专利名称：一种哈萨克绵羊抗包虫病基因单倍型筛选方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种哈萨克绵羊抗包虫病基因单倍型筛选方法及其应用。
背景技术：
包虫病(细粒棘球蚴病)是世界性的人畜共患病，分布十分广泛。新疆是中国包 虫病高发地区之一，绵羊包虫感染率在38. 89%-61. 25%。哈萨克绵羊是新疆地方绵羊品 种，耐粗饲，抗病性强，具有良好的产肉性能。而包虫病的流行严重地影响了新疆养羊业的 发展，同时也影响着农牧民生活质量的提高。近年来，MHC作为疾病抗性和易感性的候选基因成为研究抗病育种的热点hot spot。组织相容性复合体(major histocompatibility complex，简称MHC)是识别自身与 非自身抗原免疫反应的多基因家族，可调控机体内的细胞免疫与体液免疫。MHC的等位基因 与基因型存在丰富的多样性，研究表明MHC-DRB1基因第2外显子位点已发现80多个等位 基因。MHC基因多态性与疾病之间的关系首先发现于鸡的疱疹病毒马立克，以及鸡的劳斯 (氏)肉瘤病毒。Sayers G等研究发现萨福克羊和陶塞特羊的MHC-DRB1基因多态性与线 虫感染具有遗传抗性关系。参考文献[l]Rausch,R. L. ,1995. Life cycle patterns and geographic distribution of Echinococcusspecies. In Thompson, R. C. A. , Lymbery, A. J. (Eds.), Echinococcus and hydatid disease CABInternational, Oxon, UK.[2] Andersen, F. L. , Ouhelli, H. , Kashani, M. , 1997. Compendium on cysticechinococcosis. Brigham Young University, Provo, UT 84602, USA.[3]Eckert, J.and Deplazes, P. , 2004.Biological, Epidemiological, and Clinical Aspects ofEchinococcosis, a Zoonosis of Increasing Concern. Clin. Microbiol. Rev. , 17(1) :107-135.[4]Dalimi A. ,Motamedi G. , Hosseini M. ,Mohammadian B. , Malaki H. ,Ghamari Z.andGhaffari F. F. ,2002. Echinococcosis/hydatidosis in western Iran.Vet. Parasito 1. 105(2) :161_171.[5] Jenkins, D. J. , Romig, T. , Thompson, R. C. A. 2005. Emergence re-emergence ofEchinococcus spp. a global update. Int. J. Parasitol. 35 :1205-1219.[6]李岩，闫江林，李静.新疆绵羊棘球蚴病流行情况调查分析[J].石河子大学学 报(自然科学版)，2005，23(1).[7]阿德力，阿依古丽，陈卫国.哈萨克羊品种资源及利用建议.新疆畜牧业 2009，1 48-49.[8]Klein J (1986)Natural history of the major histocompatibility complex. Wiley, NewYork.[9]Sayers G,Good B,Hanrahan J P et al. Major histocompatibility complexDRB1 gene its role in nematode resistance in Suffolk and Texel sheep breeds[J]. Parasitology 2005，131 (3) :403 409.[10]Briles WE, Stone HA, Cole RK(1977)Marek' s disease :effects of Bhistocompatibility alloalleles in resistant and susceptible chicken lines. Science 195:193-195.[ll]Longenecker BM, Gallatin WM(1978)Genetic control of resistance to Marek，sdisease. IARC Sci Publ 24(Pt 2) :845-850.[12] Schierman Lff, Collins WM (1987) Influence of the major histocompatibilitycomplex on tumor regression and immunity in chickens.Poult Sci 66 :812-818.