专利名称：一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组杆状病毒的制备方法。
背景技术：
近几年来，世界各地出了多种禽类传染性疾病的新变种，造成野生禽鸟和家禽的大量感染死亡，例如2004年，2005年出现的高致病性禽流感(H5N1)。目前对禽类传染性疾病的防治主要采用疫苗，而疫苗多采用对病原体进行减毒、灭活或基因重组的方法制备，迄今为止，世界上还没有采用可直接侵染禽类细胞的重组杆状病毒制备禽类疫苗的相关报道。
发明内容
本发明为了制作出可防治禽类传染性疾病的重组杆状病毒疫苗，而提供的一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，本发明所述的一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法按下述步骤实现(一)构建含有CMV-IE启动子的穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)；(二)构建带有CMV-IE启动子和外源基因的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’；(三)构建重组杆状病毒，并收集病毒粒子测定病毒效价；(四)检测重组杆状病毒外源基因的表达；所述的步骤(三)包括1.用重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’转化DH10Bac细胞；2.提取重组杆状病毒BacmidDNA；3.特异引物PCR扩增重组杆状病毒Bacmid DNA；4.重组杆状病毒Bacmid DNA转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒；5.扩增重组杆状病毒；6.蚀斑试验；7.蚀斑纯化；8.收集重组杆状病毒的病毒粒子；9.测定重组杆状病毒的病毒效价。
按本发明制备出的可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒因为具有多克隆插入位点，可插入多种不同的外源基因片段，所以可携带多种不同的外源基因，将其制成禽类疫苗可预防和治疗多种禽类传染性疾病。本发明制备出的重组杆状病毒可将外源基因片段高效引入禽类原代细胞，在细胞生长条件下加入少量重组杆状病毒十几小时后便可检测出外源基因编码的蛋白质，二十四小时后蛋白质表达达到最高峰。例如重组杆状病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)外源基因转染鸡的骨胳肌细胞和成纤维细胞，24小时后测得GFP的表达率分别高达80％和92％。本发明制备出的重组杆状病毒具有价格低廉、效价稳定、对禽类细胞无毒性的优点，为制作出可防治禽类传染性疾病的重组杆状病毒疫苗奠定了物质基础。
图1是构建含有CMV-IE启动子的穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)的示意图；图2是带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’的结构简图；图3是DH10Bac E.coli细胞中的杆粒Bacmid的结构简图；图4是病毒滴度为250个感染复数(MOI)时，重组杆状病毒侵染鸡原代骨胳肌细胞24h后外源基因GFP在荧光下表达的照片；图5是病毒滴度为250个感染复数(MOI)时，重组杆状病毒侵染鸡原代成纤维细胞24h后外源基因GFP在荧光下表达的照片；图6是重组杆状病毒侵染鸡原代细胞24h后，不同感染复数下外源基因GFP的表达率图，其中浅色条柱表示鸡原代骨胳肌细胞被重组杆状病毒侵染24h后外源基因GFP的表达率，深色条柱表示鸡原代成纤维细胞被重组杆状病毒侵染24h后外源基因GFP的表达率。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式按以下步骤制备可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒(一)构建含有CMV-IE启动子的穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)；(二)构建带有CMV-IE启动子和外源基因的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’；(三)构建重组杆状病毒，并收集病毒粒子测定病毒效价；(四)检测重组杆状病毒外源基因的表达；所述的步骤(三)包括1.用重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’转化DH10Bac细胞；2.提取重组杆状病毒Bacmid DNA；3.特异引物PCR扩增重组杆状病毒BacmidDNA；4.重组杆状病毒Bacmid DNA转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒；5.扩增重组杆状病毒；6.蚀斑试验；7.蚀斑纯化；8.收集重组杆状病毒的病毒粒子；9.测定重组杆状病毒的病毒效价。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(一)包括1.