了用于识别限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候 选化合物的方法，其包含：
[0034] (a)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第一群体与有效增加 Cav通道的密度和/或传导性的量的载脂蛋白CIII (Ap0CIII)相接触；
[0035] (b)在一种或多种测试化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第二群体与有效增加 Cav通道的密度和/或传导性的量的Ap0CIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第二 群体与抑制B族I型清道夫受体（SRBI)的表达或活性的分子相接触；以及
[0036] (c)识别阳性测试化合物作为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的候选化 合物，其中所述的化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第二群体 中更高程度地抑制了 Cav通道的密度和/或传导性的、Ap0CIII诱导的增加。
[0037] 本发明人发现在单一的通道水平下，Ap0CIII温育导致CavI通道开放几率和密度 显著增加。所述的处理显著地增强了全细胞Ca2+电流，并且Ca V1通道阻断剂尼莫地平完全 废除了这种增强。本发明人进一步发现敲除B族I型清道夫受体（SRBI)会防止Ap0CIII过 度活化β细胞Cav通道。因此，SRBI的抑制剂应该下调节了本发明的阳性候选化合物。因 此，所述的这些阳性测试化合物为用于限制糖尿病发展和/或治疗糖尿病的候选化合物， 其中所述的化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第二群体中更 高程度地抑制了 CavI通道的密度和/或传导性的、Ap0CIII诱导的增加。因此，本发明这一 方面的方法可以用于识别以特定的方式限制Ca2+-依赖的胰腺β细胞死亡并由此限制糖尿 病的发展和/或治疗糖尿病的化合物。
[0038] 如本文所用，"apoCIII"是指包含在SEQ ID Ν0:2(人类）（NCBI编号 CAA25233), SEQ ID Ν0:4(大鼠 ）（NCBI 编号），或 SEQ ID Ν0:6(恒河猴）（NCBI 编号 CAA48419)中所示的氨基酸序列的蛋白质或其功能等价物。
[0039] apoCIII 可以为得自例如 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO)的基本纯的 apoCIII，其中"基本纯的"是指其由其正常的体内细胞环境中移出。备选地，apoCIII可以 以混合物（例如由1型糖尿病得到的血清）或者使用标准的技术由所述的血清得到的部 分或完全纯化的形式存在，例如下文所述的那些。在优选的实施方案中，可以使用基本纯的 apoCIII〇
[0040] 如下文所讨论，有3种已知亚型的人类apoCIII，它们具有相同的氨基酸序列，但 是它们的糖基化方式不同。因此，在优选的实施方案中，使用糖基化的apoCIII，其中所述的 糖基化优选为唾液酸化作用。在另一个优选的实施方案中，使用单唾液酸化的或二唾液酸 化的apoCIII。此类糖基化形式可以购自例如Sigma Chemical Company，或者可以使用标 准的技术部分或完全纯化的，例如下文所述的那些。
[0041] 还称为SR-BI的B族I型清道夫受体（SRBl)是由SCARBl基因编码的。SRBI最众 所周知的是其在促进肝脏中由高密度脂蛋白中吸收胆固醇酯中的作用。
[0042] 人类SRBI的氨基酸序列在SEQ ID N0:9中提供。示例性的cDNA核苷酸序列在 SEQ ID NO: 10 中提供。
[0043] 抑制SRBI表达（RNA或蛋白质）或活性（包含但不限于SRBI阻断）的任何合 适的分子都可以用于本发明的方法中，包含但不限于抗SRBI抗体，抗SRBI适体，SRBI siRNA，SRBI shRNA，SRBI反义寡核苷酸，和小分子SRBI抑制剂。抗SRBI抗体可得自 多个商业供应商，包含ThermoFisher, Epitomics和OriGene。在一个实施方案中，所述 的抑制剂包含干扰素 α，其已经显示会抑制SRBI的表达（Gut. 2008May ;57 (5) :664-71. Epub 2007N〇V 12)。在另一个实施方案中，SRBI抑制剂包含N-[4-(4-叔丁氧基羰基哌 嗪-1-基）苯基]-(2-氯代-5-硝基苯基）甲酰胺（R-138329)，其已经显示会阻断SRBI 受体的活性（J Pharm Pharmacol.2006Dec;58(12):1629-38)。在另一个实施方案中， SRBI抑制剂包含2-己基-1-环戊酮缩氨基硫脲，33M20, BLT1，脂质转运阻断剂-1，CAS 编号321673-30-7(得自SigmaAldrich)。