专利名称：一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法
技术领域：
本发明涉及一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,在下文中简称Li)基因组的方法。
背景技术：
Li属于李斯特菌属，仅对绵羊等动物致病，不对人致病，具有与李斯特菌属内另一种菌-单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,在下文中简称Lm)相似的生物学特性。Lm由于具有独特的能在感染的宿主吞噬细胞浆内生长的生物学特性，成为了良好的T细胞免疫活化佐剂，已在疫苗制备上得到了广泛应用，部分以Lm为载体的重组活菌治疗性肿瘤疫苗已进入临床试验阶段。如Wood LM et al.报道构建的两种基因重组Lm活菌疫苗(Lm-LLO-⑶105A和Lm-LLO-⑶105B)能显著减小乳腺癌小鼠动物模型的原发性和转移性肿瘤组织体积、降低乳腺癌自发小鼠模型肿瘤发生率(Wood LM, Pan ZK, Guirnalda P，et al.Targeting tumor vasculature with novel Listeria-based vaccines directedagainst CD105.Cancer Tmmunol Immunother.2011，60 (7):931_942)。虽然以 Lm 为载体的重组活菌疫苗免疫保护效果较好，但由于Lm可对人致病，故作为载体的Lm需经严格地敲除致病相关基因进行减毒，且此类疫苗目前只能限制在特殊人群(如癌症病人)中小范围应用。与Lm同属李斯特菌属的Li因具有与Lm相似的生物学特性(能在吞噬细胞等宿主细胞浆内增殖)，决定了其也具有活化T细胞免疫应答的佐剂效应，再加上其相对于Lm而言的低毒安全性，因此可望代替Lm在疫苗制备上发挥更广泛的作用。要制备以Li为载体的重组活菌疫苗，需要将外源基因整合至Li基因组，但目前将外源基因整合至Li基因组 的方法尚未见公开报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法。本发明所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法包括以下步骤:(I)将从含有拟整合外源基因的生物基因组模板或基因克隆质粒库内PCR扩增得到的上游带Hind III酶切位点、下游带Xho I酶切位点的外源拟整合基因，插入第一重组质粒(命名为PCW203)的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒，所述第一重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.1所示；(2)切下步骤(I)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第二重组质粒(命名为PCW153)的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第一目标重组质粒，所述第二重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.2所示；或切下步骤(I)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第三重组质粒(命名为PCW154)的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第二目标重组质粒，所述第三重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.3所示；
(3)将步骤(2)得到的第一目标重组质粒电转化第一重组菌(命名为LilacZ)，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，在其基因组orfBAldh基因上游整合入了 β -半乳糖苷酶基因，能表达β -半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白；或将步骤(2)得到的第二目标重组质粒电转化第二重组菌(命名为Li AactAlacZ)，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组orfBAldh基因上游整合入了 β-半乳糖苷酶基因，能表达半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。上述方法中，制备第一重组质粒(pCW203)的步骤如下:(I)扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,在下文中简称PRRSV)包膜蛋白GP5编码基因0RF5的基因片段(GenBank: JX105430.1)，其上游带Hind III酶切位点，下游带Xho I酶切位点；(2)将上述0RF5基因片段插入质粒pHS-LV的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第一重组质粒。上述方法中，制备第二重组质粒(pCW153)的步骤如下:(I)扩增上游带Hind III酶切位点、下游带Not I酶切位点的Li orfXYZ基因(GenBank:AJ249805.1),并将所述Li orfXYZ基因插入质粒pHS_LV的Hind III酶切位点与Not I酶切位点之间；(2)扩增上游带Sal I酶切位点、下游带Spe I酶切位点的Ery基因(序列见序列表的SEQ ID N0.2中(6642)..(8092))，并将所述Ery基因插入步骤(I)所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间；(3)扩增上游带Xba I酶切位点、下游带Not I酶切位点的Li orfBAldh基因(GenBank:AJ249805.1)，并将所述Li orfBAldh基因插入步骤(2)所得重组质粒的Xba I酶切位点与Not I酶切位点之间；(4)从所述第一重组质粒中扩增上下游分别带Not I酶切位点的PRRSV 0RF5基因片段I (序列见序列表的SEQ ID N0.1中(10)..(1050))，并将所述PRRSV 0RF5基因片段I插入步骤(3)所得重组质粒的Not I酶切位点；(5)从步骤(4)所得重组质粒中扩增上游带Bgl II酶切位点、下游带Sal I酶切位点的PRRSV 0RF5基因片段2 (序列见序列表的SEQ ID N0.3中(4692)..(5456))，并将所述PRRSV 0RF5基因片段2插入步骤(4)所得重组质粒BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第二重组质粒。上述方法中，制备第三重组质粒(pCW154)的步骤如下:
(I)扩增上游带Hind III酶切位点、下游带Not I酶切位点的Li mpl基因(GenBank:AY510073.1 )，并将所述Li mpl基因插入质粒pHS-LV的Hind III酶切位点与NotI酶切位点之间；(2)扩增上游带Sal I酶切位点、下游带Spe I酶切位点的Ery基因(序列见序列表的SEQ ID N0.2中(6642)..(8092))，并将所述Ery基因插入步骤(I)所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间；(3)扩增上游带Xba I酶切位点、下游带Not I酶切位点的Li orfBAldh基因(GenBank:AJ249805.1)，并将所述Li orfBAldh基因插入步骤(2)所得重组质粒的Xba I酶切位点与NotI酶切位点之间；(4)从所述第一重组质粒中扩增上下游分别带Not I酶切位点的PRRSV 0RF5基因片段I (序列见序列表的SEQ ID N0.1中(10)..(1050))，并将所述PRRSV 0RF5基因片段I插入步骤(3)所得重组质粒的Not I酶切位点；(5)从步骤(4)所得重组质粒中扩增上游带Bgl II酶切位点、下游带Sal I酶切位点的PRRSV 0RF5基因片段2 (序列见序列表的SEQ ID N0.3中(4692)..(5456))，并将所述PRRSV 0RF5基因片段2插入步骤(4)所得重组质粒BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第三重组质粒。上述方法中，制备第一重组菌(LilacZ)的步骤如下:(I)扩增上、下游分别带Not I酶切位点的IacZ基因片段，并将所述IacZ基因片段插入上述制备第二重组质粒的步骤(3)所得重组质粒的Not I酶切位点；(2)将步骤(I)所得重组质粒电转化Li，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得到第一重组菌。上述方法中，制备第二重组菌(Li AactAlacZ)的步骤如下:
(I)扩增上、下游分别带Not I酶切位点的IacZ基因片段，并将所述IacZ基因片段插入上述制备第三重组质粒的步骤(3)所得重组质粒的Not I酶切位点之间；(2)将步骤(I)所得重组质粒电转化Li，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得到第二重组菌。本发明具有以下有益效果:1、实施简单。利用本发明所述方法将外源基因整合至Li基因组仅需简单的几步常规分子克隆、细菌培养等相关操作，对仪器设备和操作技术的要求不高，成本低廉，制备成功后，重组菌可大量繁殖，易于大规模生产。2、筛选容易。采用菌落颜色和抗生素耐药情况筛选目标菌，目标菌为不耐红霉素的白色菌落，筛选方法简单容易，肉眼即可判断。3、外源拟整合基因范围广。本发明所述技术平台可将任何不含Hind IILXho I和BamH I的外源基因整合入Li基因组，适用范围广。4、定点整合。利用本发明所述重组质粒和重组菌将外源基因定点整合至Li基因组orfBAldh基因上游，整合后的细菌生长不受影响。5、整合后的细菌能稳定表达并分泌外源整合基因编码蛋白。整合的基因携带来源于Lm溶血素LLO的启动子(phly)和分泌信号肽(Secret signal),故能翻译出带分泌信号肽的外源整合基因编码蛋白，且由于分泌信号肽的引导作用，翻译出的蛋白能分泌至细菌胞外。6、不含耐药基因。利用本发明所述构建的重组Li不引入外来的红霉素等抗生素基因，也没有携带抗红霉素等抗生素耐药性，保证了其在制备疫苗等领域的应用性。7、敲除了致病基因actA和plcB，保证了重组菌的安全性。本发明所述重组菌LiAactAlacZ的致病基因actA和plcB已被敲除，在该菌基础上得到的目标重组菌不含actA和plcB基因，故具有应用的安全性。8、携带⑶8+和⑶4+T细胞识别表位作为T细胞免疫应答的检测标签。外源拟整合基因的上游融合了 GP33 epitope基因，下游融合了 GP61 epitope基因，故翻译的外源基因蛋白融合了 GP33 (⑶8+T细胞识别表位)和GP61 (⑶4+T细胞识别表位)，便于检测针对外源拟整合基因的特异性⑶8+和⑶4+T细胞应答。9、携带western blot检测标签。外源拟整合基因的上游融合了 HA westernblot检测标签基因(HA印itope)，下游融合了 VSV-G western blot检测标签基因(VSV-Gepitope),故翻译的外源基因蛋白融合了 HA和VSV-G检测标签,便于western blot检测外源整合基因编码的融合蛋白。