从pcDNA3.1(-)质粒中获得含有CMV-IE启动子的pcDNA3.1(-)3.1kb片段；2.去除杆状病毒质粒pFastBac1中的杆状病毒核多角体蛋白基因启动子；3.连接pcDNA3.1(-)3.1kb片段和pFastBac1骨架；4.连接产物转化感受态细胞DH5α；5.提取含有CMV-IE启动子的质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(二)构建带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’；本步骤包括1.PCR扩增带有GFP基因的DNA片段；2.对PCR扩增产物进行双酶切；3.对质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)进行双酶切；4.将双酶切后含GFP的DNA片段与已经双酶切的pFastBac1-pcDNA3.1(-)连接；5.连接产物转化感受态细胞DH5α；6.提取带有CMV-IE启动子和外源基因GFP 的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(三)1.用带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’转化DH10Bac细胞。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(四)包括1.重组杆状病毒侵染鸡原代细胞；2.统计重组杆状病毒外源基因的表达。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(三)3中特异引物为M13Forward 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13Reverse5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。其它步骤与实施方式一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤(二)双酶切中使用的酶为KpnI和XhoI。其它步骤与实施方式三相同。
具体实施方式
八本实施方式按以下步骤制备用于禽类的重组杆状病毒疫苗(一)结合图1说明含有CMV-IE启动子的穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)的构建1.从pcDNA3.1(-)质粒中获得含有CMV-IE启动子的pcDNA3.1(-)3.1kb片段利用限制性内切酶NruI和BstZ17I双酶切质粒pcDNA3.1(-)(Invitrogen，CA)，可以得到包括CMV-IE启动子、多克隆位点(MCS)和新霉素抗性标记在内的3.1kb长的DNA片段。
酶切体系和反应条件如下pcDNA3.1(-)质粒 10LNruI 2.5LBstZ17I 2.5LNEBuffer35L加ddH2O至体积为50L37℃水浴4h，胶回收目的片段。
2.去除杆状病毒质粒pFastBac1中的杆状病毒核多角体蛋白基因启动子用限制性内切酶SnaBI和HpaI双酶切pFastBac1质粒DNA，以去除杆状病毒多角体蛋白基因启动子和多克隆位点，产生一个pFastBac1骨架。先用SnaBI单酶切，酶切体系和反应条件如下pFastBac1质粒DNA 10LSnaBI2.5LNEBuffer 4+BSA 5L加ddH2O至体积为50L37℃水浴2h，酶切结束后加入5L浓度为3mol/L的醋酸钠溶液和50L异丙醇，静置沉淀，沉淀物用浓度为70％的乙醇洗一遍，再用42.5L的ddH2O溶解后进行HpaI酶切，反应体系(50L)为SnaBI单切产物42.5LHpaI 2.5LNEBuffer 4 5L37℃水浴2h后胶回收目的片段。
3.连接pcDNA3.1(-)3.1kb片段和pFastBac1骨架通过平末端连接将以NruI和BstZ17I为酶切末端的pcDNA3.1(-)3.1Kb片段与以SnaBI和HpaI为酶切末端的pFastBac1骨架连接起来。连接体系如下
5×Ligation Buffer(含ATP)4LpFastBac1骨架2.5LpcDNA3.1(-) 3.1Kb片段5L连接酶 T4 DNA Ligase 1L加ddH2O至体积为20L室温连接30min。
4.连接产物转化感受态细胞DH5α将50～100L的感受态细胞DH5α从-70℃取出放在冰上融化后加入5L(一)3的连接产物，并在冰中放置30分钟，然后42℃热休克90秒，接着立即冰浴2～3min，冰浴后将其加入900L、37℃预热的S.O.C液体培养基中；S.O.C液体培养基在37℃、160～200r/min的条件下振荡培养1小时，之后以4000r/min的速度离心3min，最后弃去上清液，仅保留180～220L沉淀，并将沉淀混匀后涂布于LB琼脂平板上，37℃培养8～12h；其中LB琼脂平板含有7μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素。
