专利名称：一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种增强水稻热、旱、盐、冷抗逆性的基因在作物性状改良中的应用。
背景技术：
热激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是1962年在研究果蚬唾液腺时发现的，它是机体受到高温胁迫时所产生的用以防御机体细胞损伤的一类蛋白质(Lindquist等，Annual Review of Genetics, 1988),并在蛋白质折叠、细胞内转运、降解过程以及信号转导途径中发挥重要作用，因而热激蛋白高度保守、广泛分布于各种生物体中。在真核生物，根据热激蛋白分子量大小将其分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和small HSP(sHSP)五个家族(Vierling, Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology,1991)。小分子热激蛋白sHSPs是一组分子量为12 43kD、在C端含有一个保守A⑶结构域 (a -crystallin domain)的蛋白质(Perez 等，Plant Physiology, 2009)。大多数sHSP在高温等胁迫条件下诱导表达(Lopez等，BMC Genomics, 2007),通过形成sHSP聚合体与逆境胁迫下细胞内所产生的损伤蛋白结合以防止其聚集失活，并在依赖ATP的条件下与HSP100/HSP70和HSP60相互作用，帮助受损蛋白重新折叠，恢复其生物学功能，达到维持生物体高温等逆境条件下正常生命活动的作用(Sarkar等，BMC Genomics, 2009)。植物的小分子热激蛋白趋向于独立进化,通过基因扩增(gene duplication)机制形成相较于动物更多的sHSP。这些植物特有的多样的sHSP可能在陆生植物适应固着生活环境中热、旱等不利条件的过程中进化形成。多数小分子热激蛋白均可在热胁迫下诱导表达，是植物热胁迫应答蛋白的主要成分，一些小热激蛋白也可对冷、旱、盐甚至紫外线以及有毒物质、过氧化物和病虫害等胁迫产生反应(Gorovits等，Molecular Plant-MicrobeInteractions, 2004)。Harrington 等(Plant Physiology, 1988)对人工培养的烟草细胞进行盐诱导，发现盐诱导下能产生一种小热激蛋白，使细胞抗盐性提高。Moynihan等(PlantPhysiology, 1995)的报道表明，经过高温处理的一些植物会具有一定的抗寒性，并认为是热诱导表达的小分子热激蛋白通过维持蛋白质正常结构功能，提高了植物的抗寒能力。Wehmeyer等(Plant Physiology, 2000)的研究发现,拟南芥种子发育后期脱水过程中，以及热诱导后小分子热激蛋白基因HSP17. 4可大量表达，进而提高种子和植株的抗旱性，而在旱敏感突变株中HSP17. 4的表达量则很低，表明小分子热激蛋白基因HSP17.4可能同时具有抗热、抗旱功能。近年来，全球范围内极端天气出现的频率、强度和不可预期性趋于加剧。在我国，这种强度、持续时间不确定性的夏季高温伏旱、秋冬春连旱、春秋季低温冷害均严重影响农业生产与粮食安全，因而对作物多种逆境耐受能力提出更高要求，可集约增强多逆境抗性的基因的鉴定与应用也受到更多关注。在这一方面，转录因子因具有调控下多途径基因表达作用而有其优势，但这些同时开启的调控途径又可能导致产生不利农艺性状的负面效应。如在转基因植株中过量表达水稻转录因子0sNAC6 (Nakashima等，PlantJournal, 2006)可以同时提高其旱、高盐和稻瘟病菌抵御能力，但这种转录调控又使植株矮化产量降低，抵消了其正面效应，不利于生产应用。因此，现有报道表明，鉴定具多逆境交叉抗性的植物小分子热激蛋白有重要意义。在重要粮食作物水稻(Oryzasativa)中，Ouyang 等(Plant Molecular Biology,2009)进行的热诱导实验发现，水稻小分子热激蛋白家族的多个基因均可在高温条件下表达，响应热胁迫信号。这些小分子热激蛋白是水稻自身基因资源，基因序列短易于克隆和遗传操作，但哪些小热激蛋白基因具有提高水稻抗热能力还未从分子水平进行鉴定，它们是否同时具有抗旱、盐等逆境功能，它们的表达是否影响水稻的其它主要农艺性状表型，如何应用于水稻等重要粮食作物抗逆性状改良等尚待研究。
发明内容
本发明的目的是在于提供一个提高水稻抗逆性的功能基因，所述基因的过量表达可增强水稻对热、旱、盐和冷害的抵抗能力。 本发明的技术方案如下本发明所述提高水稻抗逆性的基因，命名为0sHSP18 (Oryza sativa Heat ShockPiOteinlS)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，所编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所不。该基因的克隆根据GenBank中水稻mRNA序列(登录号AK119261)，利用引物设计软件Primer Premier5. O设计2对巢式PCR特异引物。从水稻叶片中提取总RNA，通过反转录PCR(RT-PCR)技术从水稻中分离到0sHSP18基因编码序列。本发明所述0sHSP18基因过表达真核重组质粒，是将SEQ ID NO 1所述基因全长编码序列插入到真核表达载体PHB中获得。将上述过表达重组质粒转化水稻，获得转基因植株。实验表明相较于野生型植株，过量表达0SHSP18的转基因植株对热、旱、盐和冷害的抵抗能力明显增强。因此，本发明所述基因具有提高水稻抗逆性的作用，可在作物性状改良中应用。本发明具有以下有益效果I、本发明为提高水稻对多种逆境(高温、干旱、盐、冷害)抵抗能力的性状改良提供了一种新的功能基因资源。2、本发明所用基因为水稻本身自有基因，所以转基因水稻的安全性能高。3、本发明所述基因编码序列短，易于克隆和基因工程操作。4、本发明所述基因的克隆和植物转基因均为常规方法，所需材料易于获取。