图1 为 PCR 扩增 PRRSV 0RF3、PRRSV 0RF4、PRRSV 0RF5、PRRSV 0RF6 和 IacZ 基因片段的电泳结果图，图中，I为IacZ扩增产物，2为PRRSV 0RF6扩增产物，3为PRRSV 0RF5扩增产物，4为PRRSV 0RF4扩增产物，5为PRRSV 0RF3扩增产物，M为DNA ladder。可见，在约4001bp、542bp、620bp、554bp和782bp处分别有特异条带，与预期相符，表明扩增成功。图2为第一重组质粒pcw203的一种结构图谱，含有氨苄青霉素抗性基因(Amp)、启动子phly、分泌信号肽(secret signal)、HA epitope基因、VSV-G epitope基因、可被外源拟整合基因替换的PRRSV 0RF5基因(上下游分别带Hind III和Xho I单酶切位点)和BamHI单酶切位点。图3为第一重组质粒pCW203 HindIILXho I双酶切电泳结果图，图中，I为pCW203Hind II1、Xho I 双酶切反应液，M 为 DNA ladder。图4为PCR扩增Li orfXYZ和Li orfBAldh基因片段的电泳结果图，图中，I为LiorfBAldh扩增产物，2 为 Li orfXYZ扩增产物，M为 DNA ladder。可见，在约 1537bp、1159bp处分别有特异条带，与预期相符，表明扩增成功。图5为PCR扩增Li mpl基因片段的电泳结果图，图中，I为Li mpl扩增产物，M为DNAladder。由图可见,在约81 Ibp处有一条特异条带,与预期相符,表明扩增成功。图6为PCR扩增Ery基因片段的电泳结果图，图中，I为Ery扩增产物，M为DNAladder。可见,在约1471bp处有一条特异条带,与预期相符,表明扩增成功。图7为重组质粒pCWlOl HindIILNot I双酶切电泳结果图，图中，I为pCWlOl HindII1、Not I双酶切反应液，M为DNA ladder。图8为重组质粒pCW102 H ind IILNot I双酶切及pCW103 Sal I,Spe I双酶切电泳结果图，图中，I为PCW102阴性对照Hind II1、Not I双酶切反应液，2、3为pCW102 Hind1、Not I双酶切反应液，4为pCW103 Sal1、Spe I双酶切反应液，M为DNA ladder。图9为重组质粒pCW104 Sal1、Spe I双酶切电泳结果图，图中，I为pCW104 Sal1、Spe I双酶切反应液，M为DNA ladder。图10为重组质粒pCW105 Xba1、Not I双酶切电泳结果图，图中，I为pCW105 Xba1、Not I双酶切反应液，M为DNA ladder。图11为重组质粒pCW106 Xba1、Not I双酶切电泳结果图，图中，I为pCW106 Xba1、Not I双酶切反应液，M为DNA ladder。图12为PCR扩增PRRSV 0RF5基因片段I的电泳结果图，图中，I为PRRSV 0RF5基因片段I扩增产物，M为DNA ladder。可见，在约1069bp处有一条特异条带，与预期相符，表明扩增成功。图13为重组质粒pCW117 Not I酶切电泳结果图，图中，I为pCW117阴性对照NotI酶切反应液，2为pCW117 Not I酶切反应液，M为DNA ladder。图14为重组质粒pCW118 Not I酶切电泳结果图，图中，I为pCW118阴性对照NotI酶切反应液，2为pCW118 Not I酶切反应液，M为DNA ladder。图15为PCR扩增PRRSV 0RF5基因片段2的电泳结果图，图中，I为PRRSV 0RF5基因片段2扩增产物，2-4为PRRSV 0RF5基因片段2扩增阴性对照，M为DNA ladder。可见，在约783bp处有一条特异条带，与预期相符，表明扩增成功。图16为本发明所述第二重组质粒pcwl53的一种结构图谱，含有两段Li同源基因(LiorfXYZ和Li orfBAldh)、氨苄青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)、基因序列盒(gene cassette):包含启动子 phly、分泌信号肽(secret signal)、HA epitope 基因、VSV-G印itope基因、GP33印itope基因、GP61印itope基因、PRRSV 0RF5基因、供外源基因插入的BamH1、Xho I位点。图17为本发明所述第三重组质粒pcwl54的一种结构图谱,含有两段Li同源基因(Li mpl和Li orfBAldh)、氨苄青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)、基因序列盒(gene cassette):包 含启动子phly、分泌信号肽(secret signal)、HA epitope基因、VSV-G印itope基因、GP33印itope基因、GP61印itope基因、PRRSV 0RF5基因、供外源基因插入的 BamH1、Xho I 位点。图18为第二重组质粒pCW153和第三重组质粒pCW154 BamH I,Xho I双酶切电泳结果图，图中，I为pCW153BamH1、Xho I双酶切反应液，2为pCW154 BamH1、Xho I双酶切反应液，M为DNA ladder。图19为重组质粒pCW107和pCW108 Not I酶切电泳结果图，图中，I为pCW107阴性质粒对照Not I酶切反应液，2为pCW107 Not I酶切反应液，3为pCW108 Not I酶切反应液，M 为 DNA ladder。图20为Li IacZ和Li Δ actAlacZ的PCR鉴定电泳结果图，图中，I为以Li IacZ基因组为模板扩增actA,2为以Li基因组为模板扩增actA,3为以Li AactAlacZ基因组为模板扩增actA，4为以LilacZ基因组为模板扩增orfBAldh，5为以Li基因组为模板扩增orfBAldh, 6 为以 Li Λ actAlacZ 基因组为模板扩增 orfBAldh, 7 为以 E.coli/pCW107 基因组为模板结果Ery，8为以LilacZ基因组为模板扩增Ery，9为以E.coli/pCW108基因组为模板扩增Ery，10为以Li AactAlacZ基因组为模板扩增Ery，11为以Li基因组为模板扩增lacZ，12为以LilacZ基因组为模板扩增lacZ，13为以Li Λ actAlacZ基因组为模板扩增IacZ, M 为 DNA ladder。图21为pCW203_0RF6Hind III和Xho I双酶切电泳结果图，图中，I为pCW203-0RF6Hind II1、Xho I 双酶切反应液，M 为 DNA ladder。
图22为pCW153-0RF6和pCW154_0RF6 BamH I和Xho I双酶切电泳结果图，图中，I 为 PCW153-0RF6 BamH I,Xho I 双酶切反应液，2 为 pCW154_0RF6 BamH I,Xho I 双酶切反应液，M 为 DNA ladder。图23为利用双同源杂交培养将pcwl53携带的gene cassette整合至LilacZ基因组的示意图。图24为利用双同源杂交培养将pcwl54携带的gene cassette整合至Li Δ actAlacZ基因组的不意图。图25为L1-0RF6和Li Λ actA-0RF6的PCR鉴定电泳结果图，图中，I为以Li_0RF6基因组为模板扩增0RF6，2为以L1-0RF6基因组为模板扩增Ery，3为以Li_0RF6基因组为模板扩增lacZ，4为以Li Λ actA_0RF6基因组为模板扩增0RF6，5为以Li Λ actA_0RF6基因组为模板扩增Ery，6为以Li Λ actA_0RF6基因组为模板扩增lacZ，M为DNA ladder。扩增结果符合预期，表明目标重组质粒(PCW153-0RF6或pCW154_0RF6)中两个Not I位点之间包括PRRSV 0RF6在内的基因片段已整合至基因组内。图26为目标菌分泌和非分泌蛋白western blot结果图，图中，I为Li_0RF6非分泌蛋白，2为L1-0RF6分泌蛋白，3为LilacZ分泌蛋白(原始菌对照)；4为Li Λ actA_0RF6非分泌蛋白，5为LiAactA_0RF6分泌蛋白，6为LiAactAlacZ分泌蛋白(原始菌对照)，7为L1-0RF3分泌蛋白，8为Li Λ actA_0RF3分泌蛋白，9为Li_0RF3非分泌蛋白，10为Li Δ actA-0RF3非分泌蛋白，11为Li_0RF4非分泌蛋白，12为Li Δ actA-0RF4非分泌蛋白，13为L1-0RF4分泌蛋白，14为Li Δ actA-0RF4分泌蛋白，15为L1-Rv0129非分泌蛋白，16为 L1-Rv0129 分泌蛋白，17 为 Li Δ actA-Rv0129 非分泌蛋白，18 为 Li Δ actA-Rv0129 分泌蛋白。可见目标菌均表达了符合预期带标签融合蛋白，且大部分表达的外源基因编码蛋白能分泌到细菌胞外，无外源基因整合的细菌对照样品未检测到杂交信号。图27为PCR扩增RvO 129基因的电泳结果图，图中，I为空白对照，2为RvO 129扩增产物，M为DNA ladder。可见，在约901bp处有一条特异条带，与预期相符，表明扩增成功。