5.提取含有CMV-IE启动子的质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)采用碱裂解法提取CMV-IE启动子的质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)随机挑取生长于LB平板上的数个白色单菌落分别接种于含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h。取1.5mL培养液置于微量离心管中，10000g离心30s，弃去上清液，将沉淀重悬于100L冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCI，10mM EDTA，pH8.0)中，剧烈振荡以分散沉淀；再加入200L新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，颠倒混匀几次后冰浴5分钟，然后加入150L溶液III(100mL溶液III按5M乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL的比例配置)，温和颠倒混匀数次，冰浴10分钟后在4℃、12000g的条件下离心10分钟，取上清液加入等体积的酚、氯仿各抽提一次，取上层水相加入1倍体积-20℃的异丙醇，沉淀10分钟。之后在4℃、12000g的条件下离心15分钟，弃去上清液，沉淀物用浓度为70％的乙醇洗涤1次后在室温下真空干燥；干燥后将其溶于37℃、含有20μg/mL RNA酶的TE(10mMTris-HCI，1mM EDTA，pH8.0，不含DNA酶)中作用30分钟。取2L进行琼脂糖凝胶电泳分析，挑选分子量大于pFastBac1骨架的DNA做进一步鉴定。
(二)结合图2说明带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’的构建
1.PCR扩增带有GFP基因的DNA片段反应体系为10×PCR Buffer 5μLdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP各2.5mol/L) 4μL引物15′-CTACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′(20pmol/L)1μL引物25′-AGCGGTACCTCAATCTGAGTACTTGTACAGC-3′(20pmol/L) 1μL模板DNA pEGFP1 3μLTaq DNA聚合酶 0.5μL加ddH2O至体积为50μL反应程序见表1表1
2.对PCR扩增产物进行双酶切PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，以1％低熔点琼脂糖回收纯化目的片段，并进行KpnI和XhoI双酶切，首先进行KpnI单酶切，酶切体系如下PCR产物 10μLKpnI2.5μLNEBuffer1+BSA 5μL加ddH2O至体积为50L37℃水浴2h，之后加入5μL浓度为3mol/L的醋酸钠溶液和50μL异丙醇，静置沉淀，再用浓度为70％的乙醇洗一遍，用42.5μLddH2O溶解，再用XhoI进行酶切，酶切体系如下KpnI单酶切产物 42.5μLXhoI2.5μLNEBuffer2+BSA 5μL37℃水浴2h。
3.对质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)进行双酶切质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)进行KpnI和XhoI双酶切，首先进行KpnI单酶切，酶切体系如下质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-) 10μLKpnI2.5μL
NEBuffer1+BSA 5μL加ddH2O至体积为50L37℃水浴2h，之后加入5μL浓度为3mol/L的醋酸钠溶液和50μL异丙醇，静置沉淀，再用浓度为70％的乙醇洗一遍，用42.5μLddH2O溶解，再用XhoI进行酶切，酶切体系如下KpnI单酶切产物 42.5μLXhoI2.5μLNEBuffer2+BSA 5μL37℃水浴2h。
4.将双酶切后含GFP的DNA片段与已经双酶切的pFastBac1-pcDNA3.1(-)连接连接体系如下5×Ligation Buffer(含ATP) 4μL已经双酶切的pFastBac 1-pcDNA3.1(-) 2.5μL双酶切后含GFP的DNA片段 5μLT4DNA Ligase1μL加ddH2O至体积为20L室温连接30min。
5.连接产物转化感受态细胞DH5α将50～100L的感受态细胞DH5α从-70℃取出放在冰上融化后加入5L(二)4的连接产物，并在冰中放置30分钟，然后42℃热休克90秒，接着立即冰浴2～3min，冰浴后将其加入900L、37℃预热的S.O.C液体培养基中；S.O.C液体培养基在37℃、160～200r/min的条件下振荡培养1小时，之后以4000r/min的速度离心3min，最后弃去上清液，仅保留180～220L沉淀，并将沉淀混匀后涂布于LB琼脂平板上，37℃培养8～12h；其中LB琼脂平板含有7μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素。
