专利名称：一种简便快速检测绵羊多胎基因bmpr-ib的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物技术领域，尤其适用于从绵羊羊毛毛囊中简便快速提取基因组DNA，继而用于检测绵羊BMPR-I B多胎基因A746G位点的试剂盒及方法。
背景技术：
Fed基因是在绵羊中识别出的高繁殖力的第一个主效基因，后被证明该基因实际为BMPR-IB基因，现已发现在澳大利亚Booroola Merino绵羊、印度Garole绵羊、印度尼西亚Javanese绵羊、中国的湖羊、小尾寒羊、中国美利奴羊(军垦型)、中国美利奴羊(新疆型)、滩羊、策勒黑羊中存在BMPR-IB基因A746G突变位点，该基因对绵羊的排卵数与产羔数有显著影响，是控制绵羊产羔数的主效基因之一。文献检索披露①2010年11月由新疆农垦科学院的管峰等申请了专利“一种快 速检测绵羊多胎FecB基因的方法”，该发明所提供的利用四条单链扩增引物进行FecB基因分型的方法，是由特异性上游引物F1、下游引物Rl和对照上游引物F2、下游引物R2共同对待测绵羊基因组DNA扩增，然后对PCR扩增产物进行电泳分析，确定序列扩增产物中条带大小和数目，产物有三种情况包含220bp和120bp ；220bp和160bp ;220bp、160bp和120bp。②2011年5月，新疆农垦科学院的杨华等申请了专利“绵羊BMPR-IB基因A746G多态性检测试剂盒及检测方法”，公开的绵羊BMPR-IB基因A746G多态性检测试剂盒，主要包含扩增液、至少I张基因芯片、杂交缓冲液I和II、预杂交液、Taq酶、杂交显色试剂；另外公开了利用该试剂盒进行检测的方法步骤制备多个绵羊的染色体DNA备用；试剂盒组装；用PCR方法扩增；变性处理；预杂交及杂交；杂交信号检测。目前，关于检测BMPR-IB基因A746G突变位点的试剂盒及方法的相关发明较少，针对BMPR-IB基因检测的发明及方法，获取DNA的手段基本上都是通过酚仿抽提法提取试验动物血液中的DNA来实现的，但常规的酚仿抽提法操作过程较为繁琐，需要用蛋白酶K进行较长时间的消化，在多步操作中会有基因组DNA损失，整个检测过程较长，且所用酚仿等试剂对操作者身体健康不利。高质量基因组DNA的提取是后续分子生物学研究的重要基础，较容易获得而且最常用的材料有动物的血液、耳组织、尾组织或趾尖等样品，采集这些组织虽不至于导致动物死亡，但对动物均会或多或少地造成身体伤害，易产生应激，尤其是对于经济价值高或濒临灭绝的珍稀保护动物更不适用，提取动物毛发则相对简便，并且对动物几乎不会造成伤害，另外，毛发更便于长期保存和长途运输，不需要冷藏，也不需要特殊处理。文献关于从毛发中提取DNA的方法也有报道⑴余舰等在蛋白酶K(56°C )作用下，采用酚-氯仿反复抽提法从毛发中提取了微量的DNA，但缺点是提取的DNA的量较少。⑵徐艳春等和伍新尧等用Chelex-100处理毛发制备DNA，达到I根毛发提取得到的DNA即可得到较好的实验结果，但用此方法对毛囊细胞裂解不够彻底，残留的消化液对后继的PCR过程有一定的影响。而后，⑶李军林等在常规的酚-氯仿提取法的基础上加以优化，以pH8. 8Tris-HCl、MgCl2溶液和蛋白酶K为裂解液消化，使其获得了较高质量的DNA，但操作繁复、耗时。(4)赵春江等在此基础上加以改进，以常用的PCR缓冲液、MgCl2溶液和蛋白酶K为裂解液，在PCR仪上设置一个单循环程序65°C 30min,95°C 15min，4°C lOmin，而后瞬时离心PCR管，上清液即可做PCR模板，此法采用的较高消化温度(65°C )，可使蛋白酶K在较短时间内高效地消化毛囊中的蛋白质，使细胞释出DNA ；PCR的缓冲液中含有的Tris碱和PCR缓冲液的pH值，可在DNA提取过程中起到保护DNA、防止降解的作用；在PCR仪上，950C 15min过程可使蛋白酶K灭活，防止蛋白酶K在后续PCR过程中消化Taq酶而使PCR扩增无法进行，该方法可以用于大量标本的处理，且效果较好，但该方法中所用试剂价格相对较高且需保存在_20°C条件下。(5)杨胜林等通过从不同数量的猪毛中提取的DNA进行质量比较分析，找出了适合于做分子标记试验所需的猪毛样本数量，Di Martino等采用剪除毛干、保留毛囊的方法预处理毛发，可以减少角蛋白污染，提高DNA提取物的浓度和纯度。本发明的试剂盒，适用于检测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点，可在24小时内
准确得出检测结果，为绵羊早期选种，即快速检测绵羊多胎基因，提供了一种效率高、操作简便和经济实用的可规模化实施的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种效率高、操作简便、可规模检测，适用于检测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点的试剂盒及快速检测方法。本发明的目的是这样实现的一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的试剂盒，利用试剂盒从羊毛毛囊中快速提取基因组DNA，并运用PCR-RFLP技术检测BMPR-IB多胎基因A746G位点；其中试剂盒包括毛样DNA提取液A和B，PCR扩增液、限制性内切酶Ava II、IOXBuffer R、染料、ddH20、说明书;(I)毛样DNA提取液A为175mM的NaOH溶液；(2)毛样DNA提取液B 为 175mM 的 HCl 16. 