一种多药耐药肺癌裸鼠移植瘤模型的建立及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种多药耐药肺癌动物模型的建立及检测方法，建立方法是：a.首先进行细胞培养及鼠间接种传代；b.鼠间接种传代，建立模型；建立方法是：a.肺癌多药耐药裸鼠移植瘤生长状况观察；b.肺癌多药耐药裸鼠移植瘤形态学观察；c.肺癌多药耐药裸鼠移植瘤耐药性检测；d.肺癌多药耐药裸鼠移植瘤多药耐药基因mdr1和多药耐药相关蛋白基因mrp信使核糖核酸mRNA的半定量；e.肺癌多药耐药裸鼠移植瘤多药耐药蛋白P-gp和多药耐药相关蛋白MRP表达；本发明的优点是：肺癌裸鼠移植瘤模型耐药性稳定，肿瘤表浅便于观察，并体现完整的生物学特性，即具有人肺腺癌的组织结构和功能特征，是较理想的多药耐药肿瘤模型。
【专利说明】一种多药耐药肺癌裸鼠移植瘤模型的建立及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物药理实验【技术领域】，特别涉及一种多药耐药肺癌动物模型的建 立方法及检测方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的多药耐药（Multidrug Resistance, MDR)是导致肺癌化疗失败的主要原因， 也是肺癌治疗急需解决的难题。据有关资料统计，在肿瘤年死亡率中，属内在性多药耐药的 约占61%，属获得性多药耐药的约占33%，即90%以上的肿瘤患者死因与耐药有关。肺癌MDR 形成机制很复杂，国内外对发生其进行了很多探索，因此，肺癌的多药耐药模型的建立很重 要。无胸腺裸鼠（Nude，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物 模型。特别是在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方 面，它有着特殊的价值。裸鼠的先天性T淋巴细胞免疫缺陷及近交系的特点，极大地减少了 个体差异，成为构建肿瘤模型较理想的载体。裸鼠移植瘤模型可以直接模拟人体内肿瘤的 自然生长过程，且能够观察肿瘤与宿主的相互作用。同时长期传代方便，成功率高，是一种 研究肿瘤的重要方法。建立成功的裸鼠移植瘤模型，是进行药物筛选的有利平台。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是建立耐药性稳定的裸鼠肺腺癌移植瘤模型，为进行耐药机制研究 及逆转药物筛选提供人源化动物模型，并可进一步拓展应用于肿瘤类重大疾病的诊断、防 治技术的转化。本发明是这样实现的；一种多药耐药肺癌动物模型的建立方法： a、 首先进行细胞培养及鼠间接种传代，人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP， 常规传代培养，取对数生长期的细胞备用； b、 鼠间接种传代，建立模型，雌性近交系裸小鼠，4?5周龄，体重15g?17g，在无特 定病原体SPF级动物合格环境下饲养，自由摄取水分和食物，各实验均在无菌超净工作台 中进行，无菌条件下，取对数生长期肿瘤细胞A549及A549/DDP，制备细胞悬液，裸鼠右腋下 接种0. 2ml/只，建立第一代人肺腺癌细胞A549和耐药株A549/DDP裸鼠移植瘤模型；待裸 鼠皮下包块长至约IOOmm3时，脱颈法处死裸鼠，无菌条件下，分别取完好的A549、A549/DDP 瘤块，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培养基，抽样证明没有污染，制备瘤细胞悬液，进 行细胞计数，裸鼠右腋下接种，建立第二代裸鼠模型；待裸鼠皮下包块长至约IOOmm3时，脱 颈法处死裸鼠，无菌条件下，分别取完好的A549、A549/DDP瘤块，置于玻璃研磨器中，加入 RPMI-160培养基，抽样证明没有污染，制备瘤细胞悬液，进行细胞计数，裸鼠右腋下接种，建 立第三代裸鼠模型；鼠间传代至3代，每代6只；用第4代裸鼠A549移植瘤组和A549/DDP 移植瘤组进行成模性检测。