6.提取带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’采用碱裂解法提取带有外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’随机挑取生长于LB平板上的数个白色单菌落分别接种于含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h。取1.5mL培养液置于微量离心管中，10000g离心30s，弃去上清液，将沉淀重悬于100L冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCI，10mM EDTA，pH8.0)中，剧烈振荡以分散沉淀；再加入200L新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，颠倒混匀几次后冰浴5分钟，然后加入150L溶液III(100mL溶液III按5M乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL的比例配置)，温和颠倒混匀数次，冰浴10分钟后在4℃、12000g的条件下离心10分钟，取上清液加入等体积的酚、氯仿各抽提一次，取上层水相加入1倍体积-20℃的异丙醇，沉淀10分钟。之后在4℃、12000g的条件下离心15分钟，弃去上清液，沉淀物用浓度为70％的乙醇洗涤1次后在室温下真空干燥；干燥后将其溶于37℃、含有20μg/mL RNA酶的TE(10mM Tris-HCI，1mM EDTA，pH8.0，不含DNA酶)中作用30分钟。取2L进行琼脂糖凝胶电泳分析，挑选分子量大于pFastBac1骨架的DNA做进一步鉴定。
(三)构建重组杆状病毒，并收集病毒粒子测定病毒效价1.用带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’转化DH10Bac细胞将100μL DH10Bac E.coli感受态细胞从-70℃取出放在冰上融化，加入5μL带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’，混匀后放入冰中30分钟，然后42℃热休克45秒，接着立即冰浴2分钟，冰浴后将其加入900L、37℃预热的S.O.C液体培养基中；S.O.C液体培养基在37℃、225r/min的条件下振荡培养4小时，之后对S.O.C培养基进行梯度稀释(10-1，10-2，10-3)，每个梯度中取100μL涂于含有50μg/mL卡那霉素，7μg/mL庆大霉素，10μg/mL四环素，100μg/mLX-gal和40μg/mL IPTG的.LB琼脂平板，在37℃培养48小时。带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’插入DH10BacE.coli感受态细胞杆粒Bacmid(Bacmid结构如图3所示)中形成白色克隆体，再对白色克隆体进行筛选、分析。
2.提取重组杆状病毒Bacmid DNA用无菌牙签挑取.LB琼脂平板培养基上培养的单菌落放入37℃、含有100μg卡那霉素、14μg庆大霉素、20μg四环素的2mL液体LB培养基中培养至细菌停滞期。将1.5mL菌液移入离心管，在14000g条件下离心1分钟；将上清液弃出干净后，沉淀重悬于0.3mL溶液I(15mMTris-HCI，10mM EDTA，100μg/mL RNase A；过滤除菌，4℃保存)中，轻柔振荡以分散沉淀；再加入0.3mL溶液II(0.2MNaOH，1％SDS，过滤除菌)，轻柔混匀，室温静置5分钟，缓慢加入0.3mL 3M乙酸钾(pH5.5)，边加入边混匀；之后溶液冰浴静置5～10分钟，在14000g条件下离心10分钟，然后加入150uL溶液III(100mL溶液III按5M乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL的比例配置)，温和颠倒混匀数次，冰浴10分钟后在4℃、14000g条件下离心10分钟，取上清液加入0.8mL异丙醇，混匀，冰浴5-10分钟，再在14000g、室温条件下离心10分钟；弃去上清液，沉淀用0.5mL浓度为70％的乙醇洗涤1次后再在14000g、室温条件下离心5分钟；将上清液弃出干净后，沉淀物室温下干燥5～10分钟，再用40μL、pH值为8.0的TE Buffer重悬DNA，4℃保存。
3.特异引物PCR扩增重组杆状病毒Bacmid DNAPCR扩增重组杆状病毒Bacmid DNA的引物见表2表2
PCR扩增重组杆状病毒Bacmid DNA的反应体系为10×PCR Buffer 5μLdNTP(10mM) 1μL引物M13 Forward(20pmol/L)1μL引物M13 Reverse(20pmol/L)1μL重组杆状病毒Bacmid DNA(100ng)1μLTaq酶(5units/μL)0.5μL50mM MgCl21.5μL加ddH2O至体积为50LPCR扩增重组杆状病毒Bacmid DNA的反应程序见表3表3