7 μ 1，IOOmM 的 Tris-HCl、ρΗ8· 5,500 μ 1，ddH20 483. 3 μ I ;(3) PCR 扩增液为 2XTaq PCR MasterMixlO. O μ l,ddH207. 7 μ 1，IOmM 的上下游引物各0.4μ 1，BMPR-IB基因的上下游引物由上海生物工程技术有限责任公司合成；上游引物序列5’GTCGCTATGGGGAAGITTGGATG3’ ；下游引物序列5’CAAGATGITTTCATGCCTCATCAACACGGTC3，；(4)限制性内切酶Ava II为IOU/ μ I ；(5) IOXBuffer R 为 IOOmM Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IM KCl, lmg/mlBSA ；(6)染料为 6XRNA/DNA Loading buffer ；(7) ddH20 ；(8)说明书；其中对绵羊繁殖力基因的检测(I)毛样DNA的提取取15根带有毛囊的毛样，用70%乙醇清洗2次，蒸馏水清洗2次，用消毒剪，剪切O. 4cm根部毛样，放入O. 2ml离心管中离心，3500rpm、5_10s ;加15μ I毛样DNA提取液Α，漩涡混合离心，3500rpm、5-10s ;用热循环程序处置75°C lmin,80°C 2min，85°C lmin，95°C lmin，97°C 5min ;从热循环仪上取下，加入15 μ I毛样DNA提取液B，漩涡混合，_20°C保存；经3500rpm、5-10s离心，取上清作为DNA模板，PCR扩增备用；(2)PCR扩增将I. 5 μ I DNA模板加入对应标号的PCR管中，再加入18. 5 μ I PCR扩增液，弹去气泡，震荡混匀，经3500rpm、5-10s离心；放入设定好程序的PCR仪中，反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s、60°C退火温度30s、72°C延伸30s共30个循环，72°C延伸5min，4°C保存；用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，电压120V、电泳30min、EB染色，凝胶成像扩增产物符合预期片段140bp ；(3) PCR-RFLP 检测酶切反应体系为 ddH20 2. 5 μ 1，IOXBuffer R2. O μ 1，限制性内切酶Ava II O. 5 μ 1，PCR扩增产物5. O μ I ;放入37°C恒温箱消化4h ;用2. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物检测，电压120V、电泳30min、EB染色，凝胶成像系统成像，其基因判型结果看不到30bp条带,只见140bp、IlObp条带。本发明对毛囊DNA提取的提取液配方、毛囊样本量和DNA提取液上样量的最适配 t匕、热循环程序进行优化，确定毛样DNA提取液A为175mM的NaOH溶液1000 μ 1，毛样DNA 提取液 B 为 175mM 的 HCl 16. 7 μ I，IOOmM 的 Tris-HCl (ρΗ8· 5) 500 μ 1，ddH20483. 3 μ I ；15根带毛囊的毛样加15 μ I毛样DNA提取液提取效果最佳；最优热循环程序为75°C lmin,80°C 2min，85°C lmin，95°C lmin，97°C 5min ;此方法将用传统酚氯仿抽提法提取基因组DNA的时间由1-2天缩短至30min，将利用PCR-RFLP技术检测BMPR-IB多胎基因A746G位点的整个试验时间由2-3天缩短至I天，极大地提高了测定绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点的效率。本发明的快速检测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点的方法，主要通过优化和改进羊毛毛囊DNA的提取方法，简便快速的从羊毛毛囊中提取基因组DNA，进而进行PCR-RFLP检测得以实现，彰显技术进步。
本发明结合实施例作进一步说明。附图I为PCR扩增的电泳图；如图所示M为DL2000DNA Marker,泳道2_4为用传统酚氯仿抽提法从血样中提取基因组DNA后进行PCR扩增的产物，泳道I为该方法的空白对照；泳道6-8为用优化后的毛囊DNA提取方法从羊毛毛囊中提取基因组DNA后进行PCR扩增的产物，泳道5为该方法的空白对照。附图2为酶切图；如图所示M为DL2000DNA Marker，泳道5为140bp，判定为++基因型，泳道1-4、6、8为140bp、110bp、30bp，判定为B+基因型，泳道7为110bp、30bp，判定为BB基因型;因30bp条带片段小,有可能从胶中跑出，可能看不到30bp条带,只可见140bp、IlObp条带,不影响判型。
具体实施例方式本发明结合实施例作进一步说明。实施例本发明公开的快速检测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点的试剂盒包括下列毛样DNA提取液A和B、PCR扩增液、限制性内切酶Ava I IUOXBuffer R、ddH20、染料、说明书，具体规格如下表
权利要求
