抗绵羊包虫病感染的基因rEg.P29分子工程疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，设及一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.P29分子 工程疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 细粒棘球蝴虫病，俗称包虫病，目前尚没有商品化的疫苗。当前已有十余种候选分 子，如Eg95、rEgl4-3-3重组疫苗、铁蛋白重组疫苗、GST重组疫苗等，其中最早证实EG95是 一种绵羊保护性细粒棘球蝴疫苗，其对绵羊的保护力为96-98%，其中国内康强等也在绵羊 身上对EG95进行保护力验证，得到了 90 %的保护力。遗憾的是Eg95首先由国外研发成功 的，即使开发成为真正的商品，其知识产权也不属于我们。而目前绝大部分包虫病候选疫苗 分子都是通过小鼠继发感染实验完成，缺乏直接的应用价值，因为包虫感染主要通过其虫 卵经消化道感染而不是继发感染；再者，小鼠亦不是细粒棘球蝴病（包虫病）主要的天然适 宜宿主。
[0003] 由于细粒棘球蝴主要寄生于人的肝脏，故该病又称为肝包虫病。它呈世界性分布， 是全球性的公共卫生问题。据近年普查，我国有25个省、市和自治区有该病的病例报道，其 中W新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川、内蒙古7个省（区）流行最为严重，高发区约占全 国面积的44%，受威胁人口约5千万。该病已被列为我国重点防治的寄生虫病之一。
[0004] 包虫病严重危害人类的健康和农牧业经济的发展。包虫病对人危害主要表现为在 肝脏、肺、脑或肾等器官形成占位性包囊病变，W机械压迫与营养消耗等形式造成运些重 要器官的严重损害，甚至导致个体死亡；而对于家畜而言，包虫病将会造成家畜的减产、品 质下降等重大经济问题，并且作为寄生虫感染生活史的重要一个环节对人民生命财产安全 带来巨大隐患。
[0005] 目前，人包虫病的首选治疗方法是外科手术，但由于该病发病早期可无自觉症状， 等到入院就诊时，相应的脏器已经受到严重的损伤并且手术本身对机体也有损伤，从而使 患者在健康和经济上都蒙受了极大的损害。对于较早期小棘球蝴或有手术禁忌的病例可采 用阿苯化挫或甲苯咪挫等药物进行化疗，临床发现运些药物存在严重的毒副作用，部分患 者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。因此，无论是手术治疗，还是药物治疗，对于 包虫病治疗都有很大的不足。对于家畜而言，目前很少有相应的诊疗措施。
[0006] 要想从源头上防控包虫病，疫苗的研发将是必然选择。近年来，随着分子生物学技 术的迅速发展及在医学科学中的广泛应用，利用基因工程技术对病原体进行分子疫苗的预 防研究引起了人们的广泛关注。从目前的研究情况来看，国内外对细胞粒棘球蝴虫研究较 为成功的重组疫苗有Eg95,它已在人工感染的牛和羊群获得了较好的免疫保护水平，免疫 保护力达到96-98%。
[0007] 羊作为细粒棘球缘虫最主要的天然中间宿主，是细粒棘球蝴缘虫感染生活史的重 要环节，制备出羊的包虫病疫苗，预防家畜羊的感染，阻断寄生虫生活史进而减少传染给人 的几率，具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是针对目前没有羊包虫病疫苗的现状，提供一种基因 分子巧g.P29在制备抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗上的应用，同时提供运种疫苗及其 制备方法。 阳009] 本发明技术方案如下：
[0010] 一种抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗，是从细粒棘球蝴中国株提取RNA并通过 RT-PCR获得Eg.P29基因分子巧g.P29,再构建P29/祀T28a原核表达载体，在大肠杆菌化21 中IPTG诱导表达重组的蛋白rEg.P29疫苗，其保藏号为：CCTCCM2015425 ;
[0011] 一种抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗的制备方法，首先从细粒棘球蝴中国 株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.P29基因，该基因收录在GenBank数据库，序列号为 AF078931，其次是构建原核表达载体，在大肠杆菌化21中IPTG诱导表达重组蛋白巧g.P29， 经SDS-PAGE和Westernblot鉴定后，His标签亲和层析纯化，-20°C保存；
[0012] 基因分子巧g.P29用于制备抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗。
[0013] 本发明的细粒棘球蝴重组疫苗在小鼠身上进行免疫保护验证，免疫保护力达到了 96. 6%。该疫苗候选分子将有望在肝包虫防治中发挥巨大的作用。
【附图说明】
[0014] 图1为血清抗体检测图，显示采用ELISA法分别检测了血清中巧g.P29抗原特异 性IgG、IgGUIgG2与I姐抗体水平。
[0015] 图2为血清因子检测图，显示经免疫接种后，疫苗组IFN-丫与IL-2显著升高，表 明Thl型介导的细胞免疫应答显著激活；化2型细胞因子IL-4亦显著升高，表明体液免疫 应答亦明显上调，与抗体升高结果一致。
【具体实施方式】
[0016] 疫苗的制备：