在另一个实施方案中，SRBI抑制剂为在US 20040171073(该文献以引用方式全文并入本文）中公开的任意一种或多种SRBI抑制剂； 这些化合物在US 20040171073申请（表1-2)中记录，其化合物编号为MIT 9952-1,9952 -2, 9952-3, 9952-4, 9952-5, 9952-6, 9952-7, 9952-8, 9952-9, 9952-10, 9952-11，9952-12, 9 952-13, 9952-14, 9952-15, 9952-16, 9952-17, 9952-18, 9952-19, 9952-20, 9952-21，9952-2 2, 9952-23, 9952-24, 9952-25, 9952-26, 9952-27, 9952-28, 9952-29, 9952-30, 9952-31，995 2-32, 9952-33, 9952-34, 9952-35, 9952-36, 9952-37, 9952-38, 9952-39, 9952-40, 9952-41， 9952-42, 9952-43, 9952-44, 9952-45, 9952-46, 9952-47, 9952-48, 9952-49, 9952-50, 9952- 51，9952-52, 9952-53, 9952-54, 9952-55, 9952-56, 9952-57, 9952-58, 9952-59, 9952-60, 99 52-61，9952-62, 9952-63, 9952-64, 9952-65, 9952-66, 9952-67, 9952-68, 9952-69, 9952-70 ，9952-71，9952-72, 9952-73, 9952-74, 9952-75, 9952-76, 9952-77, 9952-78, 9952-79, 9952 -80, 9952-81，9952-82, 9952-83, 9952-84, 9952-85, 9952-86, 9952-87, 9952-88, 9952-89, 9 952-90, 9952-91，9952-92, 9952-93, 9952-94, 9952-95, 9952-96, 9952-97, 9952-98, 9952-9 9, 9952-100, 9952-101，9952-102, 9952-103, 9952-104, 9952-105, 9952-106, 9952-107, 995 2-108, 9952-109, 9952-110, 9952-111，9952-112, 9952-113, 9952-114, 9952-115, 9952-116 ，9952-117, 9952-118, 9952-119, 9952-120, 9952-121，9952-122, 9952-123, 9952-124, 9952 -125, 9952-126, 9952-127, 9952-128, 9952-129, 9952-130, 9952-131，9952-132, 9952-133， 9952-134, 9952-135, 9952-136, 9952-137, 9952-138, 9952-139, 9952-140, 9952-141, 9952- 142, 9952-143, 9952-144, 9952-145, 9952-146, 9952-147, 9952-148, 9952-149, 9952-150, 9 952-151，9952-152, 9952-153, 9952-154, 9952-155, 9952-156, 9952-157, 9952-158, 9952-1 59, 9952-160, 9952-161，9952-162, 9952-163, 9952-164, 9952-165, 9952-166, 9952-167, 99 52-168, 9952-169, 9952-170, 9952-171，9952-172, 9952-173, 9952-174, 9952-175, 9952-17 6, 9952-177, 9952-178, 9952-179, 9952-180, 9952-181，9952-182, 9952-183, 9952-184, 995 2-185, 9952-186, 9952-187, 9952-188, 9952-189, 9952-190, 9952-191，9952-192, 9952-193 ，9952-194, 9952-195, 9952-196, 9952-197, 9952-198, 9952-199, 9952-200, 9952-201，9952 -202, 9952-203, 9952-204, 9952-205, 9952-206, 9952-207, 9952-208, 9952-209, 9952-210， 9952-211, 9952-212, 9952-213, 9952-214, 9952-215, 9952-216, 9952-217, 9952-218, 9952- 219, 9952-220, 9952-221，9952-222, 9952-223, 9952-224, 9952-225, 9952-226, 9952-227, 9 952-228, 9952-229, 9952-230, 9952-231，9952-232, 9952-233, 9952-234, 9952-235, 9952-2 36, 9952-237, 9952-238, 9952-239, 9952-240, 9952-241，9952-242, 9952-243, 9952-244, 99 52-245, 9952-246, 9952-247, 9952-248, 9952-249, 9952-250, 9952-251，9952-252, 9952-25 3, 9952-254, 9952-255, 