核糖体蛋白s5在催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应中的用途的制作方法

专利名称：核糖体蛋白s5在催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及核糖体蛋白S5的新用途，具体地说，是核糖体蛋白S5在催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应中的用途。
背景技术：
核糖体蛋白S5 (Ribosomal protein S5, RPS5)是真核生物核糖体的重要组成部分，在蛋白质翻译方面起调控作用。大量文献报道，RPS5涉及细胞分化和凋亡的调节，RPS5表达异常与某些肿瘤的发生有关，具体可参见以下文献:(l)Tsiftsoglou AS, et al.Commitment of murine erythroleukemia (MEL) cells to terminal differentiationis associated with coordinated expression of globin and ribosomal genes.ProgClin Biol Res, 1982; 102 pt A: 69-79 ； (2) Vizirianakis IS, et al.Expressionof ribosomal protein S5 cloned gene during differentiation and apoptosis inmurine erythroIeukemia (MEL) cells.0ncol Res, 1999; 11: 409-419 ；(3)MatragkouCNj et al.The potential role of ribosomal protein S5 on cell cycle arrest andinitiation of murine erythroIeukemia cell differentiation.J Cell Biochem，2008;104: 1477-1490。可见，对细胞内RPS5结构和功能进行研究，进一步阐明RPS5在各种疾病中的作用机制，将为这些疾病的诊断和基因治疗开辟一个新的研究领域。但是目前关于RPS5具体作用机制的研究报道尚少，如中国期刊《解放军医学杂志》，2011年4月I日，第36卷，第4期，刊出的论文《核糖体蛋白S5的医学研究进展》指出“多数研究认为RPS5在氨基酸组成上很有特点，因含有大量精氨酸和赖氨酸而呈碱性，且碱性氨基酸较集中。该基因编码的117个氨基酸中碱性、酸性氨基酸各为22个(占18.8% )，碱性、酸性氨基酸都集中在某几个区域。这种中性的蛋白质在与其他蛋白质或基团结合时，非特异性结合明显降低；同时碱性、酸性氨基酸集中在某几 个区段，可能提高了特异性结合的水平，在功能上将表现为蛋白质之间结合的特异性增强，功能专一。RPS5蛋白不存在跨膜区，提示其不能作为膜受体起作用，也不可能是定位于膜的锚定蛋白或者离子通道等。”。而目前关于RPS5能够催化蛋白质分子脱磷酸的作用、RPS5与蛋白磷酸酶的关系国内外均未见报道。蛋白磷酸酶是具有催化磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。真核生物中的蛋白磷酸酶具有不同的结构和功能，根据其底物特异性和催化结构域可分为三类:第一类为酪氨酸蛋白磷酸酶类(protein tyrosine phosphatases, PTPs),包括酪氨酸蛋白磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶(dual specificity phosphatases, DSPs);第二类为磷酸化蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases, PPPs),含有催化亚基与多种调节亚基，代表性家族成员包括 PPl (protein phosphatase I )、PP2A、PP2B、PP4、PP5、PP6 和 PP7 ;第三类为金属依赖的蛋白憐酸酶(Metal-dependent protein phosphatases, PPMs),包括PP2C和丙酮酸脱氢酶磷酸酶，这类酶与PPPs不同，其不需要调节亚基，以单体发挥作用，结构上含有特定的结构域和保守序列基序来决定底物的特异性，而且对广谱的蛋白磷酸酶抑制剂okadaic acid不敏感。其中，金属离子通过活化水分子进行脱磷酸化反应,对PPPs和PPMs起催化和中心的作用(Shi Y.Serine/threonine phosphatases: mechanism throughstructure.Cell, 2009; 139: 468—484.)。PP2C属于Mn2+/Mg2+依赖的高度保守的蛋白磷酸酶。目前人类基因组中已发现16条PP2C基因，编码至少22种不同的PP2C亚型。PP2C在细胞增殖、分化、凋亡和代谢中发挥重要的作用，此外，还主要参与调节应激信号。