[13]Kaufman J, Venugopal K (1998)The importance of MHC for Rous sarcoma virusand Marek' s disease virus-some Payne-ful considerations. Avian Pathol 27 S82-S87.[14]刘云芳，高建峰，潘晓亮等.绵羊全血中DNA的微量提纯[J].石河子大学学 报，1997，1(2) 136 138.[15]Konnai, S. , Nagaoka, Y. , Takesima, S. , Onuma, M. and Aida, Y. (2003b). Technicalnote :DNA typing for ovine MHC DRB1 using polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphism(PCR-RFLP). Journal of Dairy Science 86,3362-3365.[16]Dematteis S, Rottenberg M, BazA. Cytokine response and outcome of infectiondepends on the infective dose of parasites in experimental infection by Echinococcusgranulosus. Parasite Immunology,2003, 25 :189 219.[17]Menkir M, Sissay, Arvid Uggla. Prevalence and seasonal incidence of larval and adultcestode infections of sheep and goats in eastern Ethiopia. Trop Anim Health Prod(2008)40 :387_394.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种哈萨克绵羊抗包虫病基因单倍型筛选方 法及其应用。本发明采用如下技术方案一种哈萨克绵羊抗包虫病基因单倍型筛选方法，包括以下步骤(1)、样品采集和 绵羊基因组DNA的提取选择北疆的哈萨克绵羊羊场，利用绵羊包虫病ELISA诊断试剂盒 进行血清学检测，随机采集未感染包虫病绵羊血样400只，采集感染包虫病绵羊血样302 只，所采血样提取基因组DNA ； (2)引物设计和PCR扩增对哈萨克绵羊MHC-DRB1基因外 显子2进行巢式PCR反应，两轮PCR扩增反应体系都为20 y L 第1轮扩增反应包括模板 基因组 DNAlOOng, 1. 5mmol/LMgCl2,120 u mol/L dNTP,引物 0LA-ERB1 5 ' -CCG GAA TTC CCG TCT CTG CAG CAC ATT TCT T_3 ‘和引物 0LA-HL031 :5' -TTT AAA TTC GCG CTC ACC TCG CCG CT-3'分别为0. 2 u mol/L, Taq酶1. 5U ；PCR反应优化条件为94°C预变性 5min — 15X (94°C，30s — 50°C，30s — 72°C，45s) — 72°C lOmin ；PCR 产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测；第2轮扩展反应取第1轮PCR产物3 μ L为模板，引物OLA-ERBl 5 ‘ -CCG GAA TTC CCG TCT CTG CAG CAC ATT TCTT-3‘和引物0LA-XRBI 5' -AGC TCG AGC GCT GCA CAG TGA AAC TC-3')分别为0. 1 μ mol/L,MgCl2, dNTPs和Taq酶的浓度同第1轮扩增；反 应条件为 94°C预变性 5min —30X (94°C, 30s 63V, 30s 72V, 45s) —72°C IOmin ； (3)、 PCR扩增产物的检测及酶切第2轮PCR反应产物进行HinlI、MvaI、HaeIII、ScaI和SacII 限制性内切酶的单酶切，酶切反应体系为20yL，每种内切酶用量均为5个单位，每个体系 中第2轮PCR产物为10 μ L，10 X Buffer 2 μ L，加入双蒸水至20 μ L ； (4)、进行MHC-DRB1单 倍型分型和遗传分析，筛选出抗包虫病的基因单倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab ;(5)根据 筛选出的抗包虫病的基因单倍型与非抗包虫病的基因单倍型，对哈萨克绵羊进行组群，选 取抗性组与非抗性组基因单倍型各8只绵羊，进行人工感染攻虫验证试验；结果显示抗性 组中有1只感染包虫病，非抗性组中有6只感染包虫病，抗性组与非抗性组包虫病感染率差 异显著；从而验证了哈萨克绵羊MHC-DRBl外显子2的Mvalbc-SacIIab-Hinllab为抗包虫 病的基因单倍型。