具体实施例方式本发明下述实施例中:质粒pHS-LV来源于美国宾夕法尼亚大学Dr.HaoShen 实验室(Shen H, Slifka MK, Matloubian M, Jensen ER, Ahmed R, MiIIerJF.Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for theinduction of protective ant1-viral cell-mediated immunity.Proc Natl AcadSci USA.1995，92(9):3987-91.);携带 PRRSV 0RF3、0RF4、0RF5、0RF6 基因的重组质粒(PRK5-GP3，pRK5-GP4, pRK5_GP5，pGBKT7_GP6)和携带结核杆菌 Rv0129 基因的重组质粒pET-Ag85c来自上海交通大学免疫所，大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)Top 10购自北京康为世纪生物科技有限公司；各种分子生物学试剂盒和生化试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；各种分子生物学工具酶购自New England Biolabs ;培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；引物合成和基因测序由Invitrogen上海公司完成。实施例1:制备第一重组质粒pCW203(I)扩增PRRSV包膜蛋 白GP5编码基因0RF5基因片段(GenBank: JX105430.1)以重组质粒pRK5-GP5为模板作PCR扩增，反应体系为:10Xultrapfu buffer 2.5 μ 1, 4dNTPs (1 Ommol /T,.种)0.4 μ I,上游引物(ΙΟμπιοΙ/L)(0RF5-f.5’ -TATGTAAGCTTTGTT GGGGAAGTGCTTGACC-3’)0.8 μ 1，下游引物(IOymol/L) (0RF5-r5’ -ATAACTCG AGGAGACGACCCCATT GTTCC-3’)0.8 μ 1，pRK5_GP5 0.75 μ I,ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2019.5 μ I。反应循环条件:94 °C 3min — (94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C lmin20s) X 20 个循环—(94 °C 30s, 66 °C 30s, 72 °C lmin20s) X 10 个循环—72°C IOmin — 4°C。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在620bp处可见一条特异条带，与预期相符(图1)。PCR扩增产物经测序鉴定合格。(2) PRRSV 0RF5基因片段插入质粒pHS-LV Hind II1、Xho I酶切位点之间分别对PRRSV 0RF5基因片段和质粒pHS-LV用Hind III和Xho I双酶切。Hind III和Xho I双酶切反应体系和反应条件为:10Xbuffer23y 1，10XBSA 3 μ 1，基因样品15 μ 1，Hind III 0.6 μ 1，Xho 10.6 μ 1，ddH207.8 μ 1，37°C 水浴反应 lh。PRRSV 0RF5 基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pHS-LV经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长为13054bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段用T4连接酶连接，得到第一重组质粒pCW203(图2)。连接反应体系和反应条件为:10XT4Ligase reaction buffer I μ I,基因片段酶切回收物I μ 1，质粒酶切回收物4 μ 1，T4连接酶I μ 1，ddH203 μ I，室温反应2h。连接反应液转化感受态E.coli ToplO:用预冷枪头吸5 μ I连接反应液于预冷50 μ I感受态E.coli ToplO中，用手指轻弹管底使液体混合均匀，置冰浴30min，42°C水浴30s，冰浴3min。加入250 μ 137°C预热的SOC培养基，于37°C 200r/min培养lh，取150 μ I菌液于含ΙΟΟμ g/ml氨苄青霉素的LB平板(以下简称LB-Amp)中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于37°C培养18 24h，阳性菌(E.coli/pCW203)在该平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Hind III和Xho I双酶切进行鉴定，结果如图3，从图3可以看出，在约620bp和大 于IOkb处出现两条条带，与预期相符,第一重组质粒pCW203构建成功。
实施例2:制备第二重组质粒PCW153和第三重组质粒pCW154(I)扩增 Li orfXYZ (GenBank:AJ249805.1)、Li mpl (GenBank:AY510073.1), LiorfBAldh (GenBank:AJ249805.1)和 Ery (序列见 SEQ ID N0.2 中(6642)..(8092))基因片段将Li菌种从_80°C冰箱取出，37°C水浴融化后划线BHI琼脂平板，于37°C培养24h，挑菌落转种5ml BHI液体培养基，37°C 220rpm振荡培养12_18h，用通用型柱式基因组提取试剂盒抽提基因组DNA作为模板，扩增Li orfXYZ、Li mpl和Li orfBAldh基因片段。扩增 Li orfXYZ 的反应体系为:10Xultra pfu buffer 2.5 μ 1,4dNTPs (10mmol /L.种)0.5 μ 1，上游引物(10 μ mol/L) (Li orfXYZ-f:5’ -ATMAGCTTGTCGACATACTAGTTTCCAGCAAAGCGATT C_3，)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L) (Li orfXYZ-r: 5’ -AACTCTGCGGCCGCTTATTTTGGATTC ATATACTG) 0.8 μ 1，Li 基因组 DNA 样品 2.5 μ 1，ultra pfu 0.25 μ I,ddH2017.65 μ I。反应循环条件为:94°C 5min —(94°C lmin，44°C 30s, 72°C lmin40s) X 20个循环—(94°C lmin,68°C 30s, 72 °C lmin40s) X 10 个循环一72 °C lOmin —4°C。扩增Limpl 的反应体系为:10Xultra pfu buffer 2.5 μ 1,4dNTPs (lOmmol/L.种)0.5,上游引物(10 μ mol/L) (Li5，-ATAAAGCTTGTC GACATACTAGTTTCGTTATG GCTTAAATTG-3，)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L) (Li mpl-r: 5’ -TTATGCGGCCGCTCTCTAATACCTGCGT AA-3’ )0.8μ 1，Li 基因组 DNA 样品 2.5μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2017.65 μ I。反应循环条件为:94°C 5min—(94°C lmin，44°C 30s, 72 °C lmin30s) X20 个循环—(94°C lmin,67 °C 30s, 72 °C lmin30s) X 10 个循环一72 °C IOmin — 4 °C。扩增 Li orfBAldh 的反应体系为:10 X ultra pfu buffer2.5 μ l，4dNTPs (IOmmoI/L.种)(λ 5 μ 1，上游引物(10 μ mol/L) (Li orfBAldh-f:5’ -GCACGCTCTAGAACAAAAAACGGAAATCA GTTAG-3’)0.8 μ 1，下游引物(10 μ mol/L) (Li orfBAldh_r:5，-TATGCGGCCGCACTATTTTCGTAAGCGTTCG -3，)0.8 μ 1，Li 基因组 DNA 样品 2.5 μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2017.65 μ I。反应循环条件为:94°C 5min —(94 °C lmin, 48 °C 30s, 72 °C 2min) X 20 个循环—(94°C lmin, 67 °C 30s,72°C 2min) X 10个循环一72°C IOmin — 4°C。以质粒pHS-LV为模板扩增Ery，反应体系为:10Xultra pfu buffer 2.5 μ 1,4dNTPs (10mmol/L.种)0.5 μ I,上游引物(10 μ mol/L) (Ery-f:5，-GATAAGTCGACGAT TCACAAAAAATAG-3，)0.8 μ 1，下游引物(10 μ mol/L)(Ery-r:5> -AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’)0.8 μ 1，pHS-LV 质粒样品1.5 μ 1，ultrapfu 0.25μ 1，ddH2018.65 μ I。反应循环条件为:94°C 3min — (94 °C 30s，57 °C 30s，72°C 2min)X 30个循环一72°C IOmin — 4°C。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，分别在1159bp、811bp、1537bp和1471bp处可见一条特异条带(见图4-图6)。PCR扩增产物经测序鉴定合格。(2)构建制备第二重组质粒PCW153和第三重组质粒pCW154用的中间重组质粒pCWlOl 和 pCW102分别对步骤(1)得到的Li orfXYZ和Li mpl基因片段及质粒pHS_LV用Hind III和Not I双酶切，Hind III和Not I双酶切体系和反应条件为:10Xbuffer23 μ 1，10XBSA3 μ 1，基因样品 15 μ 1，Hind III 0.6μ I, Not 10.6 μ 1，ddH207.8 μ 1，37°C 水浴反应 lh。LiorfXYZ和Li mpl基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收回收。质粒pHS-LV经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长为6030bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1(2)中连接反应体系和反应条件进行连接，Li orfXYZ与pHS-LV连接产物为pCWlOl ；LimpI与pHS-LV连接产物为pCW102。连接反应液按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coliToplO,阳性菌(E.coli/pCW101、E.coli/pCW102)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Hind III和Not II双酶切进行鉴定，鉴定结果见图7、图8，从图7可见，pCWlOl Hind II1、Not I双酶切后在约1159bp和6030bp处出现两条条带，与预期相符，pCWlOl构建成功；从图8可见，pCW102 Hind IILNot I双酶切后在约811bp和6030bp处出现两条条带，与预期相符，PCW102构建成功。(3)构建制备第二重组质粒PCW153和第三重组质粒pCW154用的中间重组质粒PCW103 和 pCW104分别对步骤(1)得到的Ery基因片段和步骤(2)得到pCWlOl及pCW102用Sal I和Spe I双酶切。Sal I和Spe I双酶切体系和反应条件为:10Xbuffer33 μ 1，10XBSA