异常的PP2C活性与多种病理状态如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、阿尔海默氏病等以及环境应激状态如核辐射、紫外照射、受伤应激等有关，具体可参见以下文献:(I) Lammers T, et al.Role of type 2C proteinphosphatases in growth regulation and in cellular stress signaling.Crit RevBiochem Mol Biol, 2007; 42:437-461;(2) Lu g, et al.Functional diversity ofmammalian type 2C protein phosphatase isoforms: new tales from an old family.Clin Exp Pharmacol Physiol, 2008; 35: 107-112。Akt/蛋白激酶B和MAPK通路在细胞存活、增殖、生长、分化中发挥重要作用。Akt和MAPK通路参与了多种疾病和病理过程，例如肿瘤、脓毒症、器官纤维化、炎症、糖尿病、心血管疾病、神经精神疾病如阿尔海默氏病和躁狂抑郁症等以及环境应激状态如核辐射、紫外照射、受伤应激等。Akt可在磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶(PDKl)作用下磷酸化而活化，但在蛋白磷酸酶如PPl、PP2A、PHLPP等作用下脱磷酸化而灭活。研究表明，多种病理状态如肿瘤以及环境应激状态如核辐射等与Akt和MAPK通路(Erk，JNK，P38)的激活有关，具体参见以下文献:(l)Datta SR，et al.Cellularsurvival: a play in three Akts.Genes Devj 1999;13: 2905-2927; Cho H，et al.1nsulin resistance and a diabetes mellitus—like syndrome in mice lacking theprotein kinase Akt2 (PKB beta).Science, 2001; 292:1728-1731 ; (2) Lee UE，etal.Mechanisms of hepatic fibrogenesis.Best Pract Res Clin Gastroenterol,2011; 25: 195-206 ； (3) McConnell JLj et al.Targeting protein serine/threoninephosphatases for drug development.Mol Pharmacol, 2009;75:1249-1261 ; (4)Muthusamy V， et al.the UV response of the skin: a review of the MAPKj NFkappaBand TNFalpha signal transduction pathways.Arch Dematol Res, 2010; 302: 5-17 ；
(5)ZhangJYj et al.The role of the c-Jun N-terminal kinase signaling pathwaysin skin cancer.Am J cancer res, 2012; 2:691—698。糖原合酶激酶3 (glycogen synthase kinase 3，GSK3)，包括 α 和 β 2 个亚型，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，参与了细胞膜到细胞核的信号传导、基因的转录和翻译、细胞骨架的形成、细胞周期进程和细胞存活等许多细胞内过程，因此，其参与了肿瘤、阿尔海默氏病、内毒素血症、全身性炎症、糖尿病等多种病理过程。内毒素是细菌感染造成脓毒症(sepsis)的主要成分。GSK3是Akt的直接底物，Akt使GSK3磷酸化而抑制其活性。实验研究表明GSK3抑制剂TDZD-8、SB216763和SB415286能抑制内毒素血症和全身性炎症相关的肝、肾、肺等多器官损伤和功能障碍，此外，bisarylmaleimide等GSK3抑制剂能有效治疗糖尿病。碳酸锂能抑制GSK3，临床上用于治疗躁狂抑郁症患者。具体参见以下文献:(DWoodgett JR.Judging a protein by more than its name: GSK-3.Sci STKE 2001;2001: RE12; Krema A, et al.GSK3 and Alzheimer’ s disease: facts and fiction.Frontiers in Molecular Neuroscience, 2011;4: 1-10 ； (2) Beaulieu JM, et al.TheAkt-GSK-3 signaling cascade in the actions of dopamine.TRENDS Pharmacol Sci,2007; 28:166-172 ； (3) Dugo L, et al.GSK-3 β inhibitors attenuate the organinjury/dysfunction caused by endotoxemia in the rat.Crit Care Med, 2005;33: 1903-1912 ； (4) Engler TA, et al.The development of potent and selectivebisarylmaleimide GSK3 inhibitors.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2005; 15:899-903。