专利名称：一种肺癌多药耐药细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多药耐药细胞系。
背景技术：
肺癌为当前世界最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率占常见恶性肿瘤的首位，并且80％的患者在确诊时已处于中晚期，错过了手术治疗的时机。诺维本(NVB)即去甲长春花碱，为上世纪九十年代才开始应用于临床的抗肿瘤药物，它具有广谱的抗肿瘤活性，尤其是治疗非小细胞肺癌(NSCLC)，是目前单药治疗非小细胞肺癌最有效的药物之一，有效率为30％，诺维本与顺伯联合治疗肺癌是目前公认的最有效的化疗方案之一。但仍有部分肺癌患者治疗效果不佳，出现了肿瘤对药物的多药耐药(MDR)现象。
发明内容
本发明的目的是为了分析肿瘤细胞化疗耐药后的形态学及生物学习性的变化，筛选化疗药物及判断化疗药物的敏感性，分析肿瘤化疗多药耐药机制，体外筛选耐药逆转剂，提供了一种肺癌多药耐药细胞系。肺癌多药耐药细胞系按以下步骤建立(一)将对数生长期的Anip973细胞放入含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37℃、CO2浓度为5％的环境中培养；(二)待培养器内壁70％～90％的面积铺满Anip973细胞，取Anip973细胞放入经生理盐水稀释、NVB浓度为0.01～0.02μg/mL的培养液中在37℃、CO2浓度为5％的环境中继续培养24h；(三)弃去NVB液，加入等体积的RPMI-1640培养液继续培养，待存活的Anip973细胞传代、进入对数生长期后放入经生理盐水稀释、增加了NVB浓度的培养液中在37℃、CO2浓度为5％的环境中继续培养24h；(四)重复操作步骤(三)，直到NVB经生理盐水稀释后浓度为2.0～2.2μg/mL为止，即得到具有耐药性的Anip973/NVB细胞系。本发明的肺癌多药耐药细胞系(Anip973/NVB)为世界首次选用诺维本(NVB)筛选建立人肺腺癌耐药细胞系。由于药物诺维本(NVB)具有广谱的抗肿瘤活性，所以将来通过诺维本(NVB)筛选建立的肺癌多药耐药细胞系(Anip973/NVB)分析得到的肿瘤细胞化疗耐药后的形态学及生物学习性的变化，筛选得到的化疗药物及判断得出的化疗药物的敏感性，分析得到的肿瘤化疗多药耐药机制，体外筛选得到的耐药逆转剂更具有代表性、针对性、可靠性和广谱性。
图1是光学显微镜下Anip973细胞观察图；图2是光学显微镜下Anip973/NVB细胞观察图；图3是透射电镜下Anip973细胞观察图；图4是透射电镜下Anip973/NVB细胞观察图；图5是Anip973细胞和Anip973/NVB细胞生长曲线图，图中粗曲线代表Anip973细胞生长曲线，图中细曲线代表Anip973/NVB细胞生长曲线；图6是Anip973细胞细胞周期分析图；图7是Anip973/NVB细胞细胞周期分析图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式肺癌多药耐药细胞系按以下步骤建立(一)将对数生长期的Anip973细胞放入含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37℃、CO2浓度为5％的环境中培养；(二)待培养器内壁70％～90％的面积铺满Anip973细胞，取Anip973细胞放入经生理盐水稀释、NVB浓度为0.01～0.02μg/mL的培养液中在37℃、CO2浓度为5％的环境中继续培养24h；(三)弃去NVB液，加入等体积的RPMI-1640培养液继续培养，待存活的Anip973细胞传代、进入对数生长期后放入经生理盐水稀释、增加了NVB浓度的培养液中在37℃、CO2浓度为5％的环境中继续培养24h；(四)重复操作步骤(三)，直到NVB经生理盐水稀释后浓度为2.0～2.2μg/mL为止，即得到具有耐药性的Anip973/NVB细胞系。
本实施方式中的Anip973细胞在液氮中保存(冻存液按体积百分比由60％的1640细胞培养液、30％的优级胎牛血清和10％的DMSO组成)。冻存细胞复苏将装有冻存Anip973细胞的冻存管从液氮中取出后立即37℃水浴快速解冻，轻摇冻存管使其在1min内全部融化，以70％酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内；解冻细胞悬浮液用RPMI-1640培养液稀释至10mL后混均离心(1000r/min离心10min)，弃去上清液，加生理盐水至10mL，再次离心(1000r/min离心10min)，弃去上清液，向细胞沉淀中加入RPMI-1640培养液，用移液枪打匀后移入培养瓶放入37℃、CO2浓度为5％的环境中培养。