3μ 1，基因样品 15 μ 1，Sal 10.6 μ I, Spe 10.6 μ 1，ddH207.8 μ 1，37°C水浴反应 lh。Ery 基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCWlOl及pCW102经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1 (2)中连接反应体系和反应条件进行连接，Ery与pCWlOl连接产物为PCW103 ；Ery与pCW102连接产物为pCW104。连接反应液按实施例1 (2)中方法转化感受态 E.coliToplO。阳性菌(Ε.coli/pCW103 或 Ε.coli/pCW104)在 LB-Amp 平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Sal I和Spe I双酶切进行鉴定，鉴定结果见图8-图9，从图8可见，pCW103Sal I ,Spe I双酶切后在约1471bp和7172bp处出现两条条带，与预期相符，PCW103构建成功；从图9可见，pCW104Sal I ,Spe I双酶切后在约1471bp和6826bp处出现两条条带，与预期相符，PCW104构建成功。(4)构建制备第二重组质粒PCW153和第三重组质粒pCW154用的中间重组质粒PCW105 和 pCW106分别对步骤(I)得到的Li orfBAldh和步骤(3)步得到的pCW103及pCW104用Xba I和Not I双酶切。Xba I和Not I双酶切体系和反应条件为:10Xbuffer33 μ 1，10XBSA3y 1，基因样品 15μ 1，Xba 10.6 μ 1，Not 10.6 μ 1，ddH207.8 μ 1，37°C 水浴反应lh。Li orfBAldh基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒pCW103及PCW104经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度分别为7442bp和7096bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1 (2)中连接反应体系和反应条件进 行连接，Li orfBAldh与pCW103连接产物为PCW105 ；Li orfBAldh与pCW104连接产物为pCW106。连接反应液按实施例1(2)中方法转化感受态 E.coli ToplO0 阳性菌(E.coli/pCW105 或 E.co/pCW106)在 LB-Amp 平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Xba I和Not I双酶切进行鉴定，鉴定结果见图10-图11，从图10可见，pCW105Xba I ,Not I双酶切后在约1537bp和7442bp处出现两条条带，与预期相符，PCW105构建成功；从图11可见，pCW106Xba I ,Not I双酶切后在约1537bp和7096bp处出现两条条带，与预期相符，pCW106构建成功。(5)从第一重组质粒pCW203中扩增PRRSV 0RF5基因片段I (序列见SEQ ID N0.1中(10)..(1050))以第一重组质粒pCW203为模板作PCR扩增，反应体系为:10Xultrapfu buffer 2.5 μ 1, 4dNTPs (10mmol/L.种)0.4 μ I,上游引物(ΙΟμπιοΙ/L) (0RF5-l-f:5，-TATTGCGGCCGCC AGTGTG-3，)0.8μ 1，下游引物(lOymol/L)(0RF5-l-r5，-TATTGCGGCCGCCGAC TTATCATTTTCCTAATCTATTC’)0.8 μ 1，第一重组质粒PCW203 样品 0.8 μ 1，ultra pfu 0.25 μ I, ddH2019.45 μ I。反应循环条件为:94°C 3min —(94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin30s) X 30 个循环—72°C lOmin —4°C。PCR 产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳后，在1069bp处可见一条特异条带，与预期相符(见图12)。PCR扩增产物经测序鉴定合格。(6)构建制备第二重组质粒PCW153和第三重组质粒pCW154用的中间重组质粒PCW117 和 pCW118分别对步骤(5)得到的PRRSV 0RF5基因片段I和步骤(4)得到pCW105及pCW106用Not I酶切。Not I酶切体系和反应条件为:10Xbuffer32y l，10XBSA2y 1，基因样品5 μ I, Not 10.4 μ 1，ddH2010.6 μ 1，37°C水浴反应 lh。PRRSV 0RF5 基因片段 I 酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒PCW105及pCW106经酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。回收后的基因片段和质粒片段按实施例I (2)中连接反应体系和反应条件进行连接，PRRSV 0RF5基因片段I与pCW105连接产物为PCW117 ；PRRSV 0RF5基因片段I与pCW106连接产物为pCW118。连接反应液按实施例1(2)中方法转化感受态 E.coli ToplO0 阳性菌(E.coli/pCW117 或 E.coli/pCW118)在 LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Not I酶切进行鉴定，鉴定结果见图13-图14，从图13可见，pCW117Not I酶切后在约1069bp和IOkb处出现两条条带，与预期相符，PCW117构建成功；从图14可见，pCW118Not I酶切后在约1069bp和IOkb处出现两条条带，与预期相符，PCW118构建成功。(7)从 pCW117 中扩增 PRRSV 0RF5 基因片段 2 (序列见 SEQ ID N0.3 中(4692)..(5456))以重组质粒pCW117为模板作PCR扩增，反应体系为:10Xultra pfubuffer 2.5 μ l,4dNTPs (IOmmoI/L.种)0.6μ1，上游弓丨物(10 μ mol/L) (0RF5-2-f:5’ -ATAAAGATCTTAAAGCTGTT TATAATTTTGCTACTATGAAGGATCCATATCCATATGATGTTC-3’)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L) (5’ -ATAAGTCGACATCAAATTCAACACTTTTAAATTGATAAACTCCTTTATAA ATATCTGGTCCATTTAATCCCTCGAGGAGACGACCCC-3’)0.8 μ 1，pCW117 质粒样品 0.8 μ 1，ultra pfu 0.25 μ l，ddH2019.25 μ I。反应循环条件为:94°C 3min — (94°C 30s，54°C 30s,72°C 111^11)\30个循环一721: lOmin —4°C。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在783bp处可见一条特异条带，与预期相符(见图15)。PCR扩增产物经测序鉴定合格。(8)构建第二重组质粒PCW153和第三重组质粒pCW154对步骤(7)得到的PRRSV 0RF5基因片段2用Bgl II和Sal I双酶切，对步骤(6)得到pCW117及pCW118用BamH I和Xho I双酶切。Bgl II和Sal I双酶切体系和反应条件为:10Xbuffer32y 1，IOXBSA 2 μ 1，基因样品 5 μ 1，Bgl II 0.4μ I,Sal 10.4 μ 1，ddH2010.2 μ 1，37 °C水浴反应lh。BamH I和Xho I双酶切体系和反应条件为:10Xbuffer32y 1，10XBSA2y 1，基因样品 5μ 1，BamH 10.4 μ I, Xho 10.4μ I,ddH2010.2μ 1，37°C水浴反应Ih15PRRSV 0RF5基因片段2双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒PCW117及pCW118经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度分别为9346bp和9000bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1步骤(2)中连接反应体系和反应条件进行连接，PRRSV 0RF5基因片段2与pCW117连接产物为第二重组质粒pCW153 (见图16);PRRSV0RF5基因片段2与pCW118连接产物为pCW154(见图17)。连接反应液按实施例1步骤(2)中方法转化感受态 E.coli ToplO0 阳性菌(E.coli/pCW153 或 E.coli/pCW154)在 LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH1、Xho I双酶切进行鉴定，鉴定结果见图18，从图18可见，pCW153和pCW154BamH1、Xho I双酶切后在约628bp和9kb处出现两条条带，与预期相符，PCW153和pCW154构建成功。实施例3:制备第一重组菌Li IacZ和第二重组菌Li Δ actA IacZ(1)扩增 IacZ 基因片段(序列见 SEQ ID N0.1 中(8192)..(12171))以质粒pHS-LV为模板PCR扩增IacZ,反应体系为:10 Xultra pfu buffer