4.重组杆状病毒Bacmid DNA转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒a.将Sf9(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞接于6孔培养板中，Sf9细胞密度为9×105个/孔；每孔再加入2mL含抗生素的培养基(如2mL Sf-900IISFM培养基，Sf-900IISFM培养基中含有终浓度为50U/mL的青霉素和50μg/mL的链霉素)。
b.当Sf9细胞贴壁生长1小时后，将重组杆状病毒Bacmid DNA与转染试剂放入Eppendorf管中混匀。
i将1μg纯化的重组杆状病毒Bacmid DNA用100μL非补充Grace’s培养基稀释。
ii用前将转染试剂(Cellfectin Reagent脂质体)翻转5～10次，混匀后取6μL转染试剂用100μL非补充Grace’s培养基稀释。
iii将稀释的重组杆状病毒Bacmid DNA质粒和稀释的转染试剂混匀，室温下静置15～45分钟。
c.弃去Sf9细胞的培养基，用2mL非补充Grace’s培养基洗涤细胞，然后再将洗涤用非补充Grace’s培养基弃除。
d.向含有转染试剂混合物(DNA-脂质体)的Eppendorf管中加入0.8mL非补充Grace’s培养基，温和混匀后加入到1个细胞培养孔中，在27℃条件下作用5小时。
e.移出转染试剂混合物(DNA-脂质体)，向细胞中加入2mL完全培养基，如含有抗生素的Sf-900IISFM培养基，在27℃条件下培养72小时，即获得重组杆状病毒(P1)。
5.扩增重组杆状病毒将Sf9细胞按2×106个/孔的数量加入6孔培养板中室温下孵育1小时，使细胞贴壁生长；然后向每孔内加入20～200μL P1，在27℃条件下培养48小时，再从每孔中取出2mL含有重组杆状病毒的培养基放入15mL无菌离心管内，在500g条件下离心5分钟，去除细胞及其碎片，将上清液移至于一个新的15mL无菌离心管中储备，此为扩增后的重组杆状病毒(P2)。
6.蚀斑试验向6孔培养板的每孔中加入2mL细胞密度为5×105个/mL的Sf-900IISFM培养基细胞悬液，室温孵育1小时，当细胞密度为孔板面积40％～60％时做梯度稀释(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)。将孔中的培养基除去，立即加入1mL P2稀释液在室温下孵育1小时。从最高的稀释度(10-8)到最低的稀释度(10-3)的孔中，将含有重组杆状病毒的培养基移出，加入2mL蚀斑培养基(40℃温育)，并在室温下冷却10～20分钟，再在27℃条件下培养4天后加入1mL浓度为1mg/mL(含1％低熔点琼脂糖)的中性红溶液，在27℃条件下继续培养直至蚀斑清晰可见。
7.蚀斑纯化制备细胞密度为5×105个/mL的Sf-900II SFM细胞悬液(或其他完全培养基)，向6孔培养板每孔中加入2mLSf-900II SFM细胞悬液，在室温下孵育，当细胞密度为孔板面积40％～60％时加入100μL充分混匀、带有蚀斑的完全培养基(挑取蚀斑移入离心管中并加入500μL完全培养基)，然后在27℃条件下孵育72小时。将各孔中含有重组杆状病毒的培养基1.5～2.5mL移入15mL无菌离心管，在500g条件下离心5分钟，再去除细胞及其碎片，将上清液移入另一新的15mL无菌离心管，此为纯化的重组杆状病毒储备(P3)。
8.收集重组杆状病毒的病毒粒子P3通过在SF9昆虫细胞中的繁殖得以进一步扩增，该SF9昆虫细胞悬浮培养于内含10％胎牛血清(FBS，Sigma)的Grace’s补充昆虫培养液中。P3侵染SF9昆虫细胞3天后收集培养液中的病毒粒子，并在24000r/min条件下离心2小时，弃去上清液保留沉淀，将带有重组杆状病毒粒子的沉淀重新悬浮于不含Ca2+和Mg2+离子的磷酸缓冲液(PBS)中，经孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，将仅含有病毒粒子的滤液放于4℃环境下储存。
9.测定重组杆状病毒的病毒效价病毒效价的测定采用终点稀释法，具体方法与步骤(三)6蚀斑试验相同。
病毒滴度(pfu/mL)＝蚀斑数×稀释倍数(四)检测重组杆状病毒外源基因的表达1.重组杆状病毒侵染鸡原代细胞将重组杆状病毒储存液倍比稀释后侵染从鸡胚细胞中分离培养出的鸡原代骨骼肌细胞和成纤维细胞，并利用终浓度为1mM的丁酸盐增强侵染；将被侵染的鸡原代细胞放于CO2浓度为5％、37℃的条件下培养24～72h。
2.统计重组杆状病毒外源基因的表达向培养皿(其中培养被重组杆状病毒侵染的鸡原代细胞)中加入4％的多聚甲醛以代替转导培养基，在25℃固定20分钟后去掉多聚甲醛，加入PBS；利用倒置荧光显微镜观察细胞，通过比较发荧光和不发荧光细胞的数量测定GFP的表达速率和GFP的表达率。
鸡原代细胞被侵染十几小时后便可检测出外源基因编码的蛋白质，即检测出发荧光的鸡原代细胞；二十四小时后蛋白质表达达到最高峰，即发荧光的鸡原代细胞比例最高；之后逐渐减少。以五种不同的感染复数(16，31，62，125和250MOI)分别侵染鸡原代骨胳肌细胞和鸡原代成纤维细胞，侵染二十四小时后，统计外源基因GFP阳性细胞的比例(见图6)，结果表明GFP表达率最高可达80％和92％(250MOI)本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。
权利要求
