专利名称：一种核糖体失活蛋白－南瓜蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机化学领域，特别是涉及到生物化学中一种核糖体失活蛋白—南瓜蛋白及其制备和应用。
在本文中，核糖体失活蛋白可被定义为至少具有下列活性之一的蛋白质RNA-N糖苷酶活性，引产蛋白活性，抗肿瘤或抗病毒活性。该蛋白是寡聚的单肽链的简单蛋白或糖蛋白。
从高等植物中提取的的核糖体失活蛋白，根据其分子结构可以分为两类，类型I是单肽链蛋白，例如，来自葫芦科植物块根和种籽的天花粉蛋白(Trichosanthin)，丝瓜籽蛋白(Luffin)，八棱丝瓜籽蛋白(Luffaculin)和来自石竹科植物种籽的肥皂草素(Saporin)等。类型II是双肽链蛋白，例如，来自大戟科植物种籽的蓖麻毒素(Ricin)和来自豆科植物种籽的相思子毒素(Abrin)。类型I蛋白以及类型II蛋白的A链都是通过裂解核糖体内28S rRNA的4324位腺嘌呤的N-糖苷键而使真核细胞核糖体60S亚基失活(Endo and Tsaragi 1987，J.Biol.Chem.2628128-8130，Stirpe，F.et al.，1988，Nacl.Acid Res.161349-1357)。关于类型I和类型II的核糖体失活蛋白已经有很多的专利和文献报道。
南瓜(Cucurbita moschata)是葫芦科南瓜属的一个品种，南瓜及其种籽均是常见蔬菜和干果。钟雪梅等人(1994，生物化学杂志，10397-401)从笋瓜籽(Cucurbita maxima)中分离到一种核糖体失活蛋白Maximin，其分子量为28 KD，IC50为4.0×10-10Mol/L，与天花粉蛋白活性相似。Yoshinari，S；et al从西葫芦(Cucurbita pepo)中分离出一种核糖体失活蛋白Pepocin，其分子量为26 KD，IC50为15.4×10-12Mol/L。该属植物中其它的核糖体失活蛋白未见报道。
目前，已从葫芦科植物的瓜果中分离出两种核糖体失活蛋白，一种是Loshinari，S et al从西葫芦中分离的pepocin，一种是Lee-Huang，S et al从苦瓜(Momordica charantia)中分离到的MAP。
本发明的目的是从南瓜属植物南瓜中分离出一种新的核糖体失活蛋白—南瓜蛋白，并公开了它的制备方法及用途。经SDS-PAGE显示它的分子量为27 KD，等电点pI＞9。
本发明采用一种温和的分离纯化方法，即南瓜切碎后经醋酸缓冲液，或磷酸缓冲液，或水，或盐水抽提，抽提液经DEAE-纤维素或DEAE-琼脂糖等弱阴离子凝胶介质过滤后，再经SP-琼脂糖、S-琼脂糖、CM-纤维素、CM-琼脂糖等强或弱阳离子凝胶介质二次离子交换层析分离，就可得到电泳一条带的纯蛋白，我们把它命名为南瓜蛋白(Cucurmosin)，SDS-PAGE显示它的分子量为27 KD，等电点pI＞9。
本发明的南瓜蛋白与天花粉蛋白相类似，可以用作引产药物或抗肿瘤抗病毒制剂使用。
本发明的南瓜蛋白对细胞内蛋白质生物合成有强烈抑制作用，适合于作免疫毒素的毒素材料。
本发明的南瓜蛋白还可以作为RNA N-糖苷酶用于分子生物学和免疫学研究。
使用本发明的分离纯化方法，可以从葫芦科其他种属植物的成熟的瓜果(如瓜蒌、药西瓜、冬瓜等)中分离出核糖体失活蛋白，其分子量在27 KD左右，等电点偏碱性，并具有强烈抑制细胞内核糖体失活蛋白合成的活性。
使用本发明的分离纯化方法，可以从担子菌纲真菌(如香菇、蘑菇)的子实体中分离出核糖体失活蛋白，其分子量在27 KD左右，等电点偏碱性，并具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。
本发明的南瓜蛋白，可以使用汽相扩散技术、自由界面方法或透析方法，在0.05～0.2 Mol/L的磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、咪唑缓冲液中，以10％～40％的聚乙二醇为沉淀剂条件下，长出可供X-射线衍射用的单晶。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果(1).南瓜是民间常用蔬菜，采用温和的提取方法可获得一种新的核糖体失活蛋白—南瓜蛋白。
(2).本发明与本属植物中分离的笋瓜籽蛋白和Pepocin相类似，它们都属于类型I核糖体失活蛋白，分子量大约26～28KD。
(3).本发明提供的南瓜蛋白晶体，可以深入开展X-射线衍射分析和分子结构工作。
现在对附图作图面说明
图1.显示核糖体失活蛋白—南瓜蛋白进行纯化的阳离子交换层析图；图2.显示南瓜蛋白进行再纯化的阳离子交换色谱图；图3.显示(图1)的12％SDS-PAGE图；图4.显示(图2)的12％SDS-PAGE图。
