一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法以及伪型病毒的用途，制备方法包括（1）携带F、HN基因的重组质粒的构建；（2）整合有新城疫病毒囊膜蛋白的伪型病毒NDV-PP的制备。其中，扩增F基因和HN基因的两对引物分别为F-sense与F-antisense、HN-sense与HN-antisense，引物序列分别为SEQ?ID?No.1与SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3与SEQ?ID?No.4。本发明拟建立一种敏感、快速、适合大批样本检测的新城疫病毒中和抗体检测方法，以期替代传统的中和抗体检测手段，为疫病的快速诊断、疫苗效果评价等提供有益工具。
【专利说明】一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途，属于病毒的制备与应用领域。
【背景技术】
[0002]新城疫是一种可引起多种禽类发生群体死亡的急性、高度接触性传染病，给养禽业造成了巨大的经济损失。该病在世界范围内广泛流行，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的疫病。对其进行迅速、准确的血清学诊断不仅可以有效评价动物机体的感染状态，也是控制该病流行的必要前提。目前对该病常用的血清学诊断方法包括血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及全病毒中和试验(VN)。在这些方法中，VN所检测的是能够使机体免受病毒感染的中和性抗体，因此与H1、ELISA相比，VN检测结果更能体现出动物机体阻止病毒感染的状态。
[0003]VN通常是在细胞中进行检测。检测之前需事先培养支持NDV复制的细胞，如鸡成纤维细胞CEF或DF1，将待检测样品与一定剂量的病毒孵育后，接种于细胞中，1-4天后，观察细胞是否有病毒感染导致的病变，或用染料染色，检查病毒感染细胞所产生的空斑数量或大小，继而确定所检测样品(血清或抗体)是否具有中和活性及其中和效价。这种检测方法具有如下几个缺点:
[0004](I)实验周期较长，与血清孵育的病毒接种细胞后，往往要1-4天才能出现细胞病变(不同毒力的毒株产生细胞病变的时间有所差异)。长时间的检测过程不利于第一时间对于病毒感染做出诊断，特别是在病毒大范围流行期间，有可能延误疫病的防治。
[0005](2)敏感性较差。该方法的检测阈值较高，若血清样品数量较少，或中和抗体效价较低，则无法应用该方法。
[0006](3)结果判断过于主观。病毒接种细胞后产生的细胞病变或者空斑的减少需要主观判断，没有一个客观、统一的标准。
[0007]本发明检测中和抗体，有效减少了检测所需时间(不超过48小时)；由于本发明采用荧光素酶的放大系统，即便样品中含有极少量的中和抗体，也能检出，且理论上单次同时检测的样品数量没有上限，因此更适合大规模，高通量的样品检测；本项发明测定荧光素酶表达水平即可作为判定血清的中和效价的统一标准，因此判定结果更加客观；本发明应用过程中，不涉及活病毒的操作，避免了对其他实验材料或动物的交叉感染，因此具有生物安全优势。
【发明内容】
[0008]由于传统的基于细胞或者鸡胚的中和试验方法具有以上诸多弊端，本发明拟建立一种敏感、快速、适合大批样本检测的新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)中和抗体检测方法，以期替代传统的中和抗体检测手段，为疫病的快速诊断、疫苗效果评价等提供有益工具。本发明提供了一种新城疫病毒伪型病毒(pseudotyped particle, PP)的制备方法及其用途。
[0009]本发明通过以下技术方案实现:
[0010]1.新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)属于副黏病毒科，病毒粒子表面有血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuminidase，HN)和融合蛋白(fusionprotein, F)两种表面囊膜蛋白。携带F、HN基因的重组质粒的构建。
[0011](I)提取NDV F48E9毒株的总RNA，利用随机引物和禽逆转录病毒(AMV)反转录酶反转录为cDNA ；
[0012](2)合成扩增F基因和HN基因的两对引物:F_sense与F-antisense、HN-sense与 HN-antisense，引物序列分别为 SEQ ID N0.1 与 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 与 SEQ IDN0.4 ；
