专利名称：不添加植物激素的刺五加培养方法
技术领域：
本发明涉及一种刺五加培养方法。
背景技术：
刺五加(Eleutherococcus senticosus Maxim)为五加科多年生落叶灌木，根、茎、叶均可入药，因为药用价值显著，其提取物的国际市场价格已远高于人参。随着野生资源的枯竭和市场需求的增大，刺五加的人工栽培技术受到重视。但目前人工栽培刺五加存在种子处理难度大、发芽率低和扦插生根率低的问题；虽然现有的细胞培养技术可以弥补以上的缺陷，但细胞培养过程中使用的植物激素已被证实对人体有害(2，4二氯苯氧乙酸等有致癌作用)，因此利用植物激素培育出的刺五加在食用、药用方面的安全性难以得到保证。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前人工栽培种子处理难度大、发芽率低、扦插生根率低和现有细胞培养技术使用的植物激素对人体有害的问题，而提供的一种不添加植物激素的刺五加培养方法。不添加植物激素的刺五加培养方法按以下步骤进行(一)将刺五加的种子与粗砂按1∶10的体积比混合，放入15℃的培养箱中层积处理3～4个月，每周浇水1次以保持粗砂湿润；(二)去掉胚形态成熟种子的外种皮，将去掉外种皮的种子放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡4～10min，然后接种于不添加植物激素的培养基，置于25±1℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为14～16h的环境中培养；(三)选用子叶先出的种子，当子叶露出胚乳外1～3天便转入温度为37～42℃的环境中高温胁迫处理1～5天；(四)将停止发育的种子放回步骤二的培养环境中继续培养直至长出体细胞胚；(五)将由体细胞胚发育成的幼植物体的片断或体细胞胚接种于不添加植物激素的培养基，置于25～30℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至培养出次生胚；(六)将次生胚接种于不添加植物激素的培养基，置于21℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至发育成幼植物体；(七)幼植物体转移到不添加植物激素的培养基，置于21℃、光照强度为35～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养3～4周，即可得到完整的刺五加植株。本发明步骤一中使用的粗砂粒径为30～50目；每周浇水1次，每次浇水至粗砂的含水量达到饱和为止。
本发明避免了人工栽培中种子处理难度大、发芽率低、扦插生根率低的问题，不添加任何植物激素，安全可靠，而且技术简单，发芽速度快，增殖率高，次生胚发生率达100％。
图1是本发明中子叶先出的种子的图；图2是本发明中在子叶上直接形成体细胞胚的图；图3是本发明中液体培养基培养出的次生胚图；图4是本发明中在液体培养基中发育的幼植物体图；图5是本发明中完整刺五加植株的图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式不添加植物激素的刺五加培养方法按以下步骤进行(一)将刺五加的种子与粗砂按1∶10的体积比混合，放入15℃的培养箱中层积处理3～4个月，每周浇水1次以保持粗砂湿润；(二)去掉胚形态成熟种子的外种皮，将去掉外种皮的种子放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡4～10min，然后接种于不添加植物激素的培养基，置于25±1℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为14～16h的环境中培养；(三)选用子叶先出的种子，当子叶露出胚乳外1～3天便转入温度为37～42℃的环境中高温胁迫处理1～5天；(四)将停止发育的种子放回步骤二的培养环境中继续培养直至长出体细胞胚；(五)将由体细胞胚发育成的幼植物体的片断或体细胞胚接种于不添加植物激素的培养基，置于25～30℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至培养出次生胚；(六)将次生胚接种于不添加植物激素的培养基，置于21℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至发育成幼植物体；(七)幼植物体转移到不添加植物激素的培养基，置于21℃、光照强度为35～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养3～4周，即可得到完整的刺五加植株。
本实施方式中子叶先出的种子占种子总数的3～7％；经高温胁迫处理停止发育的种子在胚乳表面和子叶边缘出现轻微的褐化现象，即便转回到原来的培养环境中也不恢复正常发育，3～4周后100％长出体细胞胚。本实施方式中次生胚发生率为100％。
具体实施例方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(二)中用于接种的培养基是每升加入10～90g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3～1/2的MS培养基。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(三)可将高温胁迫处理后未停止发育的种子重复进行高温胁迫处理，直至种子停止发育。其它步骤与实施方式一相同。
本实施方式进行1～2次，子叶先出的种子全部停止发育，能更多的获得可长出体细胞胚的种子。