图I是水稻小热激蛋白基因OsHSPIS在多种逆境胁迫条件(图1A)、激素诱导(图1B)和田间生长成熟植株各组织中(图1C)的表达情况。A :从左至右依次为0sHSP18在正常生长条件(28° C)、高温(38° C处理3h;45° C处理48h)、盐(IOOmM NaCl处理48h; 38 ° C，3h 后 IOOmM NaCl 处理 48h; 200mM NaCl 处理 48h; 38 ° C，3h 后 200mM NaCl 处理48h)、旱(干旱处理48h;38° C，3h后干旱处理48h)、低温(4° C处理48h;38° C，3h后4° C处理48h)条件下的表达水平；B :从左至右依次为0sHSP18在无植物激素正常生长条件下(WT)、20mg/mL 赤霉素(GA)、10mg/mL 萘乙酸(NAA)、10mg/mL 脱落酸(ABA)诱导 72h 时的表达水平；c :从左至右依次为0sHSP18在生长于光照培养箱(28° C，12h光/12h暗)的野生型日本晴幼苗叶片、田间(午间室外温度40° C)成熟植株根、茎、节、叶和颖花中的表达水平。图2是0sHSP18基因植物过表达载体pHB_0sHSP18的构建。A 0sHSP18基因过表达真核重组质粒pHB-0sHSP18构建示意图；B :重组质粒pHB-0sHSP18酶切鉴定图。图中，从左至右第I泳道为DNA分子标记，Trans2Kplus，第2泳道为pHB_0sHSP18质粒Pst I、XbaI双酶切结果。图3是0sHSP18过表达转基因植株鉴定结果。A :转基因水稻植株中筛选标记潮霉素抗性基因(Hpt)PCR扩增结果。图中，M =DNA分子标记，DL2000 ；I 阴性对照，PCR模板为野生型植株基因组DNA ；2 :阳性对照，PCR模板为重组质粒pHB-0sHSP18 ;3_5 :PCR模板为3个独立转基因植株OX-1、OX-2、0X-3基因组DNA。B :从左至右依次为野生型(WT)、3个独立转基因株系幼苗(0X-1 0X-3)正常生长条件下(28° C，12h光/12h暗)0sHSP18的表达水平；C :从左至右依次为野生型(WT)和转基因株系幼苗(0X-1)在28° C和38° C，3h、 45° C，3h诱导条件下OsHSP 18的表达水平。图4是0sHSP18过表达转基因植株表型。A :野生型(WT)、0sHSP18过表达转基因株系(0X-2)谷穗；B :野生型(WT)、0sHSP18过表达田间植株(0X-1 0X-3)秕谷率；C :野生型(WT)、0sHSP18过表达转基因株系(0X-2)谷粒；D :抽穗灌浆期田间温度，图中标灰区域(2011. 7. 20 2011. 7. 25)为抽穗期田间温度。图5是野生型(WT)、0sHSP18转基因株系(0X-1 0X-3)幼苗在高温条件下生长情况。A:45。C，12h/28。C，12h 处理 3 天；B :45。C，12h/28。C，12h 处理 21 天；C :野生型、转基因株系在高温处理21天后的苗长、根长增长率；D :野生型、转基因株系在高温处理21天后整株、绿色存活部分干重。图6是野生型(WT)、0sHSP18转基因株系(0X-1 0X-3)幼苗在干旱条件下生长情况。A 15%PEG6000处理I天；B :干旱(加入少量蒸馏水)处理3天(左)、14天(右)；C :野生型、转基因株系的失水率；D :日本晴(WT)和7个干旱品种(I 7依次为zhang melang、阿摸切、dulong-2、切加巴、modelong-2、modelong-1、沪旱3号)正常生长条件下(28° C，12h光/12h暗)幼苗中0sHSP18的表达水平。图7是野生型(WT)、0sHSP18转基因株系(0X-1 0X-3)幼苗在盐胁迫条件下生长情况。A 100mM NaCl处理5天(左)、7天(中)、14天(右)幼苗；B 100mM NaCl处理7天、14天苗长、根长增长率。图8是野生型(WT)、0sHSP18转基因株系(0X-1 0X-3)幼苗在4° C低温条件下生长21天时生长情况和茎叶、根的干重。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook Russell的分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I :水稻0sHSP18基因的克隆