2.5 μ l,4dNTPs (IOmmoI/L.种)0.6 μ 1，上游引物(10 μ mol/L) (LacZ-f:5，-ATAAGCGGCCGCTAGCTTTAAGGCTAAATGCCG-3’)0.8 μ 1，下游引物(10 μ mol/L) (lacZ-r: 5’ -ATAAG CGGCCGCCTAGAGTGACTTTTATGTTGAG-3，)0.8 μ 1，pHS-LV 质粒样品 I μ I, ultra pfu 0.25 μ I,ddH2019.05 μ I。反应循环条件为:94°C 3min —(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 4min20s) X 20个循环—(94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 4min20s) XlO 个循环一72°C IOmin — 4°C。PCR 产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在4001bp处可见一条特异条带，与预期相符(见图1)。PCR扩增产物经测序鉴定合格。(2)构建制备Li 1&。2和1^八&(^4 1302用的中间重组质粒口01107和口(^108分别对步骤(I)得到的IacZ和实施例2步骤(4)得到pCW105及pCW106用NotI酶切。Not I酶切体系和反应条件同实施例2中步骤(6)。IacZ基因片段酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒PCW105及pCW106经酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1步骤(2)中连接反应体系和反应条件进行连接，IacZ与pCW105连接产物为pCW107 ；lacZ与pCW106连接产物为pCW108。连接反应液按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coliToplO0阳性菌(E.col/pCW107或E.col/pCW108)在表面涂有X-Gal的LB-Amp平板上长成蓝色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Not I酶切进行鉴定，鉴定结果见图19，从图19可见，pCW107和pCW108Not I酶切后在约4001bp和IOkb处出现两条条带，与预期相符，PCW107和pCW108构建成功。(3)电转化用Li感受态细胞的制备接种Li于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37°C 220rpm培养12 16h。吸取12.5ml菌液至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37°C培养至A_为0.4左右(约4h)，加入penicillin G (终浓度:12.5 μ g/ml )，继续培养至A_为0.7左右(约2.5h)。转移菌液于洁净、无菌、预冷的250ml聚丙烯离心管中，置冰浴20min。4°C离心IOOOOr/min5min,弃上清。加入IOOml冰冷0.5mol/L鹿糖液重悬菌沉淀，于4°C离心10000r/min5min,弃上清，再用IOOml冰冷0.5mol/L蔗糖液洗2次。加入2ml冰冷0.5mol/L蔗糖液重悬菌沉淀，分装预冷无菌EP管(50 μ I/管)，立即于_70°C保存备用。
(4)质粒 PCW107 和 PCW108 电转化 Li从-70°C冰箱取出I支(3)步制备的Li细胞放于冰上融化，用预冷枪头吸入在冰上预冷的重组质粒PCW107或pCW1085 μ 1，用手指轻弹管底使液体混合均匀，置冰浴5min。用预冷枪头将EP管内全部液体吸入放冰浴预冷的电击杯(间距0.1cm)样品槽中，放冰上5min。取出电击杯置于电转化仪内电击I次(电击参数为2KV, 5ms),立即取出电击杯放冰浴5min。加入750μ I于37°C预温的0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基于电击杯中，轻轻用枪头吹出样品槽内菌液并混匀，将电击杯内全部液体吸至无菌EP管中，于30°C 140rpm振荡培养2h。将全部菌液滴于含红霉素3 μ g/ml, X-gal 40 μ g/ml的BHI琼脂平板(以下简称BH1-Ery-X-gal平板)中央，用无菌L形玻棒将菌液涂布整个平板，于30°C培养48 72h，阳性菌(Li/pCW107或Li/pCW108)生长为蓝色菌落。(5) Li/pCW107和Li/pCW108双同源重组杂交培养Li/pCW107 或 Li/pCW108 划线接种 BH1-Ery-X-gal 平板 42°C 培养 48h，长出的蓝色菌落再划线接种BH1-Ery-X-gal平板，于42°C培养48h。挑取蓝色菌落于2ml BHI液体培养基中，30°C 220rpm振荡培养24h，吸取10 μ I菌液再转种2ml BHI液体培养基中，300C 220rpm振荡培养24h，重复上步(转种)4次。取100 μ I菌液用PBS作10倍稀释，取ΙΟ—6稀释菌液涂布BH1-X-gal平板(含X-gal 40 μ g/ml的BHI琼脂平板)和BH1-Ery-X-gal平板，每个平板上涂布稀释菌液100 μ I。阳性菌落LilacZ和Li Δ actA IacZ在BHI_X_gal平板上长成蓝色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生长。(6) PCR 鉴定 Li IacZ 和 Li Λ actA IacZ用通用型柱式基因组提取试剂盒抽提Li IacZ和Li Λ actA IacZ基因组DNA作为模板，PCR扩增鉴定其中有无actA、orfBAldh、Ery和IacZ基因片段，根据扩增结果对Li IacZ和Li Δ actAlacZ的基因重组情况进行鉴定。扩增actA反应体系为:10Xultrapfu buffer 2.5 μ 1,4dNTPs (lOmmol/L.种)0.5 μ I,上游引物(10 μ mol/L) (Li actA-f:5，-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTC CC-3，)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L) (Li actA-r: 5，-ATTTCTTTAATACTGCGTTTGGGG-3’ ) 0.8 μ 1，Li/pCW107 或 Li/pCW108 基因组 DNA 样品 2.5 μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2017.65 μ I。反应循环条件为:94°C 5min — (94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s)X 30个循环一72°C IOmin — 4°C。扩增orfBAldh和Ery的反应体系和反应循环条件同实施例2(1)。扩增IacZ的引物和反应体系和反应循环条件同实施例3中步骤(I)。Li IacZ和Li Λ actA IacZ的PCR鉴定，鉴定结果见图20。由图可见，经双同源杂交培养，IacZ已整合入Li基因组，Li IacZ和Li Λ actA IacZ均不携带Ery基因，且Li Λ actA IacZ中的actA基因被剔除。鉴定结果符合预期，Li IacZ和Li AactA IacZ制备成功。实施例4:利用上述制备的重组质粒和重组菌，将外源基因定点整合至Li基因组一、以 PRRSV 0RF6 基因(GenBank:AY885248.1)为外源拟整合基因(I)PCR扩增上下游分别带Hind III和Xho I酶切位点的PRRSV 0RF6基因以质粒pGBKT7-GP6为模板扩增PRRSV 0RF6基因。反应体系为:10Xultrapfu buffer 2.5 μ l,4dNTPs (10mmol/L.种)0.4μ1，上游引物(10 μ mol/L) (0RF6-f:5，-TATGTAAGCTTTGG GGTCGTCTTTAGATGAC-3，)0.8 μ 1，下游引物(10 μmol/L)(0RF6-r:5，-ATAACTCGAGCTT GGCATATTTGACAAGGTTTAC-3，)0.8 μ 1，pGBKT7_GP6 质粒样品 0.75 μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2019.5 μ I。反应循环条件为:94 °C 3min —(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)父20个循环—(941: 30s, 66°C 30s, 72°C lmin) X 10 个循环一72°C IOmin — 4°C。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在542bp处可见一条特异条带，与预期相符(图1)。PCR扩增产物经测序鉴定合格。(2) PRRSV 0RF6基因插入第一重组质粒PCW203 Hind IILXho I酶切位点之间分别对(1)步得到的PRRSV 0RF6基因片段和质粒pCW203用Hind III和Xho I双酶切。Hind III和Xho I双酶切反应体系和反应条件同实施例1步骤(2)。PRRSV 0RF6基因片段双酶切产物用通用型DNA纯化回收试剂盒回收。质粒PCW203经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度为13053bp的片段。回收后的基因片段和质粒片段按实施例1步骤(2)中连接反应体系和反应条件进行连接，得到中间重组质粒(PCW203-0RF6)。连接反应液按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coli ToplO0阳性菌(E.coli/pCW203-0RF6)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Hind III和Xho I双酶切进行鉴定，鉴定结果如图21，从图21可见，在约542bp和大于IOkb处出现两条条带，与预期相符，中间重组质粒PCW203-0RF6构建成功。 (3) pCW203-0RF6的BamH1、Xho I片段替换第二重组质粒pCW153或第三重组质粒 pCW154 的 BamH1、Xho I 片段