对本实施方式建立的具有多药耐药性的Anip973/NVB细胞系进行细胞生物学特性检测1、形态学观察(1)光学显微镜观察分别取对数生长期的Anip973细胞和Anip973/NVB细胞，生理盐水清洗换液后，在倒置显微镜(×200倍)下观察活细胞的形态结构。通过光镜可观察到Anip973细胞呈类圆形，大小及形态均较规则(如图1所示)，Anip973/NVB细胞稍大，形态不规则，呈长伪足的多角形，体积增大出现巨大细胞(如图2所示)。
(2)透射电镜观察分别取对数生长期的Anip973细胞和Anip973/NVB细胞2×107个，经浓度为0.3％的胰酶消化1～5min后1000r/min离心10min，再用PBS缓冲液反复洗涤3次，之后细胞团用4℃预冷、浓度为0.25％的戊二醛固定，常规梯度脱水、包埋，制备超薄切片，经醋酸双氧铀和铅染液双染后，在透射电子显微镜(×8000倍)下观察细胞超微结构。通过透射电子显微镜观察到Anip973细胞表面有许多密集分布的微绒毛，胞核大，胞浆少，核浆比例大，胞浆内可见散在游离核糖体，线粒体嵴粗大，基质密度大，粗面内质网上单位膜核糖体颗粒清晰可见(如图3所示)；而Anip973/NVB细胞表面微绒毛有脱失，胞核变小，核浆比例减小，核内染色质出现斑块状高密度分布，胞浆内空泡结构明显增多，游离核糖体聚集且数量增多，粗面内质网脱颗粒(如图4所示)。
通过光学显微镜和透射电镜的观察可以在细胞形态和细胞超微结构上明显区分Anip973细胞和Anip973/NVB细胞。
2、测定细胞生长曲线和倍增时间取对数生长期的Anip973细胞和Anip973/NVB细胞进行消化后接种于24孔板，每孔细胞1×104个，于24、48、72、96、120小时计算细胞数，每次计数3孔，取平均值绘制细胞生长曲线，并计算倍增时间(Td)。按Patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间Td(h)＝Tlg2/lg(N/N0)(T代表细胞对数增值时间，N和N0分别代表对数生长期的起始和终止时的细胞数)。经过多天连续测定两细胞生长曲线发现，两细胞系的生长曲线形态相似(如图5所示)，无明显差异，而Anip973细胞和Anip973/NVB细胞的倍增时间分别为23.45h和24.21h，Anip973/NVB细胞与Anip973细胞增殖速度接近，表明Anip973/NVB细胞的增殖未受到明显抑制。
3、流式细胞仪分析细胞周期分别取对数生长期的Anip973细胞和Anip973/NVB细胞2×107个，经浓度为0.3％的胰酶消化1～5min后1000r/min离心10min，用4～10℃的PBS缓冲液洗涤两次，再用浓度为70％的乙醇固定细胞24h；上机测定前离心去除乙醇，再用PBS缓冲液洗涤两次，之后加入浓度为100μg/mL的RNase在37℃反应30min后用浓度为50μg/mL的碘化丙锭(propidium iodide，PI)染色30min，然后尼龙网过滤，送入流式细胞仪测定，计算出细胞周期的分布。通过仪器分析得出Anip973/NVB细胞系较亲代细胞的细胞周期分布发生明显改变，其主要改变表现为耐药细胞系Anip973/NVB的G0～G1期细胞明显增多，为62.90％，S期细胞明显减少，为28.32％；而Anip973细胞上述各周期的百分比分别为53.73％、38.25％(数据如表1所示)，两种细胞系G2～M期细胞无明显变化(如图6所示、如图7所示)。
表1
4、耐药谱分析(MTT法)分别取处于对数生长期的Anip973细胞和Anip973/NVB细胞，经浓度为0.3％的胰酶消化1～5min后加10mL生理盐水，在1000r/min的条件下离心10min并重复离心一次，计数，以每孔1×104个的细胞浓度接种于96孔培养板，每孔加含10％优级胎牛血清的RPMI-1640培养液180μL，培养24h后加入用生理盐水稀释(每种药物设五个浓度，各浓度间相差10倍)的化疗药物(NVB、顺铂、吉西他滨、紫杉醇、伊立替康、足叶乙甙、异环磷酰胺、氟尿嘧啶、达卡巴嗪、表阿霉素)20μL，均设3个复孔，对照孔加生理盐水20μL，共同作用48h后，每孔加入20μL MTT溶液，再培养4h后去除培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，震荡后在全自动酶标仪上选择波长为490nm测定吸光值(A值)，比色时空白孔调零，全部实验重复3次，数据取平均值。根据A值采用线性回归计算各药物的半数抑制率(IC50)，计算相对耐药指数(RI)，RI＝IC50(Anip973/NVB)/IC50(Anip973)。MTT法耐药谱分析表明Anip973/NVB细胞系对NVB的耐药倍数为21.81倍，除此之外，该细胞系对顺铂、紫杉醇、异环磷酰胺、表阿霉素、氟尿嘧啶达卡巴嗪和足叶乙甙药物也产生了交叉耐药，耐药倍数分别为11.89、11.68、6.12、3.95、2.86、2.64和2.15，而对伊立替康、吉西他滨仍保持敏感耐药，倍数分别为1.38、1.27(均P＜0.05)，具体数据如表2所示。
表2