具体实施例方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(五)中用于接种的培养基是每升加入10～60g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3×～2×的固体MS培养基。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(五)中用于接种的培养基是每升加入10～60g蔗糖、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3×～2×的液体MS培养基。其它步骤与实施方式一相同。
本实施方式将液体MS培养基放入100r/min的摇床进行悬浮培养，培养2周后出现次生胚。本实施方式获得的次生胚重量是采用固体MS培养基培养的5倍。
具体实施例方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(五)重复进行3～4次。其它步骤与实施方式一相同。
体细胞胚的继代培养周期为4～8周。本实施方式可获得次生胚生长率高(200mg体细胞胚培养4～8周可得到1.4g～2.1g次生胚)，增殖系数高的体细胞胚系，该体细胞胚系可稳定增殖和维持4年以上。
具体实施例方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(六)中用于接种的培养基是每升加入10g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3～1/2的固体MS培养基。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(六)中用于接种的培养基是每升加入10g蔗糖、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3～1/2的液体MS培养基。其它步骤与实施方式一相同。
本实施方式中次生胚的发育速度比在固体MS培养基中培养快20～40％。
具体实施例方式
九本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(六)将次生胚和不添加植物激素、每升加入10g蔗糖、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3～1/2的液体MS培养基放入气升式或鼓泡式生物反应器，再置于21℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至发育成幼植物体。其它步骤与实施方式一相同。
本实施方式通过气升式或鼓泡式生物反应器培养体细胞胚，扩大了培养规模，降低了成本，实现了工厂化规模生产。
具体实施例方式
十本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(七)中幼植物体转移到的培养基是每升加入10g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3的MS培养基。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施例方式
十一本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(二)中用于接种的培养基是每升加入20～80g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.75、无机盐浓度为1/2的MS培养基。其它步骤与实施方式二相同。
具体实施例方式
十二本实施方式与具体实施方式
四的不同点是步骤(五)中用于接种的培养基是每升加入20～50g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.75、无机盐浓度为1/2×～3/2×的固体MS培养基。其它步骤与实施方式四相同。
具体实施例方式
十三本实施方式与具体实施方式
五的不同点是步骤(五)中用于接种的培养基是每升加入20～50g蔗糖、pH值为5.75、无机盐浓度为1/2×～3/2×的液体MS培养基。其它步骤与实施方式五相同。
具体实施例方式
十四本实施方式不添加植物激素的刺五加培养方法按以下步骤进行(一)将刺五加的种子与粗砂按1∶10的体积比混合，放入15℃的培养箱中层积处理3～4个月，每周浇水1次以保持粗砂湿润；(二)去掉胚形态成熟种子的外种皮，将去掉外种皮的种子用自来水冲12小时后用浓度为70％的酒精浸泡30秒，蒸馏水冲洗2遍，再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10min，然后用无菌蒸馏水冲洗5遍，接种于不添加植物激素、每升加入10～90g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3的MS培养基，置于25℃、光照强度为40μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养；(三)选用子叶先出的种子(如图1所示)，当子叶露出胚乳外1～3天便转入温度为37～42℃的环境中高温胁迫处理1～5天；(四)将停止发育的种子放回步骤二的培养环境中继续培养直至长出体细胞胚(如图2所示)；(五)将体细胞胚接种于不添加植物激素、每升加入10～60g蔗糖、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3的液体MS培养基，置于25℃、光照强度为40μmol/m2·s、日照时间为16h、100r/min的摇床中培养，直至培养出次生胚(如图3所示)，并重复进行3～4次；(六)将次生胚和不添加植物激素、每升加入10g蔗糖、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3的液体MS培养基放入空气注入量为0.1～1.0vvm的气升式或鼓泡式生物反应器中，再置于21℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至发育成幼植物体(如图4所示)；(七)幼植物体转移到不添加植物激素、每升加入10g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3的MS培养基，置于21℃、光照强度为37～42μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养3～4周，即可得到完整的刺五加植株(如图5所示)。