分别对(2)步得到的中间重组质粒pCW203-0RF6和质粒pCW153或pCW154用BamHI和Xho I双酶切，酶切体系和反应条件同实施例2步骤(8)。pCW203-0RF6双酶切产物作
0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度为592bp的片段。pCW153或pCW154经双酶切，并用碱性磷酸酶作去磷酸化处理后，作0.8%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收长度分别为8945bp和8599bp的片段。pCW203_0RF6酶切回收片段与PCW153酶切回收片段按实施例1步骤(2)中连接反应体系和反应条件进行连接，得到第一目标重组质粒(PCW153-0RF6);与pCW154酶切回收片段按实施例1 (2)中连接反应体系和反应条件进行连接，得到第二目标重组质粒(PCW154-0RF6)。目标重组质粒两个Not I位点之间的gene cassette基因序列结构示意图见。连接反应液按实施例1步骤(2)中方法转化感受态 E.coli ToplOo 阳性菌(E.coli/pCW153_0RF6 或 E.coli/pCW154_0RF6)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH I和Xho双酶切进行鉴定，鉴定结果见图22，从图22可见，pCW153-0RF6和pCW154_0RF6酶切后均在约592bp和大于Skb处出现两条条带，与预期相符，目标重组质粒构建成功。(4)目标重组质粒(pCW153-0RF6 或 pCW154-0RF6)电转化 Li IacZ 或 LiAactAIacZ按实施例3步骤(3)方法制备电转化用LilacZ或Li AactAlacZ感受态细胞。目标重组质粒按实施例3步骤(4)方法电转化LilacZ或Li Δ actA IacZ菌,阳性菌(LilacZ/PCW153-0RF6 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF6)于 BH1-Ery-X-gal 平板 30°C培养 48 72h 后，生长为蓝色菌落。(5) LilacZ/pCW153-0RF6 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF6 单、双同源重组杂交培
养按实施例3步骤(5)方法进行双同源重组杂交培养。LilacZ/pCW153_0RF6经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第一目标菌(L1-0RF6:0RF6基因替换了 IacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游)(见图23) ；Li AactA lacZ/pCW154_0RF6经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第二目标菌(LiAactA-0RF6:0RF6基因替换了 IacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游)(见图24)。目标菌在BH1-X-gal平板上长成白色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生长。(6) PCR鉴定目标菌基因整合效果用通用型柱式基因组提取试剂盒抽提目标菌(L1-0RF6和Li Δ actA_0RF6)基因组DNA作为模板，PCR扩增鉴定其中有无EryUacZ和PRRSV 0RF6基因片段，根据扩增结果对目标菌基因整合情况进行鉴定。扩增Ery的引物和反应体系同实施例2步骤(1)，扩增IacZ的引物和反应体系同实施例3步骤(1)，扩增PRRSV 0RF6的引物和反应体系同本实施例“一”中的步骤(I)。L1-0RF6和LiAactA-0RF6的PCR鉴定，鉴定结果见图25。从图中可见，Li_0RF6和Li Λ actA-0RF6基因组内均不含Ery基因，表明目标重组质粒中两个Not I位点以外的基因片段不能经双同源重组杂交整合至基因组；L1-0RF6和Li AactA-0RF6基因组内均不含IacZ基因，表明经双同源重组 杂交培养后，LilacZ或Li AactA IacZ基因组内原有的IacZ已被替换掉；LilacZ或Li Λ actA IacZ基因组内均含有PRRSV 0RF6基因，表明经双同源重组杂交培养后，目标重组质粒中两个Not I位点之间包括PRRSV 0RF6在内的基因片段已整合至基因组内。(7)western blot鉴定目标菌外源整合基因在目标菌中的蛋白表达和蛋白分泌效果①目标囷蛋白样品的制备分泌蛋白样品的制备:接种目标菌于2ml BHI液体培养基，于37°C 220rpm振荡培养12-16h。吸取100 μ I菌液至2ml BHI液体培养基，37°C 220rpm培养至A600约为1.0左右(约5h)。将菌液转至一干净EP管，加入预冷的100%三氯醋酸(TCA) 200 μ 1，混匀后置冰浴30min。4°C离心10000rpm30min,弃上清,加入lml-20°C预冷丙酮洗漆沉淀，置冰浴IOmin0 4°C离心lOOOOrpmlOmin,弃上清，室温干燥沉淀。加入100 μ I含4%SDS的0.5mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液重悬沉淀，瞬时离心，将上清液吸至另一干净EP管，加入等倍体积的2XSDSPAGE电泳上样缓冲液，沸水浴煮沸5min，立即上样20-30 μ I。非分泌蛋白样品的制备:吸取1.5ml生长至对数生长期的目标重组菌于一干净EP管中，离心13000rpmlmin,弃上清,加入Iml PBS重悬菌沉淀，离心13000rpmlmin,弃上清，加入150 μ I裂解缓冲液1(配方:0.5ml 0.lmol/L ρΗ7.0,磷酸盐缓冲液，Ig蔗糖，IOmg溶菌酶，3.7ml ddH20)，于 37°C孵育 2h。加入1.35ml 裂解缓冲液 2 (配方:40 μ I lmol/L ρΗ8.0Tris-HCl 缓冲液，8 μ I 0.5mol/L ρΗ8.0 EDTA 缓冲液，800 μ I 10%SDS, 200 μ I lOmg/ml 链霉蛋白酶，3.2ml ddH20),于37°C孵育30min。加入155 μ I预冷的100%TCA,置冰浴30min。4°C离心10000rpm30min,弃上清,加入lml_20°C预冷丙酮洗漆沉淀,置冰浴lOmin。4°C离心IOOOOrpm lOmin,弃上清 ,室温干燥沉淀。加入150 μ I PBS缓冲液重悬菌沉淀,再加入等体积的2XSDS PAGE电泳上样缓冲液，沸水浴煮沸5min，立即上样20-30 μ I。②western blot检测蛋白表达和分泌效果按常规进行western blot检测，分离胶浓度:15%，一抗:抗HA标签小鼠单克隆(1:2000稀释)或抗VSV-G标签小鼠单克隆抗体(1:2000稀释)，二抗:山羊抗小鼠IgG(H+L)，HRP (1:5000稀释)。结果见图26。从图可见，第一目标菌(Li_0RF6)和第二目标菌(LiAactA-0RF6)均表达了外源整合基因编码蛋白，且表达的蛋白大部分能分泌到胞外。二、以 PRRSV 0RF3 基因(GenBank:AY885248.1)为外源拟整合基因(I) PCR扩增上下游分别带Hind III和Xho I酶切位点的PRRSV 0RF3基因以质粒pRK5-GP3为模板扩增PRRSV 0RF3基因。反应体系为:10 Xultrapfu buffer 2.5 μ l,4dNTPs (10mmol/L.种)0.4μ1，上游引物(10 μ mol/L) (0RF3-f:5，-CGCGTAAGCTTTGGTTAA TAGCTGTACATTCCTC-3，)0.8 μ I，下游引物(10 μ mol/L)(0RF3-r:5，-ATAACTCGAGTCGC CGTACGGCACTGAG-3’)0.8 μ 1，pRK5_GP3 质粒样品 0.75 μ 1，ultra pfu 0.25 μ l,ddH20 19.5 μ I。反应循环条件为:94°C 3min — (94°C 30s, 55°C 30s,72°C 111^11)\20个循环—(941: 30s, 68°C 30s, 72°C lmin) X 10 个循环—72°C lOmin —4°C。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在782bp处可见一条特异条带，与预期相符(见图1 )。PCR扩增产物经测序鉴定合格。(2) PRRSV 0RF3基因插入第一重组质粒pCW203 Hind II1、Xho I酶切位点之间按本实施例“一”中的步骤(2)方法进行，得到中间重组质粒(pCW203-0RF3)。按实施例I步骤(2)中方法转化感受态E.coli ToplO0阳性菌(E.coli/pCW203_0RF3)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用HindIII和Xho I双酶切进行鉴定。
(3) pCW203-0RF3 的 BamH1、Xho I 片段替换或 pCW154 的 BamH1、Xho I 片段按本实施例“一”中的步骤(3)方法进行。pCW203-0RF3的BamH1、Xho I片段与pCW153BamH1、Xho I片段替换后得到第一目标重组质粒(pCW153_0RF3)，pCW203_0RF3的BamH1、Xho I片段与pCW154BamH1、Xho I片段替换后得到第二目标重组质粒(PCW154-0RF3)。按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coli ToplO0阳性菌(E.coli/PCW153-0RF3或E.coli/pCW154_0RF3)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH I和Xho双酶切进行鉴定。(4)目标重组质粒(pCW153-0RF3 或 pCW154-0RF3)电转化 Li IacZ 或 Li AactAIacZ按实施例3步骤(3)方法制备电转化用LilacZ或Li Λ actA IacZ感受态细胞。目标重组质粒按实施例3步骤(4)方法电转化LilacZ或Li Δ actA IacZ菌,阳性菌(LilacZ/pCW153 - 0RF3 或 Li Λ actA lacZ/pCW154-0RF3)于 BH1-Ery-X-gal 平板 30°C 培养 48 72h后，生长为蓝色菌落。(5) LilacZ/pCW153-0RF3 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF3 单、双同源重组杂交培