[0004] 按照上述的多药耐药肺癌动物模型的建立方法建立的裸鼠肺癌多药耐药模型的 检测方法： a、肺癌多药耐药裸鼠移植瘤生长状况观察，第1?3代裸鼠均于移植后15±6天， 即9-21天左右出瘤，至3周左右直径可长至5mm，第4代A549/DDP裸鼠皮下移植瘤 成功率均为1〇〇%，平均潜伏期为7± 1.35天，即5. 65-8. 35天；平均每天生长速度为 102. 23±31. 66mm3,两组瘤体积随时间延长逐渐增大； b、肺癌多药耐药裸鼠移植瘤形态学观察，肉眼观察：观察第4代移植瘤见瘤体呈局部 结节样生长，表面光滑，不易活动，收集移植瘤时见外观呈黄白色，有血管生长分布，与周围 组织边界清晰，无粘连，剖面呈粉红色，中央偶有出血坏死或液化，光镜检查：镜下移植瘤呈 现中低分化的腺癌特征，A549/DDP移植瘤则多呈实性团块状，呈椭圆形或长梭形，核大深 染，呈中度异形性，排列不整齐，核仁明显。瘤细胞呈侵润生长，坏死较少，间质有较多微血 管形成； c、肺癌多药耐药裸鼠移植瘤耐药性检测，取裸鼠耐药移植瘤，筛网法分离细胞， 对原代细胞与移植瘤细胞进行IC5tl检测，原代A549细胞和A549/DDP细胞的IC5tl分别 为 24. I ii mol/L 和 335. 2 ii mol/L ;裸鼠 A549/nude 和 A549/DDP/nude 的 IC5tl 分别为 23. 8 ii mol/L和321. 4 ii mol/L，计算原代细胞和裸鼠移植瘤细胞的耐药倍数，耐药倍数= 耐药细胞IC5tl /亲本细胞IC5tl，分别为13. 9和13. 5,表明A549/DDP移植瘤细胞和原代细 胞对DDP的耐药倍数无显著差异，说明裸鼠移植癌耐药性稳定； d、 肺癌多药耐药裸鼠移植瘤多药耐药基因mdrl和多药耐药相关蛋白基因mrp信 使核糖核酸mRNA的半定量，逆转录-聚合酶链式扩增反应RT-PCR分析A549/DDP细胞 裸鼠移植瘤中多药耐药基因mdrl和多药耐药相关蛋白基因mrp的相对表达量分别为： 2. 079±0. 071、3. 503±0. 044,与A549裸鼠移植瘤相比，A549/DDP裸鼠移植瘤中多药耐药 基因和多药耐药相关蛋白基因的mRNA的相对表达量均显者升1?/* <6.^7 ;提不在裸鼠耐 药移植瘤中耐药基因表达比较高，维持其耐药性； e、 肺癌多药耐药裸鼠移植瘤多药耐药蛋白P-gp和多药耐药相关蛋白MRP表达，多药耐 药蛋白P-gp在细胞膜和细胞浆中表达，多药耐药相关蛋白MRP在细胞膜中表达；A549/DDP 移植瘤多药耐药蛋白P-gp和多药耐药相关蛋白MRP表达呈强阳性，可见大量较大的棕黄色 颗粒；统计学结果表明A549/DDP移植瘤多药耐药蛋白P-gp和多药耐药相关蛋白MRP表达 水平均显著高于A549移植瘤组/7 < ft d
[0005] 本发明的优点是：肺癌裸鼠移植瘤模型耐药性稳定，肿瘤表浅便于观察，并体现完 整的生物学特性，即具有人肺腺癌的组织结构和功能特征，是较理想的多药耐药肿瘤模型， 为研究逆转肺腺癌的多药耐药提供了同人体来源、易重复的良好实验动物体系，可以用于 肺腺癌耐药机制和化疗药物筛选的研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0006] 图1是本发明的流程图； 图2是A549/DDP裸鼠移植瘤组织形态观察图（苏木精-伊红染色，光镜下观察）； 图3是裸鼠移植瘤组织多药耐药基因I (mdrl)的信使核糖核酸（mRNA)半定量表达 图； 图4是裸鼠移植瘤组织多药耐药相关蛋白基因（mrp)的信使核糖核酸（mRNA)半定量 表达图；图中，M为标尺，1为A549移植瘤，2为A549/DDP移植瘤。