5、高效液相(HPLC)色谱法测定细胞内NVB的浓度取出对数生长期的Anip973细胞和Anip973/NVB细胞，以NVB浓度为2.0μg/mL的RPMI-1640培养液培养，24h后消化细胞进行如下处理(1)取105～106个细胞用4℃的PBS缓冲溶液洗涤，再在1000r/m的条件下离心30min，弃去上清；(2)重复操作(1)3次后反复冻融3次(-80℃ 30s，37℃ 5min)，再在4℃、10000r/min的条件下离心10min，加4℃甲醇涡旋2min，然后在在4℃、10000r/min的条件下离心10min，取上清液；(3)向(2)提取上清液后剩余的细胞沉淀中加4℃甲醇涡旋2min，再在4℃、10000r/min的条件下离心10min，取上清液；(4)合并(2)和(3)提取的上清液，吹干上清液，再用流动相溶解，进行HPLC检测。
经过高效液相(HPLC)色谱法测定发现，加药24h后，Anip973细胞内的药物浓度为0.22±0.05μg/mL，未检测到Anip973/NVB细胞内的药物浓度。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(三)中经生理盐水稀释的NVB液浓度为0.03～0.04μg/mL。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(四)中重复操作步骤(三)197～216次，每次增加NVB液浓度0.01μg/mL。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(四)中重复操作步骤(三)100～120次，每次增加NVB液浓度0.01～0.02μg/mL。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(四)中重复操作步骤(三)50～80次，每次增加NVB液浓度0.02～0.04μg/mL。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(四)中重复操作步骤(三)20～30次，前10次每次增加NVB液浓度0.02～0.04μg/mL，之后每次增加NVB液浓度0.09～0.18μg/mL。其它步骤与实施方式一相同。
权利要求
1.一种肺癌多药耐药细胞系，其特征在于肺癌多药耐药细胞系按以下步骤建立(一)将对数生长期的Anip973细胞放入含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37℃、CO2浓度为5％的环境中培养；(二)待培养器内壁70％～90％的面积铺满Anip973细胞，取Anip973细胞放入经生理盐水稀释、NVB浓度为0.01～0.02μg/mL的培养液中在37℃、CO2浓度为5％的环境中继续培养24h；(三)弃去NVB液，加入等体积的RPMI-1640培养液继续培养，待存活的Anip973细胞传代、进入对数生长期后放入经生理盐水稀释、增加了NVB浓度的培养液中在37℃、CO2浓度为5％的环境中继续培养24h；(四)重复操作步骤(三)，直到NVB经生理盐水稀释后浓度为2.0～2.2μg/mL为止，即得到具有耐药性的Anip973/NVB细胞系。
2.根据权利要求1所述的一种肺癌多药耐药细胞系，其特征在于步骤(三)中经生理盐水稀释的NVB液浓度为0.03～0.04μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种肺癌多药耐药细胞系，其特征在于步骤(四)中重复操作步骤(三)197～216次，每次增加NVB液浓度0.01μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种肺癌多药耐药细胞系，其特征在于步骤(四)中重复操作步骤(三)100～120次，每次增加NVB液浓度0.01～0.02μg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种肺癌多药耐药细胞系，其特征在于步骤(四)中重复操作步骤(三)50～80次，每次增加NVB液浓度0.02～0.04μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种肺癌多药耐药细胞系，其特征在于步骤(四)中重复操作步骤(三)20～30次，前10次每次增加NVB液浓度0.02～0.04μg/mL，之后每次增加NVB液浓度0.09～0.18μg/mL。
全文摘要
一种肺癌多药耐药细胞系，它涉及一种多药耐药细胞系。本发明的为了分析肿瘤细胞化疗耐药后的形态学及生物学习性的变化，筛选化疗药物及判断化疗药物的敏感性，分析肿瘤化疗多药耐药机制，体外筛选耐药逆转剂，提供了一种肺癌多药耐药细胞系。肺癌多药耐药细胞系建立(一)将Anip973细胞放入含胎牛血清、青霉素、链霉素的培养液中，置于37℃、CO
文档编号C12N5/08GK1884493SQ20061001025
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月5日 优先权日2006年7月5日
发明者陈公琰, 杨朝阳, 王萌, 洪璇 申请人:哈尔滨医科大学