养按实施例3步骤(5)方法进行双同源重组杂交培养。LilacZ/pCW153_0RF3经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第一目标菌(L1-0RF3:0RF3基因替换了 IacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游)；Li Δ actAlacZ/pCW154-0RF3经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第二目标菌(LiAactA-0RF3:0RF3基因替换了 IacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游)。目标菌在BH1-X-gal平板上长成白色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生长。
(6) PCR鉴定目标菌基因整合效果按本实施例“一”中的步骤(6)方法进行。扩增PRRSV 0RF3的引物和反应体系同本实施例“二”中的步骤(I)。(7)western blot鉴定目标菌外源整合基因在目标菌中的蛋白表达和蛋白分泌效果按本实施例“一”中的步骤(7)方法进行。结果见图26。从图可见，第一目标菌(L1-0RF3)和第二目标菌(LiAactA-0RF3)均表达了外源整合基因编码蛋白，且表达的蛋白大部分能分泌到胞外。三、以PRRSV 0RF4基因(GenBank:AY885248.1)为外源拟整合基因(I)PCR扩增上下游分别带Hind III和Xho I酶切位点的PRRSV 0RF4基因以质粒pRK5-GP4为模板扩增PRRSV 0RF4基因，反应体系为:10 X ultra pfubuffer 2.5 μ l,4dNTPs (lOmmol/L.种)0.4μ1，上游弓丨物(10 μ mol/L) (0RF4_f:5，-TATGTAAGCTTTGGCTT CGTCCCTTCTTTT (Χ-3，)0.8μ1，下游引物(10 μ mol/L)(0RF4-r:5，-ATAACTCGAG AATTGCCAACAGAATGGCAAAAAG-3’)0.8 μ 1，pRK5_GP4 质粒样品0.75 μ I, ultra pfu 0.25 μ I，ddH2019.5 μ I。反应循环条件为:94°C 3min — (94°C 30s，55 °C 30s, 72 °C lmin) X 20 个循环一(94 °C 30s, 66 °C 30s, 72 °C lmin) X 10 个循环—72°C IOmin — 4°C。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在554bp处可见一条特异条带，与预期相符(见图1)。PCR扩增产物经测序鉴定合格。
(2) PRRSV 0RF4基因插入第一重组质粒pCW203 Hind II1、Xho I酶切位点之间按本实施例“一”中的步骤(2)步方法进行，得到中间重组质粒(PCW203-0RF4)。按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coli ToplO0阳性菌(E.col/pCW203_0RF4)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Hind III和Xho I双酶切进行鉴定。(3) pCW203-0RF4 的 BamH1、Xho I 片段替换或 pCW154 的 BamH1、Xho I 片段按本实施例“一”中的步骤(3)步方法进行。PCW203-0RF4的BamH1、Xho I片段与pCW153BamH1、Xho I片段替换后得到第一目标重组质粒(pCW153_0RF4)，pCW203_0RF3的BamH1、Xho I片段与pCW154BamH1、Xho I片段替换后得到第二目标重组质粒(PCW154-0RF4)。按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coli ToplO0阳性菌(E.coli/PCW153-0RF4或E.coli/pCW154_0RF4)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH I和Xho双酶切进行鉴定。(4)目标重组质粒(pCW153-0RF4 或 pCW154-0RF4)电转化 Li IacZ 或 Li AactAIacZ按实施例3步骤(3)方法制备电转化用LilacZ或Li Λ actA IacZ感受态细胞。目标重组质粒按实施例3步骤(4)方法电转化LilacZ或Li Δ actA IacZ菌,阳性菌(LilacZ/PCW153-0RF4 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF4)于 BH1-Ery-X-gal 平板 30°C培养 48 72h 后，生长为蓝色菌落。(5) LilacZ/pCW153-0RF4 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_0RF4 单、双同源重组杂交培
养
按实施例3步骤(5)步方法进行双同源重组杂交培养。LilacZ/pCW153_0RF4经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第一目标菌(L1-0RF4:0RF4基因替换了 IacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游)；Li Δ actAlacZ/pCW154-0RF4经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第二目标菌(LiAactA-0RF4:0RF4基因替换了 IacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游)。目标重组菌在BH1-X-gal平板上长成白色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生长。(6) PCR鉴定目标重组菌基因整合效果按本实施例“一”中的步骤(6)方法进行。扩增PRRSV 0RF4的引物和反应体系同实施例4、三、(I)。(7) westernblot鉴定目标菌外源整合基因在目标菌中的蛋白表达和蛋白分泌效果按本实施例“一”中的步骤(7)方法进行。结果见图26。从图可见，第一目标菌(L1-0RF4)和第二目标菌(LiAactA-0RF4)均表达了外源整合基因编码蛋白，且表达的蛋白大部分能分泌到胞外。四、以结核杆菌Rv0129基因(GenBank:AL123456.2)为外源拟整合基因(I)PCR扩增上下游分别带Hind III和Xho I酶切位点的Rv0129基因以质粒pET_Ag85c为模板扩增Rv0129基因，反应体系为:10Xultra pfubuffer 2.5 μ l,4dNTPs (IOmmoI/L.种)0.4 μ 1，上游弓丨物(10 μ mol/L) (Rv0129-f:5，-GCTCAAGCTTTCTCTAGGCC CGGTCTTCC-3，)0.8 μ I，下游引物(lOymol/L)(Rv0129-r:5，-AATACTCGAGGGCGGCCG GAGCAGCAG-3，)0.8 μ l，pET_Ag85c质粒样品 0.75 μ 1，ultra pfu 0.25 μ 1，ddH2019.5 μ I。反应循环条件为:94°C 3min — (94°C 30s, 56°C 30s,72°C 111^11)\20个循环—(941: 30s, 70°C 30s, 72°C lmin) X 10 个循环—72°C lOmin —4°C。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，在901bp处可见一条特异条带，与预期相符(见图27)。PCR扩增产物经测序鉴定合格。(2)Rv0129基因插入第一重组质粒pCW203 HindII1、Xho I酶切位点之间按本实施例“一”中的步骤(2)方法进行，得到中间重组质粒(pCW203-Rv0129)。按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coli ToplO0阳性菌(E.coli/pCW203_Rv0129)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用Hind III和Xho I双酶切进行鉴定。(3)pCW203-Rv0129 的 BamH I, Xho I 片段替换或 pCW154 的 BamH I, Xho I 片段按本实施例“一”中的步骤(3)方法进行。pCW203_Rv0129的BamH1、Xho I片段与pCW153BamH I,Xho I片段替换后得到第一目标重组质粒(pCW153_Rv0129)，pCW203_0RF3的BamH1、Xho I片段与pCW154BamH1、Xho I片段替换后得到第二目标重组质粒(pCW154-Rv0129)o按实施例1步骤(2)中方法转化感受态E.coli ToplO0阳性菌(E.coli/pCW153-Rv0129或E.coli/pCW154_Rv0129)在LB-Amp平板上长成白色菌落。提取阳性菌中含有的重组质粒，用BamH I和Xho双酶切进行鉴定。(4)目标重组质粒(pCW153-RvO 129 或 pCW154_RvO 129 )电转化 Li IacZ 或 Li Λ actAIacZ按实施例3(3)步方法制备电转化用LilacZ或Li Λ actA IacZ感受态细胞。目标重组质粒按实施例3步骤(4)中方法电转化LilacZ或Li Λ actA IacZ菌，阳性菌(LilacZ/pCW153-Rv0129 或 Li Λ actA lacZ/pCW154_RvO 129 )于 BH1-Ery-X-gal 平板 30°C 培养 48 72h后，生长为蓝色菌落。 (5) LilacZ/pCW153-Rv0129 或 Li Λ actA lacZ/pCW154-Rv0129 单、双同源重组杂