[0017] 首先从细粒棘球蝴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.P29基因，该基因收 录在GenBank数据库，序列号为AF078931，其次是构建原核表达载体，在大肠杆菌化21中 IPTG诱导表达重组蛋白巧g.P29,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定后，His标签亲和层析 纯化，-20°C保存。
[0018] 疫苗发明效果验证：
[0019] 1、实验动物与细粒棘球虫卵的准备
[0020] 4-6月龄雄性绵羊，利用原头蝴粗抗原包被检测绵羊血清巧LISA)阴性的入组，随 机分为3组：疫苗巧g.P29接种组、FCA(完全福氏佐剂）组、PBS组，每组10只。
[0021] 细粒棘球缘虫虫卵由兰州兽医所提供，具体制备过程如下：从新疆购买6月龄± 犬3只，于兰州兽医所试验站隔离饲养，用化哇酬对实验犬进行驱虫，并注射地塞米松W降 低其免疫力。一周后，给实验犬喂食含有原头蝴的包囊，感染后45d对其进行粪便检测，粪 便细粒棘球缘虫虫卵阳性时，注射乌拉坦安乐处死（实验犬于处死之前禁食2地，W减少小 肠内容物），沿腹中线剖开腹部，自幽口至小肠下段结扎，剪下小肠，分离肠系膜，将其纵向 剪成大小适宜的片段4-5段，放在含有37°C生理盐水的小烧杯中稍微晃动W洗掉其内容 物，再次更换新的生理盐水，将其放在水浴锅中37°C解育比，使细粒棘球缘虫成虫从小肠 肠壁自行脱落。用注射器将细粒棘球缘虫虫体吸出，滴数滴于载玻片上，在显微镜下检测并 判断其是否成熟，收集成熟的细粒棘球缘虫虫体于生理盐水中，用注射器吸取，每管吸取20 个成熟虫体，保存备用，用于实验绵羊包虫病的人工感染。
[0022] 2、免疫接种与细粒棘球虫卵感染
[0023] 分别在第1周与第4周免疫接种绵羊。疫苗过滤除菌，用PBS调节浓度至50yg/ ml,颈部注射Iml的疫苗。第一次免疫：重组疫苗：完全弗氏佐剂（CFA) = 1:1。第二次免 疫：第一次免疫后四周，重组疫苗：不完全弗氏佐剂（IFA) = 1:1。虫卵37°C解育40min， 采用胶囊包装的形式经口攻击感染细粒棘球虫卵。每只羊攻入约3000个左右虫卵。
[0024] 3、不同时间点采血 阳0巧]W第一次免疫作为0周起始点，分别在0、1、2、4、6、9、12w、20、36与44周进行采颈 部静脉血5ml离屯、收集血清-80°C保存，共计10次（在0、4、8和44周先采血然后相对应的 进行两次免疫、攻虫感染和剖杀处理）。
[0026] 4、包囊统计及保护力的计算
[0027] 包囊检测：把绵羊处死之后取肝，首先仔细检查并记录肝脏表面的包囊个数，然后 再用刀把肝切成片，3mm左右/片，仔细检查并记录肝脏内部包囊个数。纤维化和巧化的包 囊视为不可用包囊。保护力的计算，通过减囊率来计算保护力，保护力计算公式：免疫保护 力（％) = (1-免疫组包囊均数/对照组包囊均数）X100%。经包囊统计与计算，该疫苗 获得了 94. 8%的保护力，具体如下表所示。
[0029] 5、检测血清抗体
[0030] 采用ELISA法分别检测了血清中巧g.P29抗原特异性IgGJgGl、IgG2与I姐抗体 水平。结果发现经免疫接种后，疫苗组运四种特异性抗体显著升高。如图1所示。
[0031] 7、检测血清细胞因子 阳03引 ELISA细胞因子试剂盒检测表明，经免疫接种后，疫苗组IFN-丫与比-2显著升高， 表明Thl型介导的细胞免疫应答显著激活；而与化2型细胞因子IL-4亦显著升高，表明体 液免疫应答亦明显上调，与抗体升高结果一致。如图2所示。 本申请所设及的生物保藏单位名称：中国典型培养物保藏中屯、地址：中国湖北省武汉 市武汉大学；保藏日前：2015年7月3日；保藏编号：CCTCCNO:M2015425 ;分类命名：大肠 杆菌化21/pET-28a/Eg.P2犯scherichiaCOli化21/pET-28a/Eg.P29。
【主权项】
1. 一种抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗，是从细粒棘球蝴中国株提取RNA并通过 RT-PCR获得Eg. P29基因分子rEg. P29，再构建P29/pET28a原核表达载体，在大肠杆菌BL21 中IPTG诱导表达重组的蛋白rEg.P29疫苗，其保藏号为：CCTCC M2015425。2. -种抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗的制备方法，首先从细粒棘球蝴中国株提取 RNA并通过RT-PCR获得Eg. P29基因，该基因收录在GenBank数据库，序列号为AF078931，其 次是构建原核表达载体，在大肠杆菌BL21中IPTG诱导表达重组蛋白rEg. P29,经SDS-PAGE 和Westernblot鉴定后，His标签亲和层析纯化，-20°C保存。3.如权利要求1所述基因分子rEg. P29用于制备抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗。
【专利摘要】一种抗绵羊包虫病感染的基因工程疫苗，是从细粒棘球蚴中国株提取RNA并通过RT-PCR获得Eg.P29基因分子，再构建P29/pET28a原核表达载体，在大肠杆菌BL21中IPTG诱导表达重组的蛋白rEg.P29疫苗，其保藏号为：CCTCC？M2015425。本发明的细粒棘球蚴重组疫苗在绵羊身上进行免疫保护验证，免疫保护力也达到了94.8％。该疫苗候选分子将有望应用于制备抗绵羊包虫病感染的疫苗，在肝包虫防治中发挥着巨大的作用。CCTCC NO:M201542520150703
【IPC分类】C12N15/12, C12N15/70, A61K39/00, A61K48/00, A61P33/10
【公开号】CN105343873
【申请号】CN201510703704
【发明人】赵巍
【申请人】宁夏医科大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月27日