在 β 1 整联蛋白 siRNA/ApoCIII 之后的细胞（η = 29)中，与 NC siRNA/apoCIII 后的那些细胞（实心三角形，η = 28)相比，观察到显著降低的Ca2+电流密度（图6d)。在 β 1整联蛋白siRNA/ApoCIII之后的细胞显示相似的Ca2+电流密度，但是NC siRNA/apoCIII 后的那些细胞展现出比经历无 siRNA/对照（η = 29)，NC siRNA/对照（η = 28)或β 1整 联蛋白siRNA/对照（η = 29)的那些细胞更大的Ca2+电流密度（图6d)。综上，结果证明 ApoCIII严重地依赖于β 1整联蛋白来过度活化β细胞Cav通道。
[0095] 载脂蛋白CIII通过SRBI过度活化β细胞Cav通道。之前的研究显示ApoCIII与 β 1整联蛋白无直接的相互作用16'18。在寻找Ap0CIII与β 1整联蛋白之间的分子桥梁中， 我们的兴趣集中在SRBI上，因为该受体与Ap0CIII是生理相关的，并且与β 1整联蛋白相 互作用1(：'23。我们将siRNA介导的基因沉默与全细胞Ca2+电流分析结合来检查SRBI在过度 活化β细胞CavI通道中在Ap0CIII与β?整联蛋白之间是否可以起到分子桥梁的作用。 如图7a，b，c，d所示，在RINm5F细胞中，SRBI siRNA转染会在mRNA和蛋白质水平上显著降 低SRBI。重要的是注意到此类下调节通过Ap0CIII显著消除了全细胞Ca2+电流的增强（图 7e，f)。图7e显示与预转染有阴性对照siRNA的那些细胞（然后经历ApoCIII暴露（NC siRNA/apoCIII))相比，与 ApoCIII 温育的 SRBI siRNA预转染细胞（SRBI siRNA/ApoCIII) 展现更小的全细胞Ca2+电流。在经历SRBI siRNA/ApoCIII的细胞中的全细胞Ca2+电流并 未与分别经历模拟（无 iRNA/对照），阴性对照siRNA (NC siRNA/对照）和SRBI siRNA预 转染（SRBI siRNA/对照）的对照媒介物处理的细胞中的电流不同（图7e)。相反，在NC siRNA/apoCIII处理的细胞中的全细胞Ca2+电流比在之前提及的对照细胞中所见的电流更 大（图7e)。与NC siRNA/apoCIII组中的Ca2+电流密度（实心三角形，η = 30)相比，SRBI siRNA/ApoCIII 组（η = 30)中的 Ca2+电流密度明显降低（图 7f)。SRBI siRNA/ApoCIII 组 中的 Ca2+电流密度与无 siRNA/ 对照（η = 30)，NC siRNA/ 对照（η = 29)或 SRBI siRNA/ 对照（η = 29)的电流密度相似，但是NC siRNA/apoCIII组中的Ca2+电流密度明显比它们 更高（图7f)。数据证明ApoCIII使用SRBI作为不可缺少的传送者用于将信号由所述的载 脂蛋白传递至β细胞Cav通道。
[0096] 讨论
[0097] Cav通道的总传导性取决于细胞质膜中功能通道的密度和活性。1型糖尿病血清的 全细胞Ca2+电流及其因子ApoCIII的增强可以产生于β细胞质膜中功能Cav通道的富集密 度和/或增加的传导性4,5。但是，到目前为止，除了一个研究4以外的所有研究u 5,24仅在 全细胞水平下检查了 1型糖尿病血清对Cav通道的作用。在Juntti-Berggren等人的研究 中，在单一的通道和全细胞水平下表征了 1型糖尿病血清的β细胞〇^通道活性的增加4。 但是，该著作并未分析1型糖尿病血清是否能够改变β细胞质膜中功能Cav通道的密度4。 尽管我们之前表明ApoCIII作为1型糖尿病血清的因子而过度活化β细胞Cav通道，但是 但是仅实施了全细胞膜片钳分析5。毋庸置疑，应该在ApoCIII处理的细胞中对单一的Cav通道的生物物理学性质实施详细的检查，从而机械性地剖析这种载脂蛋白对β细胞〇^通 道的过度活化。有趣的是，在本著作中的细胞附着的单一通道记录表明与ApoCIII温育不 仅增强了单个β细胞CavI通道的活性，而且富集了 β细胞质膜的记录区域中的功能CavI 通道的数量。由于开放几率的增加有助于平均开放时间的延长和平均关闭时间的缩短，所 以可见单一 CavI通道的活性的增强。通过更高水平的单一 CavI通道传导系数的外观，可以 证明功能CavI通道的数量的富集。
[0098] 胰岛素分泌RINm5F细胞装配有CavI, Cav2和Cav3通道我们调查了在这种胰 岛素分泌细胞中，ApoCIII是否选择性地过度活化了 CavI通道或者随意地影响了所有这3 种类型的Cav通道。证明β细胞Cav通道的ApoCIII诱导的过度活化在药理学消除Ca vI通 道后不再发生。这意味着ApoCIII选择性地过度活化了 CavI通道，这是在β细胞生理学或 病理生理学中比其他类型的Cav通道起主要作用的主要的Ca ￥通道类型。通过ApoCIII选 择性地过度活化β细胞CavI通道说明了这种载脂蛋白在Ca2+依赖的β细胞死亡中的病 例病理生理学作用u'5。