1.一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于按下述步骤制备重组杆状病毒(一)构建含有CMV-IE启动子的穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)；(二)构建带有CMV-IE启动子和外源基因的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’；(三)构建重组杆状病毒，并收集病毒粒子测定病毒效价；(四)检测重组杆状病毒外源基因的表达；所述的步骤(三)包括1.用重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’转化DH10Bac细胞；2.提取重组杆状病毒Bacmid DNA；3.特异引物PCR扩增重组杆状病毒BacmidDNA；4.重组杆状病毒Bacmid DNA转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒；5.扩增重组杆状病毒；6.蚀斑试验；7.蚀斑纯化；8.收集重组杆状病毒的病毒粒子；9.测定重组杆状病毒的病毒效价。
2.根据权利要求1所述的一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤(一)包括1.从pcDNA3.1(-)质粒中获得含有CMV-IE启动子的pcDNA3.1(-)3.1kb片段；2.去除杆状病毒质粒pFastBac1中的杆状病毒核多角体蛋白基因启动子；3.连接pcDNA3.1(-)3.1kb片段和pFastBac1骨架；4.连接产物转化感受态细胞DH5α；5.提取含有CMV-IE启动子的质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)。
3.根据权利要求1所述的一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，其特征是步骤(二)构建带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’；所述的步骤(二)包括1.PCR扩增带有GFP基因的DNA片段；2.对PCR扩增产物进行双酶切；3.对质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)进行双酶切；4.将双酶切后含GFP的DNA片段与已经双酶切的pFastBac1-pcDNA3.1(-)连接；5.连接产物转化感受态细胞DH5α；6.提取带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’。
4.根据权利要求1所述的一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤(三)1.用带有CMV-IE启动子和外源基因GFP的重组穿梭质粒载体pFastBac1-pcDNA3.1(-)’转化DH10Bac细胞。
5.根据权利要求1所述的一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤(四)包括1.重组杆状病毒侵染鸡原代细胞；2.统计重组杆状病毒外源基因的表达。
6.根据权利要求1所述的一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤(三)3中特异引物为M13Forward5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M 13Reverse 5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。
7.根据权利要求3所述的一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤(二)双酶切中使用的酶为KpnI和XhoI。
全文摘要
一种可用于制作禽类疫苗的重组杆状病毒的制备方法，它涉及一种重组杆状病毒的制备方法。它为制作出可防治禽类传染性疾病的重组杆状病毒疫苗奠定了物质基础。其制备方法(一)构建含有CMV－IE启动子的载体；(二)构建带有CMV－IE启动子和外源基因的重组载体；(三)构建重组杆状病毒，收集病毒粒子测定病毒效价；(四)检测重组杆状病毒外源基因的表达；步骤(三)包括1.重组载体转化DH10Bac细胞；2.提取重组杆状病毒BacmidDNA；3.PCR扩增Bacmid DNA；4.Bacmid DNA转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒；5.扩增重组杆状病毒；6.蚀斑试验；7.蚀斑纯化；8.收集重组杆状病毒粒子；9.测定重组杆状病毒效价。本发明为制作出可防治禽类传染性疾病的重组杆状病毒疫苗奠定了物质基础。
文档编号C12N15/866GK1807602SQ20061000965
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月23日 优先权日2006年1月23日
发明者楼庄伟, 平文祥, 葛菁萍, 李盛贤, 宋刚, 凌宏志, 高冬妮, 张贺楠 申请人:黑龙江大学