另外，中国专利申请号200910199252.0，提供了一类硫代苦参碱化合物及其药学上可接受的盐类的制备方法，还提供了这类化合物能抑制参与炎症过程的细胞因子产生和核转录因子NFk B转录活性，可用于制备治疗细胞因子和核转录因子NFk B参与的诸如慢性炎症等相关的炎症性疾病和病理过程的药物(Hu H, et al.Synthesis and in vitroinhibitory activity of matrine derivatives towards pro-1nflammatory cytokines.Bioorg Med Chem Lett, 2010; 20: 7537-7539)。但是目前关于这类化合物与RPS5的作用未见报道。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种核糖体蛋白S5 (RPS5)的用途。本发明的再一的目的是，提供一种RPS5或其激动剂或抑制剂的用途。本发明的另一的目的是，提供一种筛选RPS5激活剂或抑制剂的方法。为实现上 述目的，本发明采取的技术方案是:
RPS5在催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应中的用途。所述的RPS5是作为一种PP2C样蛋白磷酸酶催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应。所述的蛋白质分子可以是憐酸化Akt、憐酸化bisamide rhodamine-110 peptide、磷酸化GSK3 β、磷酸化P70S6K、磷酸化ERK等。所述的RPS5分离或纯化于哺乳动物组织或细胞，优选由常规的基因工程重组技术制备生产。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
RPS5或其激动剂或抑制剂的用途，用于调控Akt或MAPK信号通路。RPS5或其激动剂或抑制剂的用途，用于制备治疗Akt或MAPK通路参与的疾病或病理过程的组合物。该组合物可用于提高或抑制RPS5的表达水平或活性。所述的RPS5或其激动剂或抑制剂选自:
a)—种表达载体，所述的表达载体含有编码RPS5或其激动剂或抑制剂的基因及与操作性相关的表达调控序列；或
b)一种重组融合蛋白，所述的重组融合蛋白包括含有RPS5蛋白或其激动剂或抑制剂及促进蛋白穿透或进入细胞的序列；或
c)经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RPS5蛋白的氨基酸序列；
或
d)苦参碱类化合物及其药学上可接受的盐类。所述的苦参碱类化合物及其药学上可接受的盐类可根据专利号ZL 200910199252.0的中国专利文献制得。优选的，所述的苦参碱类化合物是13-甲氨基-18-硫代苦参喊。所述的Akt或MAPK通路参与的疾病和病理过程可以是:肿瘤、脓毒症、器官纤维化、炎症、糖尿病、心血管疾病、神经精神疾病如阿尔海默氏病和躁狂抑郁症等以及环境应激状态如核辐射、紫外照射、受伤应激等。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
一种筛选RPS5激活剂或抑制剂的方法，包括以下步骤:
1)将RPS5与磷酸化底物接触，检测RPS5对所述的磷酸化底物的影响，作为对照组；
2)将候选物质与RPS5或RPS5表达体系接触，再将所得的RPS5与步骤I)所述的磷酸化底物接触，检测RPS5对磷酸化底物的影响，作为测试组；
3)比较对照组和测试组的RPS5的活性，判定所述的候选物质是RPS5的激活剂或抑制剂。所述的磷酸化底物是磷酸化Akt、磷酸化双酰胺若丹明-110肽(bisamiderhodamine-110 peptide)或4-硝基苯磷酸二钠(pNPP),但不仅限于此。所述的RPS5表达体系选自:细胞体系或动物体系。若候选物质提高或抑制RPS5表达或活性，则表明该候选物质是可用于制备治疗Akt和MAPK通路参与的疾病或病理过程的潜在物质`。所述的方法还可以包括以下步骤:对所述的RPS5的激动剂或抑制剂进行细胞实验和/或动物试验，进一步选择和确定对于治疗Akt或MAPK通路参与的疾病或病理过程有用的组合物。需要说明的是:
RPS5及其用途
在本发明中，所用的RPS5蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的RPS5蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组RPS5蛋白。优选的，本发明可采用重组的RPS5蛋白。任何适合的RPS5蛋白均可用于本发明。所述的RPS5蛋白包括全长的RPS5蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的RPS5蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号:NP_001000.2所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RPS5蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。RPS5蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见 Watson 等，Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/Cummings Pub.C0.P224。