下面结合附图通过实施例来进一步描述本发明实施例1.从南瓜中分离纯化南瓜蛋白(Cucurmosin)取3 Kg金黄色的成熟的南瓜瓢，切成小块，加适量的20mM醋酸缓冲液(pH4.5)匀浆，用脱水机离心收集粗提液，用50％的冰醋酸调pH4.0，经冷冻离心(15,000rpm，15’)收集清液，加1/10体积的0.2 M磷酸缓冲液(pH6.0)调pH中性，加入DEAE-纤维素-52(预先在20mM pH6.0磷酸缓冲液中溶胀)搅拌，过滤后的清液上SP-琼脂糖快流速凝胶离子交换柱，用20mM pH6.0磷酸缓冲液洗柱，然后用0～1M NaCl(于20mM pH6.0磷酸缓冲液中)梯度洗脱。组分17-19就是初步提纯的南瓜蛋白。合并组分17-19，用盐酸调pH4.0，经SP-琼脂糖快流速凝胶离子交换柱再纯化，用20mMpH6.0磷酸缓冲液洗柱，然后用0～0.5M NaCl(于20mM pH6.0磷酸缓冲液中)梯度洗脱。所获得的组分50就是南瓜蛋白。SDS-PAGE显示它的分子量为27 KD。
实施例2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)核糖体失活蛋白—南瓜蛋白，在Bio-Rad公司的微量垂直平板电泳仪上进行SDS-PAGE，SDS-PAGE按Leammli的方法进行，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为4％，电泳后按郭尧君方法(1991，生物化学与生物物理进展，1832-37)，用考马斯亮兰染色，以牛血清白蛋白(MW～67KD)、天花粉蛋白(MW～27KD)和溶菌酶(MW～14KD)为分子量标准对照，显示南瓜蛋白的分子量为27 KD。SDS-PAGE结果见附图3和附图4。
权利要求
1.一种核糖体失活蛋白—南瓜蛋白(Cucurmosin)，其特征在于，该蛋白是从南瓜中分离出来的，它的分子量(SDS-PAGE检测)为27 KD，等电点＞9。
2.如权利要求1所述的核糖体失活蛋白—南瓜蛋白，其特征在于，它具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。
3.一种权利要求1的核糖体失活蛋白—南瓜蛋白的分离纯化方法，包括缓冲溶液抽提、DEAE-纤维素过滤、二次SP-琼脂糖快流速凝胶离子交换层析，其特征在于，通过DEAE-纤维素过滤和二次SP-琼脂糖快流速凝胶离子交换层析。
4.一种权利要求3的核糖体失活蛋白—南瓜蛋白的分离纯化方法，其特征在于，用相似的方法可以从葫芦科其他种属植物的成熟的瓜果(如瓜蒌、药西瓜、冬瓜等)中分离出核糖体失活蛋白，其分子量在27 KD左右，等电点偏碱性，并具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。
5.一种权利要求3的核糖体失活蛋白—南瓜蛋白的分离纯化方法，其特征在于，用相似的方法可以从担子菌纲真菌(如香菇、蘑菇)的子实体中分离出核糖体失活蛋白，其分子量在27 KD左右，等电点偏碱性，并具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。
6.一种权利要求1的核糖体失活蛋白—南瓜蛋白的应用，其特征在于，该蛋白可作为引产蛋白应用于引产，以及治疗相关肿瘤病和病毒性感染疾病。
7.如权利要求6所述的一种核糖体失活蛋白—南瓜蛋白的应用，其特征在于，该蛋白还可开发用作制备免疫毒素的毒素材料。
8.一种权利要求1的核糖体失活蛋白—南瓜蛋白的晶体生长，其特征在于，可以使用汽相扩散技术、自由界面方法或透析方法，在0.05～0.2 Mol/L的磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、咪唑缓冲液中，以10％～40％的聚乙二醇为沉淀剂条件下，能成功的长出可供X-射线衍射用的单晶。
全文摘要
一种核糖体失活蛋白—南瓜蛋白(Cucurmosin)是从常用蔬菜葫芦科植物南瓜中分离出来的,其分子量为27KD(SDS－PAGE检测),等电点>9。我们采用温和的提取方法,经DEAE－纤维素过滤和二次SP－琼脂糖快流速凝胶离子交换层析,获得了高纯度的蛋白。该蛋白已培养成可供X－射线衍射的晶体。该蛋白可以作为引产药物和抗肿瘤制剂的商业应用,作为N－糖苷酶用于分子生物学和免疫学研究,并可用作为免疫毒素的毒素材料。
文档编号C07K1/00GK1263107SQ99102290
公开日2000年8月16日 申请日期1999年2月11日 优先权日1999年2月11日
发明者陈明晃, 叶晓明 申请人:中国科学院福建物质结构研究所