[0013](3)以步骤(I)中获得的cDNA为模板，用步骤(2)合成的引物F-sense与F-antisense、HN-sense 与 HN-antisense PCR 扩增 F 基因和 HN 基因；
[0014](4)用EcoR 1、Xho I酶切F基因片段，用BamH1、XhoI酶切HN基因片段，然后连接到用相应酶酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1 ( + )(英俊公司生产)上，进行核酸测序，确认重组子的读码框正确，分别命名为Pc-F和pc-HN，然后将两重组质粒转染人胚胎肾细胞(293T)。48小时后，用质量浓度为0.05%的胰酶消化细胞，涂布于载玻片，用预冷的丙酮固定。以NDV全病毒免疫的鸡血清作为一抗进行免疫荧光染色，确认F和HN基因能够正常表达。
[0015]2.整合有NDV囊膜蛋白的`伪型病毒(命名为NDV-PP)的制备
[0016]提前一天将293T细胞在无菌条件下铺于IOcm细胞培养皿中，待细胞单层长至80%左右时，取质粒pc-F、pc-HN及携带有荧光素酶同时缺失Env囊膜蛋白和R蛋白基因的HIV病毒载体(pNL4-3-Luc-R_E_)各10yg，利用转染试剂HiTrans (杰普生公司生产)转染293T细胞。三种质粒与50 μ L转染试剂混合，室温孵育30分钟后，缓慢加入IOcm细胞培养皿中。48-72小时后，收获转染细胞上清，通过0.45 μ m滤膜过滤后，收集转染细胞培养上清放置_80°C保存。阳性对照组用表达水泡性口炎病毒囊膜蛋白(VSV-G)质粒和pNL4-3-Luc-RI各10 μ g转染293T细胞；阴性对照用pcDNA3.1(+)空质粒和pNL4-3-Luc-RT_ 各 10 μ g 转染 293T 细胞。
[0017]本发明以复制缺陷型的伪型病毒为工具，检测样品中NDV特异性中和抗体，具有以下优点:
[0018]I)检测周期短，传统方法应用全病毒在细胞或鸡胚上检测，依不同毒力毒株而言，通常需要4天左右的时间完成检测，应用本发明的方法最长2天，即可完成中和抗体检测。
[0019]2)敏感性高。由于本发明引入的荧光素酶放大系统，使得检测结果以报告基因的表达水平作为指示，极大的提高了检测的敏感性，因此本发明也适用于低水平中和抗体的检测。
[0020]3)适合大批样本的检测。本发明所表述内容以96孔细胞培养板为例，实际操作亦可选用384孔板，理论上，每个细胞培养孔可用于一份样品的检测，而在增加细胞培养板数量的前提下，应用本发明检测样品没有数量上的限制。
【专利附图】
【附图说明】[0021]图1为空质粒、新城疫伪型病毒、水泡性口炎伪型病毒感染293T细胞，感染24h后检测荧光素酶表达水平图，其中，空质粒是pcDNA3.1(+)和pNL4-3-LuC-RI，新城疫伪型病毒是Pc-F和pc-HN与pNL4-3-Luc-R-E-，水泡性口炎伪型病毒是VSV-G与pNL4-3-Luc-R-E-分别包装伪型病毒；
[0022]图2为水泡性口炎伪型病毒和新城疫伪型病毒分别与NDV阴性血清和阳性血清混合后感染293T细胞，感染24h后检测获得的293T细胞中荧光素酶表达水平图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0024]实施例1
[0025]1.pc-F和pc-HN重组质粒的构建
[0026]提取NDV F48E9毒株的总RNA，利用随机引物和AMV反转录酶反转录为cDNA，cDNA作为模板，合成引物F-sense与F-antisense,引物序列分别为SEQ ID N0.1与SEQ IDN0.2,通过PCR方法扩增F基因。合成引物HN-sense与HN-antisense,引物序列分别为SEQID N0.3 与 SEQ ID N0.4，通过 PCR 扩增 HN 基因。
[0027]F基因片段用EcoR I ,Xho I酶切，HN基因片段用BamH1、XhoI酶切，然后与同样酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1 (+)连接构建成pc-F和pc_HN，通过核酸测序确认重组子的读码框正确后，将两重组质粒转染293T细胞，利用全病毒免疫的鸡高免血清进行间接免疫荧光试验确认F和HN基因能够正常表达。
[0028]2.伪型病毒NDV-PP的制备
[0029]提前一天将293T细胞铺于IOcm细胞培养皿，待细胞长至80%左右单层时，取质粒pc-F、pc-HN及pNL4-3-Luc-R-E-各10 μ g，参照转染试剂HiTrans说明书转染293T细胞。48-72小时后，收获转染细胞上清，0.45 μ m滤膜过滤后放置-80°C保存。阳性对照组用VSV-G质粒和pNL4-3-LuC-R_E-各10 μ g转染293T细胞；阴性对照用pcDNA3.1 (+)空质粒和 pNL4-3-Luc-1TE-各 10 μ g 转染 293T 细胞。