任何一种RPS5蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，RPS5蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的RPS5蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长RPS5蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长RPS5蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的活性。本发明也可采用经修饰或改良的RPS5蛋白，比如，可采用为了延长其半衰期和/或增加其有效性而加以修饰或改良的RPS5蛋白。所述经过修饰或改良的RPS5蛋白可以是一种RPS5的融合蛋白，或其可包含被取代的氨基酸。所述经过修饰或改良的RPS5蛋白可以是与天然存在的RPS5蛋白具有较大的差异，但也能治疗Akt和MAPK通路参与的疾病和病理过程，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响RPS5蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。根据RPS5蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。优选的，所述的RPS5蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号:NM_001009.3所示的序列基本上相同。的激动剂及其用途
所述的RPS5的激动剂包括RPS5活性促进剂、表达上调剂、稳定剂等。任何可提高RPS5蛋白的活性、促进RPS5蛋白的表达、促进RPS5的转录和翻译的物质、维持RPS5蛋白的稳定性、延长RPS5蛋白有效作用时间均可用于本发明，作为治疗Akt和MAPK通路参与的疾病和病理过程的有效物质。作为本发明的优选方式，所述的RPS5的激动剂选自(但不限于):中国专利号ZL200910199252.0提供的苦参碱类化合物及其药学上可接受的盐类，优选13-甲氨基-18-硫代苦参碱。作为本发明的优选方式，所述的RPS5蛋白的激动剂包括(但不限于):在转入细胞后可表达(优选过表达)RPS5的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码RPS5的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作的连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的 活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。本发明中，RPS5多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因盒翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RPS5的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。作为本发明的优选方式，所述的RPS5蛋白的激动剂包括(但不限于):一重组融合蛋白，所述重组蛋白包括含有RPS5蛋白或其激动剂及促进蛋白穿透/进入细胞的序列，如穿透肽PEP-1、TAT或细胞表面抗体等。制备融合蛋白方法为本领域研究人员所熟知，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、蛋白质的纯化技术等。的抑制剂及其用途
所述的RPS5的抑制剂包括RPS5活性和表达抑制剂。任何可抑制RPS5蛋白的活性、抑制RPS5蛋白的表达、或抑制RPS5的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为治疗Akt和MAPK通路参与的疾病和病理过程的有效物质。
作为本发明的优选方式，所述的RPS5的抑制剂包括(但不限于):经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RPS5蛋白的氨基酸序列。RPS5蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列部分拮抗或完全拮抗RPS5的功能。例如RPS5 D140A突变体及其缺失体RPSSh5ci和RPS5151_2Q4。作为本发明的优选方式，所述的RPS5的抑制剂包括(但不限于):任何一种RPS5蛋白的生物活性片段。在这里，RPS5蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，部分拮抗或完全拮抗RPS5的功能。作为本发明的优选方式，所述的RPS5蛋白的抑制剂包括(但不限于):在转入细胞后可表达(优选过表达)，部分拮抗或完全拮抗RPS5的功能的RPS5蛋白或其生物活性片段的表达载体或表达构建物。作为本发明的优选方式，所述的RPS5蛋白的抑制剂包括(但不限于):含上述RPS5抑制剂的RPS5蛋白及促进蛋白穿透/进入细胞的序列，如穿透肽PEP-UTAT或细胞表面抗体等重组融合蛋白或其生物活性片段。本领域的技术人员熟知的方法能用于制备上述的重组融合蛋白。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、蛋白质的纯化技术等。组合物