[0007] 图5是A549/DDP移植瘤多药耐药蛋白（P-gp)表达图（免疫组织化学法，光镜下观 察）； 图6是A549移植瘤多药耐药蛋白（P-gp)表达图（免疫组织化学法，光镜下观察）； 图7是A549/DDP移植瘤多药耐药相关蛋白（MRP)表达图（免疫组织化学法，光镜下观 察）； 图8是A549移植瘤多药耐药相关蛋白（MRP)表达图（免疫组织化学法，光镜下观察)。
【具体实施方式】
[0008] -种多药耐药肺癌动物模型的建立及检测方法： 1.裸鼠肺癌多药耐药模型的建立方法： a、 首先进行细胞培养及鼠间接种传代。人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP， 置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37°C、5%C02条件下培养。A549/DDP细胞培 养液中顺钼（DDP)的维持浓度为6 iimol/L。常规传代培养，取对数生长期的细胞备用； b、 鼠间接种传代，建立模型。雌性近交系裸小鼠（BALB/C-nu/nu)，4?5周龄，体重 15g?17g，在无特定病原体（SPF)级动物合格环境下饲养，自由摄取水分和食物，各实验均 在无菌超净工作台中进行。无菌条件下，取对数生长期肿瘤细胞（A549及A549/DDP)，制备 细胞悬液，浓度为5 X IO7个/ml，裸鼠右腋下接种0. 2ml/只，建立第一代人肺腺癌细胞A549 和耐药株A549/DDP裸鼠移植瘤模型。
[0009] 待裸鼠皮下包块长至约IOOmm3时，脱颈法处死裸鼠，无菌条件下，分别取完好的 A549、A549/DDP瘤块，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培养基(抽样证明没有污染)，制备 瘤细胞悬液，进行细胞计数，裸鼠右腋下接种〇.2ml/只，30min内完成，建立第二代裸鼠模 型。
[0010] 待裸鼠皮下包块长至约IOOmm3时，脱颈法处死裸鼠，无菌条件下，分别取完好的 A549、A549/DDP瘤块，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培养基(抽样证明没有污染)，制备 瘤细胞悬液，进行细胞计数，裸鼠右腋下接种〇.2ml/只，30min内完成，建立第三代裸鼠模 型。
[0011] 鼠间传代至3代（6只/代)。用第4代裸鼠A549移植瘤组和A549/DDP移植瘤组 进行成模性检测。
[0012] 2.裸鼠肺癌多药耐药模型的检测方法： a、 肺癌多药耐药裸鼠移植瘤生长状况观察，第1?3代裸鼠均于移植后15±6天 (即9-21天）左右出瘤，至3周左右直径可长至5mm。第4代A549/DDP裸鼠皮下移植瘤 成功率均为1〇〇%，平均潜伏期为（7±1. 35)天，（即5. 65-8. 35天）；平均每天生长速度为 (102. 23±31. 66) mm3。两组瘤体积随时间延长逐渐增大。
【权利要求】
1. 一种多药耐药肺癌动物模型的建立方法，其特征在于： a、 首先进行细胞培养及鼠间接种传代，人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP， 置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37°C、5%C02条件下培养；A549/DDP细胞培 养液中顺钼DDP的维持浓度为6 y mol/L ;常规传代培养，取对数生长期的细胞备用； b、 鼠间接种传代，建立模型，雌性近交系裸小鼠，4?5周龄，体重15g?17g，在无特定 病原体SPF级动物合格环境下饲养，自由摄取水分和食物，各实验均在无菌超净工作台中 进行，无菌条件下，取对数生长期肿瘤细胞A549及A549/DDP，制备细胞悬液，浓度为5 X 107个/ml，裸鼠右腋下接种0. 