9952-256, 9952-257, 9952-258, 9952-259, 9952-260, 9952-261，99 52-262, 9952-263, 9952-264, 9952-265, 9952-266, 9952-267, 9952-268, 9952-269, 9952-27 0, 9952-271，9952-272, 9952-273, 9952-274, 9952-275, 9952-276, 9952-277, 9952-278, 995 2-279, 9952-280, 9952-281，9952-282, 9952-283, 9952-284, 9952-285, 9952-286, 9952-287 ，9952-288, 9952-289, 9952-290, 9952-291，9952-292, 9952-293, 9952-294, 9952-295, 9952 -296, 9952-297, 9952-298, 9952-299, 9952-300, 9952-301，9952-302, 9952-303, 9952-304 ，9952-305, 9952-306, 9952-307, 9952-308, 9952-309, 9952-310, 9952-311，9952-312, 995 2-313, 9952-314, 9952-315, 9952-316, 9952-317, 9952-318, 9952-319, 9952-320, 9952-32 1，9952-322, 9952-323, 9952-324, 9952-325, 9952-326, 9952-327, 9952-328, 9952-329, 99 52-330, 9952-331，9952-332, 9952-333, 9952-334, 9952-335, 9952-336, 9952-337, 9952-3 38, 9952-339, 9952-340, 9952-341，和9952-342,或它们药物可接受的盐。本领域的任一 技术人员根据在US 20040171073申请（参见表1)中的化合物结构的教导，而能够容易地 识别基于本发明提供的化合物编号的化合物的结构。在一个实施方案中，所述的化合物为 9952-53, 9952-61，9952-19, 9952-29,和/或9952-6或者它们的药物可接受的盐中的一种 或多种。
[0044] 可以使用任何合适的胰岛素分泌细胞，包含但不限于胰腺β细胞。如本文所用， "胰腺β细胞"为包含胰腺β小岛细胞的任何细胞群体。该细胞可以得自任何哺乳动物 物种，或者可以存在于哺乳动物物种内（此时在体内实施检验）。此类胰腺β小岛细胞 群体包含胰腺、分离的胰腺胰岛（"胰腺小岛"）、分离的胰腺β小岛细胞和胰岛素分泌细 胞系。用于胰腺分离的方法是本领域公知的，并且用于分离胰腺小岛的方法可以在例如 Cejvan et al. , Diabetes 52:1176-1181 (2003) ；Zambre et al. , Biochem. Pharmacol. 57:1 159-1164 (1999) ,and Fagan et al·, Surgery 124:254-259(1998)以及本发明引用的文献 中找到。膜岛素分泌细胞系可得自 the American Tissue Culture Collection( "ATCC"） (Rockville, MD)。在其中使用胰腺β细胞的另一个实施方案中，它们得自ob/ob小鼠，在 该小鼠的小岛中包含超过95%的β细胞，并且是市售可得的。
[0045] 可以通过本领域标准的方法来测量CavI通道的密度和/或传导性，所述的方法包 含但不限于单一的通道和全细胞膜片钳测量（细胞附着的和穿孔的全细胞膜片钳技术）。 如本文所用，"增加 CavI通道的密度和/或传导性"是指在检验的过程中增加至在缺乏测试 化合物的情况下可见的水平之上。所述的方法不要求CavI通道的密度和/或传导性增加 至基线以上的特定的量，只要所述的化合物（多种）促进了 CavI通道的密度和/或传导性 增加至在缺乏测试化合物的情况下可见的水平之上即可。在优选的实施方案中，所述的增 加为具有统计学意义的增加，这可通过标准的统计分析来判断。
[0046] 胰岛素分泌细胞的第一群体与apoCIII相接触可以在所述的细胞与一种或多种 测试化合物相接触之前、之后或同时进行。相似地，胰岛素分泌细胞的第二群体与SBIR抑 制剂（多种）相接触可以在所述的细胞与一种或多种测试化合物相接触之前、之后或同时 进行。所述的接触可以为体外或体内（除了在试验动物模型中以外）。任何合适的培养条 件可以用于实施任意一种本发明的候选识别方法的方法；优选的是，相同的试验条件用于 细胞的第一群体和第二群体与apoCIII和一种或多种测试化合物的接触中，并且唯一不同 的是细胞的第二群体与SBIR(多种）的接触。在一个实施方案中，所述的细胞与Ap0CIII 接触至少6个小时。在另一个实施方案中，所述的细胞在包含ImM至15mM葡萄糖、优选为 3mM至12mM葡萄糖、优选为大约IlmM葡萄糖的培养基中生长。在另一个实施方案中，将所 述的细胞在大约37°C下培养（优选的是在潮湿的孵化器中，例如5% CO2)，然后在大约室温 下记录CavI通道的密度和/或传导性。本领域的任一技术人员根据本发明的教导，基于待 使用的特定检验的特性来测定适量的一种或多种测试化合物、和SBIR抑制剂（多种）。根 据本发明的教导，这些和其他合适的检验条件恰好在本领域那些技术人员的水平范围内。