权利要求
1.不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于不添加植物激素的刺五加培养方法按以下步骤进行(一)将刺五加的种子与粗砂按1∶10的体积比混合，放入15℃的培养箱中层积处理3～4个月，每周浇水1次以保持粗砂湿润；(二)去掉胚形态成熟种子的外种皮，将去掉外种皮的种子放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡4～10min，然后接种于不添加植物激素的培养基，置于25±1℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为14～16h的环境中培养；(三)选用子叶先出的种子，当子叶露出胚乳外1～3天便转入温度为37～42℃的环境中高温胁迫处理1～5天；(四)将停止发育的种子放回步骤二的培养环境中继续培养直至长出体细胞胚；(五)将由体细胞胚发育成的幼植物体的片断或体细胞胚接种于不添加植物激素的培养基，置于25～30℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至培养出次生胚；(六)将次生胚接种于不添加植物激素的培养基，置于21℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至发育成幼植物体；(七)幼植物体转移到不添加植物激素的培养基，置于21℃、光照强度为35～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养3～4周，即可得到完整的刺五加植株。
2.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(二)中用于接种的培养基是每升加入10～90g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3～1/2的MS培养基。
3.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(三)可将高温胁迫处理后未停止发育的种子重复进行高温胁迫处理，直至种子停止发育。
4.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(五)中用于接种的培养基是每升加入10～60g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3×～2×的固体MS培养基。
5.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(五)中用于接种的培养基是每升加入10～60g蔗糖、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3×～2×的液体MS培养基。
6.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(五)重复进行3～4次。
7.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(六)中用于接种的培养基是每升加入10g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3～1/2的固体MS培养基。
8.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(六)中用于接种的培养基是每升加入10g蔗糖、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3～1/2的液体MS培养基。
9.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(六)将次生胚和不添加植物激素、每升加入10g蔗糖、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3～1/2的液体MS培养基放入气升式或鼓泡式生物反应器，再置于21℃、光照强度为25～45μmol/m2·s、日照时间为16h的环境中培养，直至发育成幼植物体。
10.根据权利要求1所述的不添加植物激素的刺五加培养方法，其特征在于步骤(七)中幼植物体转移到的培养基是每升加入10g蔗糖和5.5g琼脂、pH值为5.7～5.8、无机盐浓度为1/3的MS培养基。
全文摘要
不添加植物激素的刺五加培养方法，它涉及一种刺五加培养方法。它解决了目前人工栽培种子处理难度大、发芽率低、扦插生根率低和现有细胞培养技术使用的植物激素对人体有害的问题。不添加植物激素的刺五加培养方法按以下步骤进行(一)15℃层积处理；(二)培养去掉外种皮的种子；(三)高温胁迫处理；(四)将停止发育的种子放回步骤二的培养环境中继续培养；(五)培养由体细胞胚发育成的幼植物体的片断或体细胞胚；(六)培养次生胚；(七)培养幼植物体，即可得到完整的刺五加植株。本发明不添加任何植物激素，安全可靠，而且技术简单，发芽速度快，增殖率高，次生胚发生率达100％。
文档编号C12N5/04GK1830243SQ20061000978
公开日2006年9月13日 申请日期2006年3月8日 优先权日2006年3月8日
发明者李成浩, 杨传平, 刘桂丰, 牛遇达, 赵波, 韩君 申请人:东北林业大学