[0099] -系列的蛋白质激酶（例如PKA和PKC)可以选择性地磷酸化Cav通道，使得这些 通道中由于磷酸化诱导的构造改变而使开放通道的密度和活性增加3'25'26。通过Ap 0CIII而 使得功能Cav通道的数量和开放几率增加可以通过蛋白质激酶来介导。已经证明Ap0CIII 在单核细胞中通过β 1整联蛋白来活化PKC16。此外，β 1整联蛋白的活化还通过刺激ΡΚΑ、 PKC和Src激酶而上调节了神经元、心室肌细胞和血管平滑肌细胞的CavI通道19 22。所有 这些成分都存在于β细胞中2'273°，并且可以表明Ap0CIII采用了 β?整联蛋白-PKA/PKC/ Src激酶级联而过度活化β细胞Cav通道。实际上，本著作显示PKA，PKC和Src激酶的复 合抑制会有效地消除β细胞Cav通道的Ap0CIII诱导的过度活化，并且PKA和Src激酶的 共抑制足以起到上述作用。但是，PKA，PKC或Src激酶的单个抑制仅对β细胞Cav通道的 Ap0CIII诱导的过度活化产生（如果可能）微小的作用。因此，我们推断Ap0CIII依赖于平 行PKA和Src途径来上调节β细胞Cav通道。
[0100] 发生β细胞Cav通道的Ap0CIII诱导的过度活化需要过夜温育。因此，所述的作 用可以通过〇&、通道表达的增加来说明。因此，我们在与Ap0CIII过夜温育的RINm5F细胞 中对CavL 2和CavL 3的免疫反应性进行了定量。但是，所述的温育对β细胞CavI通道的 表达无影响。因此，我们推断出Ap0CIII升高β细胞CavI通道表达的可能性。
[0101] 跨膜受体β 1整联蛋白与其他整联蛋白非共价结合，从而形成一组异源二聚体。 它们识别了大量的可溶性且表面结合的蛋白质，从而介导了细胞-细胞、细胞-细胞外基 质、以及细胞-病原体的相互作用31。在一些细胞类型中，β?整联蛋白位于Ap0CIII的下 游，PKA/PKC/Src激酶的上游16'19 22。这使我们调查ApoCIII-β 1整联蛋白-PKA/PKC/Src 激酶途径在β细胞是否作为机制而工作，由此该载脂蛋白过度活化CavI通道。有趣的是， 在缺乏Ap0CIII的情况下，敲除β?整联蛋白不会影响β细胞Cav通道的活性，但是会显 著消除β细胞Cav通道的Ap0CIII诱导的过度活化。该结果清楚地证明β?整联蛋白在 介导Ap0CIII对β细胞CavI通道活性作用中起重要的作用。
[0102] 尽管β 1整联蛋白可以将Ap0CIII与相应的下游效应器PKA，PKC和Src激酶偶 联，但是β 1整联蛋白不可能与该载脂蛋白直接作用16'19 22。在本研究中，我们证明SRBI在 Ap0CIII和β?整联蛋白之间起到分子桥梁的作用，这是因为SRBI基因沉默会有效地使β 细胞Cav通道的ApoCIII诱导的过度活化失效。这产生了 β细胞Cav通道过度活化的新级 联的完整图画，即ApoCIII-SRBI-β 1整联蛋白-PKA/Src。
[0103] 当将细胞去极化至比+IOmV更高的正电势时，发生了在本著作中观察到的β细胞 CaVl通道的Ap0CIII诱导的过度活化。在试验条件下，通过使用穿孔的全细胞膜片钳记录 模式来检测ApoCIII的作用，其中所述的条件下将IOmM Ca2+加入至细胞外溶液中，从而获 得最佳的Ca2+电流。与细胞外Ca2+的生理性浓度（2. 5mM)相比，如此高的细胞外Ca2+的 浓度可以显著地将I-V曲线迀移至更高的正电势。穿孔全细胞膜片钳记录模型具有相似的 作用。因此，在体内条件下，ApoCIII在生理学质膜电势范围内可能影响β细胞CaVl电流。
[0104] 综上所述，我们的发现证明ApoCIII通过平行的PKA和Src激酶途径以SRBI/ β 1 整联蛋白依赖的方式选择性地过度活化β细胞CavI通道。β细胞CavI通道的ApoCIII诱 导的过度活化表征为在β细胞的质膜中，功能CavI通道的富集密度和增加的活性。这种新 的信号传导途径可以作为新型药品发现平台而用于防止与糖尿病有关的Ca2+依赖的β细 胞死亡。
[0105] 方法
[0106] 细胞培养和处理。由成年雄性小鼠和雌性小鼠分离胰岛并分散成单一的β细胞。 将融合率为大约70%的RINm5F细胞进行胰蛋白酶作用。将得到的细胞悬液接种至Petri 培养皿或12孔板中。将细胞在补充有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100U/100yg/ ml青霉素/链霉素（Invitrogen，Carlsbad, CA)的RPMI 1640培养基中培养，并在潮湿 的5% C0J?化器中保持在37°C下。它们过夜生长，然后经过siRNA转染。对于膜片 钳分析而言，使用 ApoCIII，PKA 抑制剂 H-89 (Calbiochem，Lajolla，CA)，PKC 抑制剂卡 弗他丁 C(Calbiochem), Src激酶抑制剂PP2(Calbiochem)和CavI通道阻断剂尼莫地平 (Calbiochem)(在 RPMI 培养基中，最终浓度分别为 20μg/ml，0. 5μΜ，0. ΙμΜ,Ο. ΙμΜ 和 5μM)对细胞进行过夜处理。将ApOCIII溶解于0.1