I、试剂RNA 提取试剂 Trizol 购于 Invitrogen 公司；反转录酶 ReverTraAce 购于 Toyobo公司；高保真DNA聚合酶PrimeStar购于TaKaRa公司；克隆载体pEASY _Blunt SimpleCloning Vector购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。2、大肠杆菌菌株和植物材料大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a购于北京全式金生物技术有限公司；水稻粳稻品种日本晴(Oryza sative L. ssp. japonica cv. Nipponbare)种子由四川省农业科学院繁育提供。3、培养基和溶液LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7. 0，高压灭菌。SOB 培养基胰蛋白胨 20g/L,酵母粉 5g/L，NaCl O. 58g/L，KCl O. 19g/L，IOOXMg2+IOmLo 用 NaOH 调 pH 至 7. 0，高压灭菌。SOC培养基S0B+20%葡萄糖。100 X Mg2+ 溶液:20. 33g MgCl2. 6H20 和 24. 65g MgSO4. 7H20 定容于 IOOmLH2O,高压灭菌。20%葡萄糖溶液20g葡萄糖定容于IOOmL H2O,过滤除菌。4、方法4. I水稻叶片RNA提取I)取新鲜水稻叶片，加入液氮研磨成粉状，迅速转移100-200mg粉末于不含RNase的I. 5mL Ep管中，即刻加入ImL Trizol提取液混勻,振荡IOs,室温下放置5min ；2)加入O. 2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温下放置2_3min ；3)4。C，12000g离心15min，吸取上清约600μL至新EP管中，加入0.6mL异丙醇，室温下放置IOmin ；4)4° C，12000g离心lOmin，弃上清，沉淀用70%乙醇冲洗两次，4° C，7500g离心5min ；5)倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀lOmin，溶于50 μ L RNase-free ddH20中，保存于-80° C中备用。4. 2RT-PCR4. 2. IRTI)取 I μ g 总 RNA 与 I μ L PolyT18(10 μ Μ)引物混合,用 RNase-free ddH20 补足到12. 75 μ L，轻轻混匀；2)65° C保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min;
、
3)加入 5X 反应缓冲液 4 μ L，IOmM dNTP2 μ L，RNA 抑制剂 0. 25 μ L(40U/μ L)，ReverTra Ace 反转录酶 I μ L (100U/ μ L) ,42。Clh,合成第一链 cDNA ；4)95° C加热5min,失活反转录酶,终止合成反应。4. 2. 2PCR水稻OsHSP18基因的克隆
将200 μ L EP管放置于冰上，加入以下试剂
PrimeStar0,5 pL
5 X PrimeStar Buffer10 μΕ
dNTP Mixture (各2.5 mM )4 μ cDNAIpL
HSP18-FII μ HSPl 8-R1I pL
_2032.5 pL按以下程序进行扩增98° C2min(预变性)；98° ClOs(变性)，56° ClOs(复性)，72° C60s (延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72° C5min (总延伸)。以上述PCR产物为模板，以引物HSP18-F2和HSP18-R2进行第二轮PCR，复性温度58° C，延伸时间50s，其它条件同上。引物序列如下HSP18-F1:5，-GAAGGAGAGCGAGAGAGCAA-3，HSP18-R1:5，-ACCGAAACACGAACAGAGCA-3，HSP18-F2:5，-CTGCAGAGTTGGTAGCCATGACGGAG-3，HSP18-R2:5 ’ -TCTAGACCCGAGCACTACGCTATGA-3，通过上述操作，获得了 0sHSP18基因PCR扩增产物。4. 3高保真PCR产物与克隆载体pEASY-Blunt连接将由上述4. 2所述获得的0sHSP18基因PCR扩增产物与克隆载体pEASY -BluntSimple Cloning Vector按摩尔分子数比2 :1连接(25。C, IOmin),连接体系如下pEASY -Blunt Simple Cloning Vector (50 μ g/ μ L) IuL PCR 产物( 150 μ g/μ L)2μ L4. 4大肠杆菌转化I)从液氮中取出大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a感受态细胞冰浴解冻；2)将4. 3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min ；3) 42。C 热冲击 90s，立即冰浴 l_2min ；4)加入0. 8mL S0C,混匀，37° C温和振荡培养Ih ；5)室温13000rpm离心lmin，倒掉一部分上清液，留约200 μ L的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(lOOyg/mL)的LB平板，37° C培养过夜。4. 5快速裂解法鉴定重组克隆I)挑取单克隆接种于500 μ L含有氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB培养液中，37° C