[0047] 在一个实施方案中，候选化合物为用于限制1型糖尿病的发展和/或治疗1型糖 尿病的候选化合物。在另一个实施方案中，候选化合物为用于限制2型糖尿病的发展和/ 或治疗2型糖尿病的候选化合物。本发明进一步提供了通过上述筛选方法识别的化合物以 及它们用于治疗有需要的受试对象的用途。
[0048] 在另一个实施方案中，所述的方法进一步包含候选化合物的大规模合成，其中所 述的候选化合物在胰腺β细胞中会抑制CavI通道的密度和/或传导性的、apoCIII诱导的 增加。
[0049] 当测试化合物包含多肽序列时，此类多肽可以是化学合成的或重组表达的。重组 表达可以使用本领域标准的技术来完成，如上文所公开的那些。此类表达载体可以包含细 菌或病毒表达载体，并且此类宿主细胞可以为原核的或真核的。合成多肽（使用固相、液 相、肽缩合技术或它们任意的组合的公知的技术制备）可以包含天然或非天然氨基酸。用 于肽合成的氨基酸可以为具有标准的脱保护、中和、偶联和洗涤方案的标准的Boc (Να -氨 基保护的N α -叔丁氧基羰基）氨基酸树脂，或者标准的碱稳定性N α -氨基保护的9-芴基 甲氧基羰基（Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc Na -氨基保护的氨基酸可以得自Sigma, Cambridge ResearchBiochemical，或者本领域的那些技术人员所熟悉的其他化学公司。此外，可以使 用本领域那些技术人员所熟悉的其他Na -保护基团来合成所述的多肽。固相肽合成可以 通过本领域那些技术人员所熟悉的技术来完成，并通过例如使用自动化合成仪来提供。
[0050] 当测试化合物包含抗体时，此类抗体可以为多克隆或单克隆的。所述的抗体 可以是人源化的、全人类的或鼠科形式的抗体。此类抗体可以通过公知的方法来制备， 例 如 在 Harlow and Lane, Antibodies ;A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y·，（1988)中所述的那些。
[0051] 当测试化合物包含核酸序列时，此类核酸还可以是化学合成的或重组表 达的。重组表达技术是本领域的那些技术人员所公知的（例如参见Sambrook，et al.，1989, supra)。所述的核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。相似地，此 类核酸可以使用本领域标准的技术通过人工或自动化反应而化学或酶合成。如果核酸是化 学合成或体外酶合成的，则可以对该核酸进行纯化，然后引入至细胞中。例如可以通过溶剂 或树脂的提取、沉淀、电泳、色谱或它们的组合来由混合物纯化所述的核酸。备选地，对核酸 可以不进行纯化或进行最少量的纯化，以避免由于样品处理而导致的损失。
[0052] 当测试化合物包含除了多肽、抗体或核酸以外的化合物时，此类化合物可以通过 实施有机化学合成领域的多种方法的任意一种来制备。
[0053] 在一个实施方案中，所述的方法进一步包含在一种或多种候选化合物存在下，将 胰岛素分泌细胞的第三群体与有效增加 CavI通道的密度和/或传导性的量的Ap0CIII相 接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第三群体与Cav2和/或Cav3通道阻断剂相接触，其 中所述的候选化合物为用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，其中 所述的候选化合物在胰岛素分泌细胞的第三群体中比在胰岛素分泌细胞的第一群体中更 高程度地抑制了密度和/或传导性的、ApoCIII诱导的增加。在该实施方案中，Cav2和/或 Cav3通道阻断剂选择性地用于Cav2和/或Cav3通道，并且不会起到Ca vI通道阻断剂的作 用。合适的Cav2和/或Cav3通道阻断剂包含但不限于ω -agatoxin IVA，ω -芋螺毒素 GVIA 和SNX 482 (Cav2通道阻断剂）；以及咪拉地尔和NNC 55-0396 (Cav3通道阻断剂）。基于本 发明的教导来测定在给定检验中可以有效使用的任何Cav2和/或Cav3通道阻断剂（多种） 的量在本领域那些技术人员的水平范围内。
[0054] 在可以与本发明的任意一个实施方案结合的另一个实施方案中，所述的方法进一 步包含在一种或多种候选化合物存在下，将胰岛素分泌细胞的第四群体与有效增加 CavI通 道的密度和/或传导性的量的Ap0CIII相接触，并且进一步将胰岛素分泌细胞的第四群体 与Src激酶抑制剂和/或蛋白质激酶A(PKA)抑制剂相接触，其中所述的那些候选化合物为 用于限制糖尿病的发展和/或治疗糖尿病的优选候选化合物，所述的候选化合物在胰岛素 分泌细胞的第一群体中比在胰岛素分泌细胞的第四群体中更高程度地抑制了 CavI通道的 密度和/或传导性的、Ap0CIII诱导的增加。
[0055] 如以下实施例中所示，本发明人发现ApoCIII通过PKA和Src激酶的、SRBI/β 1 整联蛋白依赖的共活化而使β细胞CavI通道过度活化。因此，PKA和/或Src的抑制剂 应该下调节本发明的阳性候选化合物。因此，这些化合物为用于限制糖尿病的发展和/或 治疗糖尿病的优选候选化合物，其中所述的这些候选化合物在胰岛素分泌细胞的第一群体 中比在胰岛素分泌细胞的第四群体中更高程度地抑制了 CavI通道的密度和/或传导性的、 Ap0CIII诱导的增加。可以使用任何合适的PKA和/或Src激酶抑制剂，包含但不限于以下