本发明的组合物可直接用于治疗Akt和MAPK通路参与的疾病和病理过程。此外还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由…组成”和“由…组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效性”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适合于人和/或哺乳动物而无过度不良副作用(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。本发明的组合物含有安全有效量的RPS5蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。通常药物制剂应与给药方式所匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明所述的RPS5蛋白或其激动剂/抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的RPS5蛋白或其激动剂/抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的RPS5蛋白或其激动剂/抑制剂每天以约0.00 001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-30mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的RPS5蛋白或其激动剂/抑制剂的给药方式没有特别地限制，可以是全身的或局部的。例如，本发明的RPS5蛋白或其激动剂可通过静脉注射、口服、皮下注射、皮内注射等的方式给药动物，较为优选的是口服和静脉注射。在得知了所述的RPS5蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的RPS5蛋白或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将RPS5蛋白通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带RPS5基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的RPS5蛋白。作为本发明的一种实施方式，可将所述的RPS5蛋白直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码RPS5蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疫病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述的RPS5蛋白的细胞中，使所述的细胞表达RPS5蛋白。可通过将适量的所述细胞引入的哺乳动物身体的适当部位，实现RPS5蛋白的表达。RPS5蛋白的激动剂/抑制剂的给药方式主要取决于所述激动剂/抑制剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。活性的检测方法
本发明提供一种检测RPS5活性的方法，所述的方法包括:RPS5的底物和检测RPS5对底物的影响。所述的RPS5底物可以是(但不限于):磷酸化Akt、磷酸化双酰胺若丹明-110妝(bisamide rhodamine-110 peptide)、4_硝基苯憐酸二钠(pNPP)。优选的是憐酸化Akt。磷酸酶的底物是一种磷酸化的物质，磷酸化物质可以是其特异性底物，也可以是非特异性底物。这些使本领域人员认识到，一般来说，非特异性底物基本上不会影响检测蛋白磷酸酶的生物活性。所述检测RPS5对底物的影响，可以采用(但不限于)Western-Blot法，也可以采用分光光度法或荧光分光光度法等。筛选RPS5的激活剂或抑制剂的方法
在得知了所述的RPS5蛋白作为PP2C样蛋白磷酸酶的用途后，可以基于该特征来筛选RPS5的激活剂或抑制剂。筛选RPS5的激活剂或抑制剂的方法包括:将候选物质与RPS5的体系，或与表达RPS5的体系接触。若所述候选物质可提高或抑制RPS5的表达或活性，则表明该候选物质是RPS5的激活剂或抑制剂，可用于制备治疗Akt和MAPK通路参与的疾病和病理过程的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的RPS5体系。所述的RPS5的体系可以是重组表达的RPS5或分离或纯化的内源性RPS5。所述的表达RPS5的体系可以是细胞体系，所述的细胞可以是内源性表达RPS5的细胞；或可以是重组表达RPS5的细胞或RPS5沉默的细胞。所述的表达RPS5的体系还可以是动物体系(如RPS5转基因小鼠，或RPS5敲除小鼠)。作为本发明的一种优选方式，所述的体系是重组表达的RPS5。将重组表达RPS5作为用于筛选与RPS5结合；较佳地， 影响RPS5底物如Akt水平的RPS5激动剂或抑制剂分子模型。