一种权利要求1所述的抗包虫病基因单倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab在对哈萨 克绵羊进行抗包虫病新品系标记辅助选择、选育中的应用。本试验采用PCR-RFLP方法对哈萨克绵羊MHC-DRBl基因的多态性进行了检 测，分析了该多态性与包虫病遗传抗性之间的关系，筛选出并验证了 MHC-DRBl基因 Mvalbc-SacIIab-Hinllab单倍型为包虫病抗性单倍型，从而为快速、准确地培育抗包虫病 新品系打下坚实的基础，将促进新疆养羊业的发展。
图1哈萨克绵羊MHC-DRBl基因外显子2的PCR扩增产物检测结果，1到10号泳道 为 PCR 产物，M 为 PUC19DNA marker ；图2哈萨克绵羊MHC-DRBl基因外显子2的SacI酶切M. pucl9DNA marker ；图3哈萨克绵羊MHC-DRBl基因外显子2的HinlI酶切M. pucl9DNA marker ；图4哈萨克羊MHC-DRBl基因第2外显子MvaI酶切的检测M :puc 19DNA marker ；图5哈萨克绵羊MHC-DRBl基因第2外显子SacII酶切的检测M. pucl9DNAmarker ；图6哈萨克绵羊MHC-DRBl基因第2外显子HaeIII酶切的检测M. pucl9DNAmarker ； 图7为本发明筛选方法的技术路线图。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。1材料和方法1. 1实验动物试验中所有的哈萨克绵羊均来自新疆生产建设兵团农四师74团，其中包虫病检 测呈阴性羊400只，阳性羊302只。颈静脉采血10mL，ACD(柠檬酸钠柠檬酸葡萄糖= 1. 32g 0. 32g 1. 47g/100mL)抗凝，-20°C保存。1. 2主要药品与试剂限制性内切酶、琼脂糖、dNTP、pUC19DNA marker, Tris饱和酚、蛋白酶K、引物以及Taq酶等均为上海生物工程技术服务有限公司产品。1. 3实验方法(技术路线参考图7)1. 3. 1绵羊包虫病的诊断采用绵羊包虫病ELISA诊断试剂盒(深圳康百得公司) 进行检测，按照诊断试剂盒说明书的步骤操作。1.3. 2绵羊基因组DNA的提取从冻存抗凝全血中提取基因组DNA[14]，TE溶 解，-20°C保存。1. 3. 3引物设计和PCR扩增引物序列是参照Kormai[15]等的报道，对哈萨克绵羊 MHC-DRBl基因外显子2进行巢式PCR反应，两轮PCR扩增反应体系都为20 μ L。第1轮扩增反 应包括模板基因组 DNAlOOng, 1. 5mmol/LMgCl2,120 μ mol/L dNTP，引物 0LA-ERB1 (5' -CCG GM TTC CCG TCT CTG CAG CAC ATT TCT T_3')和引物0LA-HL031 (5' -TTT AM TTC GCG CTC ACC TCG CCG CT-3')分别为 0. 2 μ mol/L, Taq 酶 1. 5U ；PCR 反应优化条件为94°C预 变性 5min — 15 X (94°C，30s — 50°C，30s — 72°C，45s) — 72°C IOmin0 PCR 产物用 1· 5% 琼脂糖凝胶电泳检测。第2轮扩展反应取第1轮PCR产物3 μ L为模板，引物OLA-ERBl和 引物 OLA-XRBI (5 ‘ -AGC TCG AGC GCT GCA CAGTGA AAC TC-3 ‘)分别为 0. 1 μ mol/L， MgCl2, dNTPs和Taq酶的浓度同第1轮扩增；反应条件为94°C预变性5min — 30X (94°C, 30s — 63°C，30s — 72°C，45s) — 72°C IOmin0 1. 3. 4PCR 扩增产物的检测及酶切第 2 轮 PCR 反应产物进行HinlI、MvaI, HaeIII、ScaI和SacII限制性内切酶的单酶切，酶切反应体系 为20 μ L，每种内切酶用量均为5个单位，每个体系中PCR产物为10 μ L，10 X Buffer 2 μ L， 加入双蒸水至20 μ L。优化后的酶切反应条件及最适浓度的琼脂糖电泳检测见表1。表1. PCR产物的酶切及检测条件
内切酶温度(V )时间(h)凝胶浓度(% )酶切位点SacI3742. 5GAGCT*CHinlI3742. 5G(G/A)*CG (CT) CHaeIII3743. 0GG*CCSacII3742. 5CCGOGGMvaI3742. 5CC* (A/T)GG注*表示酶切位点；/表示识别A或T ;N表示识别A，C，T或G。1.3. 5数据处理及统计学分析采用X2检验法分析不同单倍型与包虫病抗 性相关分析，用X2适合性检验法分析哈萨克绵羊MHC-DRBl基因外显子2是否处于 Hardy-Weinberg平衡状态。其余的统计学分析都用t检验。2 结果2. IPCR扩增结果利用引物OLA-ERBl，0LA-HL031和0LA-XRBI对哈萨克绵羊的MHC-DRBl基因外显 子2进行PCR扩增，扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，得到了 1条296bp的特异性条