交培养按实施例3步骤(5)中方法进行双同源重组杂交培养。LilacZ/pCW153_Rv0129经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第一目标菌(L1-Rv0129:Rv0129基因替换了 IacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游)；Li AactA lacZ/pCW154-Rv0129经单、双同源重组杂交培养的结果为得到第二目标菌(LiAactA-RV0129:Rv0129基因替换了IacZ基因，且定点整合至细菌基因组内orfBAldh基因上游)。目标菌在BH1-X-gal平板上长成白色菌落，在BH1-Ery-X-gal平板上不生长。(6) PCR鉴定目标重组菌基因整合效果按本实施例“一”中的步骤(6)方法进行。扩增Rv0129的引物和反应体系同本实施例“四”中的步骤(I)。(7)western blot鉴定目标菌外源整合基因在目标菌中的蛋白表达和蛋白分泌效果按本实施例“一”中的步骤(7)方法进行。结果见图26。从图可见，第一目标菌(L1-Rv0129)和第二目标菌(LiAactA-Rv0129)均表达了外源整合基因编码蛋白，且表达的蛋白大部分能分泌到胞外。
权利要求
1.一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于包括以下步骤: (I)将从含有拟整合外源基因的生物基因组模板或基因克隆质粒库内PCR扩增得到的上游带Hind III酶切位点、下游带Xho I酶切位点的外源拟整合基因，插入第一重组质粒的Hind III酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到中间重组质粒，所述第一重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.1所示； (2 )切下步骤(I)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第二重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第一目标重组质粒，所述第二重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.2所示； 或切下步骤(I)得到的中间重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入第三重组质粒的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，得到第二目标重组质粒，所述第三重组质粒的基因序列为序列表中SEQ ID N0.3所示； (3)将步骤(2)得到的第一 目标重组质粒电转化第一重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，在其基因组orfBAldh基因上游整合入了 β-半乳糖苷酶基因，能表达半乳糖苷酶，在含5-溴_4氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白； 或将步骤(2)得到的第二目标重组质粒电转化第二重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二重组菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组orfBAldh基因上游整合入了 β -半乳糖苷酶基因，能表达β -半乳糖苷酶，在含5-溴-4氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷的培养基上长成蓝色菌落，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。
2.根据权利要求1所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第一重组质粒的步骤如下: (1)扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒包膜蛋白GP5编码基因0RF5的基因片段，其上游带Hind III酶切位点，下游带Xho I酶切位点； (2)将步骤(I)所述0RF5基因片段插入质粒pHS-LV的HindIII酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第一重组质粒。
3.根据权利要求1所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第二重组质粒的步骤如下: (1)扩增上游带HindIII酶切位点、下游带Not I酶切位点的绵羊李斯特菌orfXYZ基因，并将所述orfXYZ基因插入质粒pHS-LV的Hind III酶切位点与Not I酶切位点之间； (2)扩增上游带SalI酶切位点、下游带SpeI酶切位点的Ery基因，并将所述Ery基因插入步骤(I)所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间； (3)扩增上游带XbaI酶切位点、下游带Not I酶切位点的绵羊李斯特菌orfBAldh基因，并将所述orfBAldh基因插入步骤(2)所得重组质粒的Xba I酶切位点与Not I酶切位点之间；(4)从权利要求1所述第一重组质粒中扩增上下游分别带NotI酶切位点的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因片段1，并将所述0RF5基因片段I插入步骤(3)所得重组质粒的Not I酶切位点； (5)从步骤(4)所得重组质粒中扩增上游带BglII酶切位点、下游带Sal I酶切位点的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因片段2，并将所述0RF5基因片段2插入步骤(4)所得重组质粒BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第二重组质粒。
4.根据权利要求1所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第三重组质粒的步骤如下: (1)扩增上游带HindIII酶切位点、下游带Not I酶切位点的绵羊李斯特菌mpl基因，并将所述mpl基因插入质粒pHS-LV的Hind III酶切位点与Not I酶切位点之间； (2)扩增上游带SalI酶切位点、下游带SpeI酶切位点的Ery基因，并将所述Ery基因插入步骤(I)所得重组质粒的Sal I酶切位点与Spe I酶切位点之间； (3)扩增上游带XbaI酶切位点、下游带Not I酶切位点的绵羊李斯特菌orfBAldh基因，并将所述orfBAldh基因插入步骤(2)所得重组质粒的Xba I酶切位点与Not I酶切位点之间； (4)从权利要求1所述第一重组质粒中扩增上下游分别带NotI酶切位点的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因片段1，并将所述0RF5基因片段I插入步骤(3)所得重组质粒的Not I酶切位点； (5)从步骤(4)所得重组质粒中扩增上游带BglII酶切位点、下游带Sal I酶切位点的猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF5基因片段2，并将所述0RF5基因片段2插入步骤(4)所得重组质粒BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，即得第三重组质粒。
5.根据权利要求3所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第一重组菌的步骤如下: (1)扩增上、下游分别带NotI酶切位点的IacZ基因片段，并将所述IacZ基因片段插入权利要求3中制备第二重组质粒的步骤(3)所得重组质粒的Not I酶切位点； (2)将步骤(I)所得重组质粒电转化绵羊李斯特菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得到第一重组菌。
6.根据权利要求4所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于制备第二重组菌的步骤如下: (1)扩增上、下游分别带NotI酶切位点的IacZ基因片段，并将所述IacZ基因片段插入权利要求4中制备第三重组质粒的步骤(3)所得重组质粒的Not I酶切位点； (2)将步骤(I)所得重组质粒电转化绵羊李斯特菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得到第二重组菌。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于所述外源基因为不含Hind II1、Xho I和BamH I酶切位点的基因。
8.根据权利要求7所述将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，其特征在于所述外源基因为猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF6基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF3基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒0RF4基因、结核杆菌Rv0129基因中的一种。
9.权利要求1至6中任一权利要求所述方法得到的第一目标菌，或权利要求1至6中任一权利要求所述方法得到 的第二目标菌。
全文摘要
一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法，将第一目标重组质粒电转化第一重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第一目标菌，所述第一目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白；或将第二目标重组质粒电转化第二重组菌，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，得到第二目标菌，所述第二目标菌为一种重组绵羊李斯特菌，其基因组内无actA基因和plcB基因，且在其基因组内orfBAldh基因上游整合了外源基因，并能稳定表达和分泌外源基因编码蛋白。
文档编号C12N15/74GK103074361SQ201310044170
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者汪川, 沈海浅 申请人:上海颂悦实业有限公司, 汪川