1.一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的试剂盒，其特征在于利用试剂盒从羊毛毛囊中快速提取基因组DNA，并运用PCR-RFLP技术检测BMPR-IB多胎基因A746G位点； 其中试剂盒包括毛样DNA提取液A和B，PCR扩增液、限制性内切酶Ava II、IOXBuffer R、染料、ddH20、说明书; (1)毛样DNA提取液A为175mM的NaOH溶液；(2)毛样DNA 提取液 B 为 175mM 的 HCl 16. 7 U 1，IOOmM 的 Tris-HCl、pH8. 5,500 u 1，ddH20 483. 3u I ；(3)PCR 扩增液为 2XTaq PCR MasterMixlO. 0 U I, ddH20 7. 7 ii 1，IOmM 的上下游引物各0.4iU，BMPR-IB基因的上下游引物由上海生物工程技术有限责任公司合成；上游引物序列5’GTCGCTATGGGGAAGITTGGATG3’ ；下游引物序列5’CAAGATGITITCATGCCTCATCAACACGGTC3，； (4)限制性内切酶AvaII为IOU/ u I ；(5)IOXBuffer R 为 IOOmM Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IM KCl, lmg/mlBSA ； (6)染料为6XRNA/DNA Loading buffer ； (7)ddH20 ； (8)说明书; 其中对绵羊繁殖力基因的检测 (1)毛样DNA的提取取15-30根带有毛囊的毛样，用70%乙醇清洗2次，蒸馏水清洗2次,用消毒剪,剪切0. 4cm根部毛样，放入0. 2ml离心管中离心，3500rpm、5_10s ;加15 y I毛样DNA提取液A,镟润混合离心,3500r pm、5_10s ;用热循环程序实施热循环75°C lmin,80 °C 2min,85°C lmin，95°C lmin，97°C 5min ;从热循环仪上取下，加入 15 毛样 DNA 提取液B，漩涡混合，_20°C保存；经3500rpm、5-10s离心，取上清作为DNA模板，PCR扩增备用； (2)PCR扩增将I.5iil DNA模板加入对应标号的PCR管中，再加入18. 5 PCR扩增液,弹去气泡,震荡混匀，经3500rpm、5-10s离心；放入设定好程序的PCR仪中，反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s、60°C退火温度30s、72°C延伸30s共30个循环，72°C延伸5min, 4°C保存；用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，电压120V、电泳30min、EB染色，凝胶成像扩增产物符合预期片段140bp ； (3)PCR-RFLP检测酶切反应体系为ddH202. 5 u l,10XBuffer R2. Oyl，限制性内切酶Ava II 0.5 u I, PCR扩增产物5. 0 U I ;放入37°C恒温箱消化4h ;用2. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物检测，电压120V、电泳30min、EB染色，凝胶成像系统成像，其基因判型结果:看不至1J 30bp条带,只见140bp、IlObp条带。
2.按照权利I所述的方法，其特征在于所用三羟甲基氨基甲烷，即Tris-base，由庄盟生物提供；2XTaq PCR MasterMix由博迈德生物提供；限制性内切酶Ava IIUOXBufferR由MBI Fermentas公司提供；6XRNA/DNA Loadingbuffer由博迈德生物提供；ddH20由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供；DL2000DNA Marker由庄盟生物提供；EB由天根生化科技有限公司提供；3_18K高速冷冻离心机产自SIGMA公司JY04S凝胶成像仪产自北京君意东方电泳设备有限公司。
全文摘要
本发明提供的一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的试剂盒，包括(1)毛样DNA提取液A为175mM的NaOH溶液；(2)毛样DNA提取液B为175mM的HC l16.7μl，100mM的Tris-HCl、pH8.5、500μl，ddH2O483.3μl；(3)PCR扩增液为2×Taq PCR MasterMix10.0μl，ddH2O 7.7μl，10mM的上下游引物各0.4μl，其中BMPR-IB基因的上游引物序列5'GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG3'；下游引物序列5'CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC3'；(4)限制性内切酶Ava II为10U/μl；(5)10×Buffer R为100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，1M KCl，1mg/ml BSA；(6)染料为6×RNA/DNA Loading buffer；(7)ddH2O；(8)说明书。
文档编号C12Q1/68GK102758016SQ20121023621
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者刘武军, 王琼, 邵勇钢 申请人:新疆农业大学