6带(见图1)。2. 2PCR-RFLP 结果参照Kormai等[16]报道的基因酶切图谱、等位基因的命名方法，酶切产物用相应 浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统分析软件，对哈萨克绵羊MHC-DRBl基因 PCR-RFLP后的电泳检测结果进行判型。得到如下结果内切酶SacI酶切后出现了 3种基因型aa，ab和bb。3种基因型酶切片断大小分 别为aa(296bp)，ab(296bp/208bp/88bp)和 bb (208bp/88bp)。表明 SacI 酶切位点上 DRBl 基因由一对等位基因(a、b)控制(见图2)。切酶HinlI酶切后出现了 3种基因型aa，ab和bb。3种基因型酶切片断大小分别 为aa(296bp)、ab (296bp/178bp/118bp)和 bb (178bp/118bp)。表明了 HinlI 酶切位点上 DRBl基因由一对等位基因(a、b)控制(见图3)。内切酶MvaI酶切后出现了 3种基因型bb，be和cc，酶切片断大小分别为 bb(123bp/87bp/86bp)、be (210bp/123bp/87bp/86bp)和 cc (210bp/86bp)。表明了 DRBl 基 因在MvaI酶切位点上由一对等位基因b和c控制(见图4)。内切酶SacII酶切后出现了 3种基因型aa，ab和bb。3种基因型酶切片断大小分 别为:aa(296bp)、ab (296bp/229bp/69bp)和 bb (229bp/69bp)。表明了 SacII 酶切位点上 DRBl基因由一对等位基因(a、b)控制(见图5)。内切酶HaeIII酶切后出现了 16种基因型(见表2)，由a，b，c，d，e和f这6个等 位基因控制。部分基因型酶切图谱(见图6)。经软件分析，内切酶在该目的片段内具有19种基因型，但在本次试验中只发现16 禾中，分别为:aa, ab, ac, ad, ae, af, be, cc, ce, cf, dd, de, df, ee, ef 禾口 , HaeIII 醇切位点 上DRBl基因由a，b，c，d，e和f这6个等位基因控制。表2哈萨克绵羊MHC-DRBl基因第二外显子PCR-RFLP基因型 对MHC-DRBl基因进行PCR-RFLP，经5种内切酶酶切后所得的等位基因进行克隆测 序，测得的片段大小与预期分析结果相同。2. 3 X2适合性检验结果采用X2适合性检验法分析了哈萨克绵羊MHC-DRBl基因外显子2是否处于平衡 状态。分析发现，哈萨克绵羊在5个限制性内切酶MvaI、SacI, SacII、HinlI和HaeIII酶 切位点的 X2 值分别是 173. 8461616 (P < 0. 01) ,9. 235968796 (P < 0. 01) ,0. 326943956 (P > 0. 05)，5. 841046027 (P > 0. 05)和 633. 1948021 (P < 0.01)。结果表明，哈萨克绵羊在 SacII、HinlI位点已经达到Hardy-Weinberg平衡，而在MvaI、SacI和HaeIII这三个酶切 位点上没有达到平衡。2. 4MHC-DRB1基因多态性与包虫病的抗性关联分析MHC-DRBl基因在包虫病阳性和阴性哈萨克绵羊中具有相似的等位基因类型，将 它们之间的等位基因频率进行差异显著分析(t检验)，结果发现，哈萨克绵羊中Mvalbc、 Hinllab、HaeIIIdcU Haelllde、HaeIII df 和 SacIIab (P < 0. 01)在包虫病阴性羊中较 多，推测是包虫病的抗性基因型。MMvaIbb, SacIIaa, Hinllbb, HaeIIIef (P < 0. 01)和 HaeIIIab(P<0. 05)在包虫病阳性羊中较多，推测是包虫病的易感基因型。(见表3)表3包虫病阴性和阳性哈萨克绵羊MHC-DRBl基因的基因型频率 注包虫病阴性与阳性哈萨克绵羊MHC-DRBl相同基因型间，*P < 0. 05广P < 0. 01