作为本发明的另一种优选方式，所述的体系是RPS5表达的细胞体系。将这种细胞作为用于筛选RPS5激动剂或抑制剂的细胞模型。作为本发明的另一种优选方式，所述的体系是动物模型体系。较佳地，所述的动物模型可以是RPS5转基因或基因敲除的动物模型。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括:对获得的RPS5激动剂或抑制剂进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定用于治疗Akt和MAPK通路参与的疾病和病理过程真正有用的物质。本发明对于RPS5表达的检测方法，可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)=SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等；可以采用常规的mRNA检测技术，例如(但不限于):PCR法，报告基因法等。本发明对于RPS5活性的检测方法，可以采用(但不限于)Western-Blot法，分光光度法，荧光分光光度法等。本发明优点在于:
1、本发明发现:RPS5是Akt的磷酸酶，直接使Akt脱磷酸化而抑制Akt活性。RPS5以单体形式发挥作用，其活性依赖金属离子(Mg2+、Mn2+),对广谱的蛋白磷酸酶抑制剂okadaicacid不敏感，符合PP2C的特性。RPS5结构上包含PP2C催化结构域，突变实验和缺失实验证明该结构域为RPS5活性所必需。RPS5D140A及其缺失体RPSS^和RPS5151_2(I4是RPS5的显性负效应形式。在细胞水平上，RPS5能在基础水平(组成性)促进磷酸化Akt及磷酸化GSK3 β和磷酸化P70S6K脱磷酸，也能促进磷酸化ERK MAPK脱磷酸，但促进JNK和Ρ38MAPK磷酸化。同样地，也能调控生长因子如TGF β和I3DGF以及脂多糖LPS诱导的上述通路的变化。因此，RPS5是一种新的PP2C样的蛋白磷酸酶，特别是Akt的磷酸酶。通过促进或抑制RPS5的表达或活性可以作为治疗Akt和MAPK通路参与的疾病和病理过程的新的有效治疗方法；
2、本发明提供了以RPS5作为药物筛选靶点治疗疾病的方法，即RPS5或其激活剂或抑制剂的用途，用于制备治疗Akt或MAPK通路参与的疾病或病理过程的药物；
3、本发明提供了检测RPS5活性及筛选RPS5激活剂或抑制剂的方法；
综上所述，本发明首次论证了 RPS5是PP2C样蛋白磷酸酶，特别是Akt的磷酸酶，并调控Akt和MAPK通路。因此，RPS5本身能够用作蛋白磷酸酶；并且，可基于RPS5的上述功能，用于制备治疗Akt或MAPK通路参与的疾病或病理过程的组合物，或筛选抑制或激活RPS5的物质，用于治疗Akt或MAPK通路参与的疾病或病理过程。


附图1是RPS5的Akt蛋白磷酸酶活性和检测方法。附图2是RPS5催化活性中心分析结果。附图3 是 pAV.EXld-hRPS5/IRES/eGFP 载体图谱。附图4 是 shpAd-RPS5_eGFP 载体图谱。附图5是RPS5调节Akt和MAPK通路的实验结果。附图6是RPS5激动剂的筛选 和活性测定结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分百和份数按重量计算。实施例1 RPS5是Akt的蛋白磷酸酶
取重组纯化的磷酸化Akt (Millipore公司)与重组的GST-RPS5 (Abnova Biologicals公司)或自制的纯化重组的His-RPS5在50mM Tris-HCl (pH 7.0)，IOmM MgCl2缓冲液中30°C共同孵育30分钟。Western blot检测磷酸化Akt Thr308和Ser473水平。结果显示，RPS5浓度依赖使磷酸化Akt脱磷酸化(图1A)，表明RPS5是一种Akt蛋白磷酸酶。肝星状细胞HSC-T6用TGFbl (2ng/ml)刺激4小时后，分别用RPS5和Akt抗体免疫沉淀RPS5和Akt，然后将不同量的RPS5免疫沉淀物与Akt沉淀物共育，依上述方法检测RPS5蛋白磷酸酶活性。结果显示，内源性RPS5同样催化Akt发生脱磷酸反应(图1B)。实施例2用憐酸化bisamide rhodamine-110 peptide检测RPS5蛋白憐酸酶活性
以 Ser/Thr Phosphatase assay kit (Promega 公司，Madison)中 phosphorylatedbisamide rhodamine-110 peptide作为底物,脱磷酸化反应缓冲液中含有2mM MnCl2,根据试剂盒反应条件检测RPS5的磷酸酶活性。突光强度用Synergy 2多功能酶标仪(Biotek)测定，酶活性用最大信号％表示。结果表明，RPS5浓度依赖使磷酸化phosphorylatedbisamide rhodamine-110 peptide 脱憐酸化(图 1C)。实施例3 RPS5蛋白磷酸酶活性依赖于锰、镁离子，对广谱蛋白磷酸酶抑制剂okadaic acid 不敏感 取重组纯化的磷酸化Akt (Millipore公司)或自制的纯化重组的His_RPS5在50mMTris-HCl (pH 7.0)溶液中在4°C与okadaic acid (200 nM)共同孵育10分钟。依实施例1条件检测RPS5磷酸酶活性。结果显示，RPS5活性依赖于二价金属离子Mn和Mg (图1D)，但okadaic acid对其活性的抑制作用较弱(图1E)，RPS5的这些特性与PP2C相同。实施例4 RPS5具有PP2C催化结构域