2ml/只，建立第一代人肺腺癌细胞A549和耐药株A549/DDP裸 鼠移植瘤模型；待裸鼠皮下包块长至约100mm3时，脱颈法处死裸鼠，无菌条件下，分别取完 好的A549、A549/DDP瘤块，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培养基，抽样证明没有污染， 制备瘤细胞悬液，进行细胞计数，裸鼠右腋下接种〇. 2ml/只，30min内完成，建立第二代裸 鼠模型；待裸鼠皮下包块长至约100mm3时，脱颈法处死裸鼠，无菌条件下，分别取完好的 A549、A549/DDP瘤块，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培养基，抽样证明没有污染，制备 瘤细胞悬液，进行细胞计数，裸鼠右腋下接种〇.2ml/只，30min内完成，建立第三代裸鼠模 型；鼠间传代至3代，每代6只；用第4代裸鼠A549移植瘤组和A549/DDP移植瘤组进行成 模性检测。
2. -种按照权利要求1所述的多药耐药肺癌动物模型的建立方法建立的裸鼠肺癌多 药耐药模型的检测方法，其特征在于： a、 肺癌多药耐药裸鼠移植瘤生长状况观察，第1?3代裸鼠均于移植后15±6天， 即9-21天左右出瘤，至3周左右直径可长至5mm，第4代A549/DDP裸鼠皮下移植瘤 成功率均为1〇〇%，平均潜伏期为7±1. 35天，即5.65-8. 35天；平均每天生长速度为 102. 23±31. 66mm3,两组瘤体积随时间延长逐渐增大； b、 肺癌多药耐药裸鼠移植瘤形态学观察，肉眼观察：观察第4代移植瘤见瘤体呈局部 结节样生长，表面光滑，不易活动，收集移植瘤时见外观呈黄白色，有血管生长分布，与周围 组织边界清晰，无粘连，剖面呈粉红色，中央偶有出血坏死或液化，光镜检查：镜下移植瘤呈 现中低分化的腺癌特征，A549/DDP移植瘤则多呈实性团块状，呈椭圆形或长梭形，核大深 染，呈中度异形性，排列不整齐，核仁明显，瘤细胞呈侵润生长，坏死较少，间质有较多微血 管形成； c、 肺癌多药耐药裸鼠移植瘤耐药性检测，取裸鼠耐药移植瘤，筛网法分离细胞， 对原代细胞与移植瘤细胞进行IC5(I检测，原代A549细胞和A549/DDP细胞的IC5(I分别 为 24. 1 ii mol/L 和 335. 2 ii mol/L ;裸鼠 A549/nude 和 A549/DDP/nude 的 IC5(I 分别为 23. 8 y mol/L和321. 4 y mol/L，计算原代细胞和裸鼠移植瘤细胞的耐药倍数，耐药倍数= 耐药细胞IC5(I /亲本细胞IC5(I，分别为13. 9和13. 5,表明A549/DDP移植瘤细胞和原代细 胞对DDP的耐药倍数无显著差异，说明裸鼠移植癌耐药性稳定； d、 肺癌多药耐药裸鼠移植瘤多药耐药基因mdrl和多药耐药相关蛋白基因mrp信 使核糖核酸mRNA的半定量，逆转录-聚合酶链式扩增反应RT-PCR分析A549/DDP细胞 裸鼠移植瘤中多药耐药基因mdrl和多药耐药相关蛋白基因mrp的相对表达量分别为： 2. 079±0. 071、3. 503±0. 044,与A549裸鼠移植瘤相比，A549/DDP裸鼠移植瘤中多药耐药 基因和多药耐药相关蛋白基因的mRNA的相对表达量均显者升;提不在裸鼠耐 药移植瘤中耐药基因表达比较高，维持其耐药性； e、肺癌多药耐药裸鼠移植瘤多药耐药蛋白P-gp和多药耐药相关蛋白MRP表达，多药耐 药蛋白P-gp在细胞膜和细胞浆中表达，多药耐药相关蛋白MRP在细胞膜中表达；A549/DDP 移植瘤多药耐药蛋白P-gp和多药耐药相关蛋白MRP表达呈强阳性，可见大量较大的棕黄色 颗粒；统计学结果表明A549/DDP移植瘤多药耐药蛋白P-gp和多药耐药相关蛋白MRP表达 水平均显著高于A549移植瘤组/7 < ft d
【文档编号】G01N21/84GK104414771SQ201310369232
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】季旭明 申请人:季旭明