专利名称：一种wssv囊膜蛋白原核表达包涵体的变复性方法
技术领域：
本发明属于微生物学领域白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)蛋白体外原核表达实践中的一种技术革新，具体涉及一种WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体的变复性方法，其能有效提升包涵体的复性效率达95%以上并获得可溶性蛋白。
背景技术：
白斑综合症病毒已在全球范围内成为虾类中最普遍的、分布最广、最致命的病毒。但目前然没有可用来控制该病毒发生和传播的办法。给世界对虾养殖业带来了巨大的损失。因此，弄清其致病机理，成为有效防治的基础。目前，研究结果一致认为，囊膜蛋白在对虾白斑综合症病毒与宿主的相互作用中扮演着重要的角色。但其致病机理尚不明了，因此，WSSV囊膜蛋白也成为国内外科技工作者的研究热点。大多数研究工作的前提均是通过构建WSSV囊膜蛋白的体外重组原核表达体系获取可溶性的体外表达蛋白。然而，在进行WSSV囊膜蛋白的体外重组原核表达时经常获得的表达产物为不溶的、无活性的固体颗粒，即包涵体。若想获得可溶性蛋白，通常的做法是对包涵体进行变复性。包涵体的复性是一个复杂的过程，复性成功与否很大程度上和蛋白本身的性质有关。有些蛋白在宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今还没有发现对其进行复性的有效方法，一般来说，蛋白质的复性效率在20%左右。目前已知的很多包涵体变复性方法应用于WSSV囊膜蛋白原核表达的包涵体变复性时均存在各方面的缺点，例如复性效率低或无法获得可溶性蛋白等等。因此一种有效的WSSV蛋白原核表达包涵体的变复性方法是进行大规模WSSV囊膜蛋白体外原核表达研究所迫切需要的。
发明内容
本发明提供一种WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体的变复性方法。该方法能使WSSV蛋白原核表达形成的包涵体的复性效率达到95%以上，最终获得可溶性蛋白。本发明的基本原理是(1)在包涵体中加入变复性添加剂并剧烈搅动，使沉淀缓慢溶解；(2)低温离心丢弃剩余的沉淀；(3)通过透析法逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，最终通过浓缩得到可溶性的蛋白。本发明所述WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体的变复性方法包括变复性添加剂剂量、沉淀溶解、缓冲液剂量、透析复性的过程。作为处理对象的WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体在此前通过超声破碎细胞、低温离心获得。本发明所述WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体的变复性方法，具体的步骤如下I)向WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体中加入含8M尿素的IOmM Tris-HCl, pH8. 0，剧烈搅动，25°C下用磁力搅拌器不断搅拌3-4小时，使沉淀缓慢溶解；2) 4°C, 12000rpm 离心 12min,弃沉淀；3)在所得上清液中加入pH8. O的磷酸盐缓冲液，以pH8. O的磷酸盐缓冲液透析20-22小时，然后用PEG-20000浓缩得可溶性蛋白。
对于冷冻保藏的包涵体，在采用本发明方法前要进行预处理，即用IOmM TriS-HCl(pH8. O)溶液重悬超声离心得到的沉淀(沉淀即为超声破碎细胞、低温离心获得的包涵体)，12000rpm,离心 IOmin,弃上清。预处理中，重悬液的用量优选20_30ml。步骤I)中变复性剂量优选8ml含8M尿素的IOmM Tris-HCl。步骤3)中缓冲液的剂量优选15-20ml pH8. O的磷酸盐缓冲液(PBS) (PBS可使尿素的浓度降低以利于复性)以PH8. O的PBS缓冲液透析20-22小时(期间换6_8次透析液)，然后用PEG-20000浓缩到约1ml。取30 μ I样品加入7. 5 μ I的5 X LSB上样缓冲液，100 V沸水处理5-lOmin，12000rpm离心IOmin后取5 μ I上清上样，SDS-PAGE检测复性情况。
本发明的有益效果是通过WSSV蛋白原核表达包涵体的变复性方法革新，对各研究所或实验室进行WSSV蛋白原核表达时产生的包涵体进行变复性从而获得可溶性的体外表达蛋白具有指导作用。
图I. SDS-PAGE分析VP32蛋白包涵体变复性(泳道1，2 VP32 ;泳道M :Marker)。
具体实施例方式实施例一本发明实施例一提供一种WSSV囊膜蛋白VP32原核表达形成的包涵体的变复性方法，下面进行详细说明VP466基因原核表达蛋白的包涵体的获得属于现有技术，可通过基因合成方法合成VP466基因，经过酶切、酶切产物的亚克隆、转化、单克隆测序验证、转化、小量表达、大量表达、表达产物纯化获得包涵体。本实施例中提供一个包涵体制备过程，但不是对本发明的限制。 VP32蛋白的原核表达过程1.VP32基因序列(AY897235. I)采用基因合成的方法(由上海生工生物公司合成)，直接进行PGEX-4T-1质粒(上海吴江近岸蛋白质科技有限公司)转化(N端带GST标签)。2.酶切在灭菌的Eppendorf管中，准备双酶切反应体系。1)￥ 32基因酶切反应体系(4(^1，371，311)
权利要求
1.一种WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体的变复性方法，其特征是包括以下步骤 1)向WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体中加入8M尿素的10mM Tris-HCl，pH8. 0，剧烈搅动，25°C下用磁力搅拌器不断搅拌3-4小时，使沉淀缓慢溶解； 2)4°C, 12000 rpm 离心 12 min,弃沉淀； 3)在所得上清液中加入pH8.O的磷酸盐缓冲液，以pH8. O的磷酸盐缓冲液透析20-22小时，然后用PEG-20000浓缩得可溶性蛋白。
2.根据权利要求I所述的一种WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体的变复性方法，其特征是透析期间换6-8次透析液。
全文摘要
本发明涉及一种WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体的变复性方法。其内容包括1)向WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体中加入8M尿素的10mMTris-HCl，pH8.0，剧烈搅动，25℃下用磁力搅拌器不断搅拌3-4小时，使沉淀缓慢溶解；2)4℃，12000rpm离心12min，弃沉淀；3)在所得上清液中加入pH8.0的磷酸盐缓冲液，以pH8.0的磷酸盐缓冲液透析20-22小时，然后用PEG-20000浓缩得可溶性蛋白。利用本发明，WSSV囊膜蛋白原核表达包涵体的复性效率均达到了95%以上，获得了可溶性蛋白。
文档编号C07K1/14GK102924580SQ20121046842
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者李鹏, 严洁, 马晓燕, 周开亚 申请人:南京师范大学