2. 5人工感染攻虫验证试验对筛选出的包虫病抗性基因型进行MHC-DRBl基因单倍型分析，发现单倍型 Mvalbc-SacIIab-HinlIab在包虫病阴性羊中高于阳性羊(P < 0. 01)(见表4)，为验证单 倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab为抗包虫病的基因单倍型，进行了人工感染攻虫验证试 验。选取经包虫病ELISA试剂盒检测阴性健康并具有单倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab 的8只两周岁哈萨克绵羊作为试验组，单倍型(SacIIab-Hinllab, MvaIbc-HinlIab, MvaIbc-SacIlab)与包虫病抗性或易感性无关的8只两周岁健康哈萨克绵羊作为对照组进 行人工攻虫试验。试验羊在相同饲养管理条件下同群饲养，每只羊经口服20只具有孕卵节 片的成虫。表4哈萨克绵羊MHC-DRBl基因不同单倍型与包虫病抗性相关分析 注:Χ2> X2o olil = 6. 63，P < 0. 01. X2 > X2a05il = 3. 84，P < 0. 05.X2 < X20 05il = 3. 84，P > 0. 01. *P < 0. 05，**P < 0. 01感染包虫病20天后，原头蚴发育为包囊[16]。本发明在攻虫4个月后，屠宰全部试应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
一种哈萨克绵羊抗包虫病基因单倍型筛选方法，其特征在于，包括以下步骤(1)、样品采集和绵羊基因组DNA的提取选择北疆的哈萨克绵羊羊场，利用绵羊包虫病ELISA诊断试剂盒进行血清学检测，随机采集未感染包虫病绵羊血样400只，采集感染包虫病绵羊血样302只，所采血样提取基因组DNA；(2)引物设计和PCR扩增对哈萨克绵羊MHC DRB1基因外显子2进行巢式PCR反应，两轮PCR扩增反应体系都为20μL第1轮扩增反应包括模板基因组DNA100ng，1.5mmol/LMgCl2，120μmol/L dNTP，引物OLA ERB15′ CCG GAA TTC CCG TCT CTGCAG CAC ATT TCT T 3′和引物OLA HL0315′ TTT AAA TTC GCG CTC ACC TCG CCGCT 3′分别为0.2μmol/L，Taq酶1.5U；PCR反应优化条件为94℃预变性5min→15×(94℃，30s→50℃，30s→72℃，45s)→72℃10min；PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；第2轮扩展反应取第1轮PCR产物3μL为模板，引物OLA ERB15′ CCG GAA TTC CCG TCTCTG CAG CAC ATT TCT T 3′和引物OLA XRBI5′ AGC TCG AGC GCT GCA CAG TGAAAC TC 3′)分别为0.1μmol/L，MgCl2，dNTPs和Taq酶的浓度同第1轮扩增；反应条件为94℃预变性5min→30×(94℃，30s→63℃，30s→72℃，45s)→72℃10min；(3)、PCR扩增产物的检测及酶切第2轮PCR反应产物进行Hin1I、MvaI、HaeIII、ScaI和SacII限制性内切酶的单酶切，酶切反应体系为20μL，每种内切酶用量均为5个单位，每个体系中第2轮PCR产物为10μL，10×Buffer 2μL，加入双蒸水至20μL；(4)、进行MHC DRB1单倍型分型和遗传分析，筛选出抗包虫病的基因单倍型MvaIbc SacIIab Hin1Iab；(5)根据筛选出的抗包虫病的基因单倍型与非抗包虫病的基因单倍型，对哈萨克绵羊进行组群，选取抗性组与非抗性组基因单倍型各8只绵羊，进行人工感染攻虫验证试验；结果显示抗性组中有1只感染包虫病，非抗性组中有6只感染包虫病，抗性组与非抗性组包虫病感染率差异显著；从而验证了哈萨克绵羊MHC DRB1外显子2的MvaIbc SacIIab Hin1Iab为抗包虫病的基因单倍型。
2.一种权利要求1所述的抗包虫病基因单倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab在对哈萨克 绵羊进行抗包虫病新品系标记辅助选择、选育中的应用。全文摘要
本发明公开了一种哈萨克绵羊抗包虫病基因单倍型筛选方法，包括以下步骤(1)、样品采集和绵羊基因组DNA的提取(2)引物设计和PCR扩增；(3)、PCR扩增产物的检测及酶切；(4)、进行MHC-DRB1单倍型分型和遗传分析，筛选出抗包虫病的基因单倍型MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab；(5)根据筛选出的抗包虫病的基因单倍型与非抗包虫病的基因单倍型，对哈萨克绵羊进行组群，选取抗性组与非抗性组基因单倍型各8只绵羊，进行人工感染攻虫验证试验；结果显示抗性组中有1只感染包虫病，非抗性组中有6只感染包虫病，抗性组与非抗性组包虫病感染率差异显著；从而验证了哈萨克绵羊MHC-DRB1外显子2的MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab为抗包虫病的基因单倍型。还公开了该基因单倍型在对哈萨克绵羊进行抗包虫病新品系标记辅助选择、选育中的应用。
文档编号C12Q1/68GK101928777SQ20101027455
公开日2010年12月29日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者剡根强, 孙延鸣, 李仁燕, 申红, 贾斌, 赵宗胜 申请人:石河子大学