用 NCBI Blastp programs 比较人 RPS5 (ΝΡ_001000.2)和人 ΡΡ2(:β (GenBankCAA06704.1)或 PP2C α (ΝΡ_066283.1),结果表明 RPS5 中 2 个肽段(aal21_142 和aal48_202)与PP2C0催化结构域同源，肽段(aal54_198)与PP2Ca同源(图2A)。用Clustal X 2.0和BioEdit软件分析表明，RPS5含有PP2C高度保守的一些氨基酸序列(星号*标记)(图2B)。米用RPS5 晶体结构(61 StearothermophiIus, PDB id code IPKP)应用 Coot软件分子模建 RPS5,与 PP2C β (1A6Q, Das AK, et al, Crystal structure of theprotein serine/threonine phosphatase 2C at 2.0 A resolution.Embo J 1996; 15,6798-6809.)晶体结构比较，发现两者具有相似的金属离子结合域。RPS5分子中位于两个b片层中E123、D124和D140氨基酸残基的3个羧基氧原子构成了推测的金属离子结合域，而PP2Ci3的金属离子结合域则由D60、D239和D282组成(图2C)。图中放大的是金属离子结合域。金属原子用紫色表示，氧原子用红色表示。构建RPS5突变体和缺失体:采用PCR方法，用适当的引物扩增全长RPS5和RPS5缺失体 RPS5h5Q 和 RPS5151_2Q4，插入 pcDNA4 载体(Invitrogen)的 Kpn I/ EcoR I 位点。RPS5突变体采用重叠PCR定点突变的方法构建，引物为:S241: GGG AAG TGG ATC ACC GAT GA/TCA TCG GTG ATC CAC TTC CC; S34A: AAT GAC ATT GCC CTG CAG GA/TCC TGC AGG GCAATG TCA TT; T133A: CGC CGG GGC TGT GAG ACG/CGT CTC ACA GCC CCG GCG; E123A: ACAGTG GTC CCC GGG CGG ACT CCA CAC GCA TTG GGC/GCC CAA TGC GTG TGG AGT CCG CCC GGGGAC CAC TGT; D124A: ACA GTG GTC CCC GGG AGG CCT CCA CAC GCA TTG GGC/GCC CAA TGCGTG TGG AGG CCT CCC GGG GAC CAC TGT; E123A-D124A: ACA GTG GTC CCC GGG CGG CCTCCA CAC GCA TTG GGC/GCC CM TGC GTG TGG AGG CCG CCC GGG GAC CAC TGT; D140A: ACGACA GGC TGT GGC TGT GTC CCC CCT G/CAG GGG GGA CAC AGC CAC AGC CTG TCG T。构建的所有质粒均测序确证。构建的RPS5突变体和缺失体用lipofectin2000转染293T细胞，72小时后，western blot检测Akt憐酸化水平。结果显不，野生型RPS5能使pAkt Thr308和Ser473磷酸化水平降低，Akt靶蛋白GSK3b磷酸化水平也降低。但是，RPS5-E123A-D124A突变体则丧失这种功能，而 RPS5 D140A (GAT — GCT)和 RPS5-E123A-D124A-D140A 突变体(GAGGAC — GCGGCC)及其缺失体RPSS1,和RPS5151_2(I4则刺激Akt及其GSK3b磷酸化水平提高(图2D，E)，说明这些RPS5突变体和缺失体是其显性负效应形式，提示它们可用作RPS5拮抗剂。这些结果也说明这些结构域为RPS5活性所必需。实施例5 RPS5抑制TGFb诱 导的Akt及其下游分子磷酸化
RPS5腺病毒表达载体及其对照载体(AdRPS5和AdGFP )，或RNA干扰AdshRPS5和对照 AdshNC 由广州 Cyagen Biosciences 提供。利用 Gateway clone technology(Invitrogen)构建pAV.EXld_hRPS5/IRES/eGFP重组腺病毒表达载体(载体图谱如图3所示)。重组腺病毒表达载体pAV.EXld含有CMV启动子和双顺反子表达盒，其中人RPS5基因紧接着IRES和增强型绿荧光蛋白(EGFP)基因。利用Gateway clone technology构建shpAd-RPS5-eGFP (载体图谱如图4所示)和对照AdshNC重组腺病毒表达载体。靶向大鼠RPS5 的 shRNA 序列为 356:GCTCATGACTGTACGAATTCTCGAGAATTCGTACA GTCATGAGC，对照序列为 GCGCGCTTTGTAGGATTCGCTCGAGC GAATCCTACAAAGCGCGC。其中 U6 启动子调控 shRPS5 和shNC表达，Ubiquitin-C (Ubc)启动子驱动EGFP表达。将上述载体分别包装成腺病毒，感染大鼠HSC-T6细胞或小鼠RAW264.7巨噬细胞系48小时。依实施例4方法检测RPS5的作用。结果显示，RPS5能在基础水平(组成性)促进磷酸化Akt及其下游信号通路分子如磷酸化GSK3 β和磷酸化P70S6K脱磷酸(图5Α，B)，也能促进磷酸化ERK脱磷酸，但促进JNK和Ρ38 MAPK磷酸化(图5F左)。同样地，也能调控生长因子如TGF β和脂多糖LPS诱导的上述通路的变化(图5C、G)。RNA干扰减少RPS5表达对Akt和MAPK通路的作用与RPS5过表达的作用相反(图5D、Ε、F)，也能促进I3DGF促进的Akt磷酸化水平进一步升高(图5Ε)。这些结果表明，RPS5能调控Akt和MAPK通路。实施例6 RPS5的激活剂的筛选