[0030]3.伪型病毒NDV-PP的鉴定
[0031]取150 μ L含有NDV-PP的上清液以及阴性、阳性对照，接种于生长在96孔细胞培养板中的293Τ细胞，48小时后，利用Promega公司的Bright-Glo Luciferase AssaySystem检测各孔感染细胞的荧光素酶表达水平，结果发现阳性对照VSVG-PP及NDV-PP感染孔能够检测到荧光素酶的表达，表明其能有效感染293T细胞，而阴性对照检测不到荧光素酶的表达(见图1)。说明NDV-PP构建成功。
[0032]4.利用NDV-PP检测NDV中和抗体
[0033]取实验室感染NDV的鸡阳性血清、SPF鸡阴性血清各15 μ L，10倍稀释后与等体积的NDV-PP或水泡性口炎伪型病毒混合，室温孵育2小时后加入96孔板中的293Τ细胞中，继续培养48小时,检测各个孔的荧光素酶表达水平,其中水泡性口炎伪型病毒为阳性对照组。简言之，孵育有NDV-PP和血清或水泡性口炎伪型病毒与血清混合物的细胞用ρΗ7.4的
1xPBS缓冲液洗I次,取Promega公司的Cell lysis buffer20 μ L室温条件下裂解细胞，20分钟后，每个检测孔加入100 μ L荧光素酶底物，利用Perkin Elmer公司的多功能荧光分析仪检测荧光素酶的表达水平。结果表明，NDV感染鸡的阳性血清与NDV-PP混合后感染293Τ细胞，检测不到荧光素酶的表达，说明NDV-PP对293Τ细胞的感染被中和抗体所中和，而SPF鸡血清与NDV-PP混合感染能够检测到荧光素酶的表达，表明检测样品中不含有NDV中和抗体(见图2)。NDV的阳性血清可特异性的阻断NDV-PP对细胞的感染，而阴性血清不能阻断NDV-PP的感染。
【权利要求】
1.一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法，包括以下步骤: (1)携带F、HN基因的重组质粒的构建 ①提取新城疫病毒F48E9毒株的总RNA，利用随机引物和禽逆转录病毒(AMV)反转录酶反转录为cDNA ； ②合成扩增F基因和HN基因的两对引物:F_sense与F-antisense、HN-sense与HN-antisense，引物序列分别为 SEQ ID N0.1 与 SEQ ID N0.2, SEQ ID Νο.3 与 SEQ ID N0.4 ； ③以步骤①中获得的cDNA为模板,用步骤②合成的引物F-sense与F-antisense、HN-sense 与 HN-antisense PCR 扩增 F 基因和 HN 基因； ④用EcoRI ,Xho I酶切F基因片段，用BamH1、XhoI酶切HN基因片段，然后连接到用相应酶酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)上，进行核酸测序，确认重组子的读码框正确，分别命名为pc-F和pc-HN,然后将两重组质粒转染人胚胎肾细胞，即293T ；48小时后，用质量浓度为0.05%的胰酶消化细胞，涂布于载玻片，用预冷的丙酮固定；以NDV全病毒免疫的鸡血清作为一抗进行免疫荧光染色，确认F和HN基因能够正常表达； (2)整合有新城疫病毒囊膜蛋白的伪型病毒NDV-PP的制备 提前一天将293T细胞在 无菌条件下铺于IOcm细胞培养皿中，待细胞单层长至80%左右时，取质粒pc-F、pc-HN及携带有荧光素酶同时缺失Env囊膜蛋白和R蛋白基因的HIV病毒载体pNL4-3-Luc-R-E-各10μ g，利用转染试剂HiTrans转染293T细胞；三种质粒与50 μ L转染试剂混合，室温孵育30分钟后，缓慢加入IOcm细胞培养皿中；48-72小时后，收获转染细胞上清，通过0.45 μ m滤膜过滤后，收集转染细胞培养上清放置_80°C保存；阳性对照组用表达水泡性口炎病毒囊膜蛋白VSV-G质粒和pNL4-3-Luc-R_E_各10 μ g转染293T细胞；阴性对照用pcDNA3.1 ( + )空质粒和pNL4-3-Luc-R-E-各10 μ g转染293T细胞。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的新城疫病毒伪型病毒。
3.如权利要求2所述的新城疫病毒伪型病毒在新城疫病毒中和抗体检测中的应用。
【文档编号】G01N33/569GK103451159SQ201310369421
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】刘恒贵, 王斌, 刘培欣 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所