苦参碱衍生物制备依中国专利号ZL 200910199252.0和文献(Hu H, et al.BioorgMed Chem Lett, 2010; 20: 7537-7539.)。参照文献(Lomenick B, et al.Target identification using drug affinityresponsive target stability (DARTS).PNAS, 2009; 106:21984-21989)方法，取纯化的重组His-RPS5 (IOOng)加入化合物苦参碱衍生物(10 μ Μ) 4° C共同孵育I小时后，加入3%链霉蛋白酶(pronase, Sigma公司)室温消化30分钟,然后加入SDS-loading buffer, 95°C5min 终止消化，再行 12% SDS-PAGE，最后 Western blot 检测 RPS5。结果显示，RPS5在3%链霉蛋白酶作用30分钟后，几乎完全降解。化合物13-甲氨基-18-硫代苦参碱(MASM)作用最强(图6A lane5)。依实施例1条件检测RPS5磷酸酶活性，结果显示该化合物能浓度依赖促进RPS5的活性(图6B)。提示该化合物是一种RPS5的激动剂。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的 保护范围。
权利要求
1.核糖体蛋白S5在催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的核糖体蛋白S5是作为一种PP2C样蛋白磷酸酶催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白质分子是磷酸化Akt、磷酸化bisamide rhodamine-110 peptide、憐酸化 GSK3 β、憐酸化 P70S6K、憐酸化 ERK。
4.核糖体蛋白S5或其激动剂或抑制剂的用途，其特征在于，用于调控Akt或MAPK信号通路。
5.核糖体蛋白S5或其激动剂或抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗Akt或MAPK信号通路参与的疾病或病理过程的组合物。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述的核糖体蛋白S5或其激动剂或抑制剂选自: a)一种表达载体，所述的表达载体含有编码RPS5或其激动剂或抑制剂的基因及与操作性相关的表达调控序列；或 b)一种重组融合蛋白，所述的重组融合蛋白包括含有RPS5蛋白或其激动剂或抑制剂及促进蛋白穿透或进入细胞的序列；或 c)经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RPS5蛋白的氨基酸序列；或 d)苦参碱类化合物及其药学上可接受的盐类。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的苦参碱类化合物是13-甲氨基-18-硫代苦参喊。
8.一种筛选核糖体蛋白S5激活剂或抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将核糖体蛋白S5与磷酸化底物接触，检测核糖体蛋白S5对所述的磷酸化底物的影响，作为对照组； 2)将候选物质与核糖体蛋白S5或其表达体系接触，再将所得的核糖体蛋白S5与步骤I)所述的磷酸化底物接触，检测核糖体蛋白S5对磷酸化底物的影响，作为测试组； 3)比较对照组和测试组的核糖体蛋白S5的活性，判定所述的候选物质是核糖体蛋白S5的激活剂或抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的磷酸化底物是磷酸化Akt、磷酸化bisamide rhodamine-110 peptide 或 4_ 硝基苯憐酸二钠。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括对所述的核糖体蛋白S5的激动剂或抑制剂进行细胞实验和/或动物试验，进一步选择和确定对于治疗Akt或MAPK通路参与的疾病和病理过程有用的组合物。
全文摘要
本发明提供了核糖体蛋白S5(RPS5)在催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应中的用途，其作为一种PP2C样蛋白磷酸酶；提供了RPS5或其激动剂或抑制剂的用途，用于制备治疗Akt和MAPK通路参与的疾病或病理过程的组合物；还提供了RPS5蛋白磷酸酶活性的检测方法以及筛选RPS5激动剂或抑制剂的方法。本发明优点在于首次论证了RPS5是PP2C样蛋白磷酸酶，并调控Akt和MAPK通路，因此RPS5本身能够用作蛋白磷酸酶，并且可用于制备治疗Akt和MAPK通路参与的疾病或病理过程的组合物，或筛选抑制或激活RPS5的物质，用于治疗Akt和MAPK通路参与的疾病或病理过程。
文档编号A61P35/00GK103160557SQ20131005709
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者张俊平, 李婕, 许维恒, 胥静, 厉建中, 胡宏岗, 田媛, 邱磊, 胡振林 申请人:中国人民解放军第二军医大学