振荡培养至A6tltl为0. 6 0. 8 ;2)取200μ L菌液至0. 5mL EP管中，13000rpm离心lmin，去上清，留约20 μ L上清；3 )加入20 μ L2 X快速裂解液(0. 2Μ Na0H50mL, SDS0. 5g,蔗糖27. 2g，加双蒸水至200mL)，剧烈振荡；
4) 13000rpm 离心 15min ；5)取5 μ L上清直接电泳。与对照相比，电泳带滞后的即可能是重组载体。4. 6菌落PCR鉴定重组质粒将4. 5所述经快速裂解法鉴定的重组载体再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段
是目标片段，反应体系如下
DNA 聚合 _02μ1,
IOxPCR Buffer2 μ
dNTP Mixture (各2.5 mM)1.6 pL
爾液I (iL
HSP18-F20.5 pL
HSP18-1120.5 μ￡
cidH14.2 pL·反应条件94° C3min (预变性)；94 ° C30s (变性)，58 ° C30s (复性)，72° C50s (延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72° C5min(总延伸)。对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-0sHSP18，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pEASY-Blunt Simple克隆载体的0sHSP18基因全长编码序列。实施例2 :水稻0sHSP18基因表达模式分析I、试剂RNA 提取试剂 Trizol 购于 Invitrogen 公司；反转录酶 ReverTraAce 购于 Toyobo公司；实时定量PCR试剂TransStart Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。2、方法取在多种逆境胁迫条件、激素诱导下野生型日本晴幼苗以及成熟植株各组织样品，液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例I所述。以水稻内参基因(ACTIN，Genbank登录号X16280)为对照，进行0sHSP18基因表达水平的实时定量PCR分析。0sHSP18基因定量PCR引物为RT18F和RT18R ;ACTIN基因定量PCR引物为RTACTF和RTACTR。引物序列如下RT18F:5， -CGCCTGAATCATAGCGTAGTGC-3，RT18R:5’ -CACAAACACATTCTACTGCTCCAAC-3’RTACTF 5，-AGTGATTGCACCACCAGAAAGA-3，RTACTR :5，-CAGGACCAGATTCATCATACTCG-3’实时定量PCR反应体系如下
权利要求
1.提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的用途，所述提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因为sativa Heat Shock Protein 18,缩写为其特征在于所述为水稻小分子热激蛋白家族基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；所编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，可用于作物抗逆性状改良。
2.一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的过表达真核重组质粒，其特征在于将权利要求I所述OsHSPW的核苷酸序列中基因全长编码序列插入到真核表达载体中获得，所述真核表达载体为PHB。
3.一种提高水稻抗逆性的方法，其特征在于将权利要求2所述真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。
全文摘要
本发明涉及一种提高水稻抗逆性的小分子热激蛋白基因的用途。提高水稻多种抗逆性的基因为OryzasativaHeatShockProtein18(OsHSP18)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO1所示。将SEQ ID NO1所述基因全长编码序列插入到真核载体中，获得本发明所述OsHSP18基因过量表达真核重组质粒。将上述真核重组质粒转化水稻，获得OsHSP18过表达转基因植株。实验表明本发明所述OsHSP18基因在水稻受热、旱、盐、低温胁迫时表达水平明显升高，其过量表达转基因水稻能够增强植株对多种逆境(高温、干旱、盐、冷害)的抵抗能力，且对株高、分蘖等农艺性状没有明显影响，因而可在作物抗逆性状改良中应用。
文档编号C12N15/82GK102732532SQ201210234639
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者刘永胜, 彭晓莉, 毛云, 牛向丽, 石玮, 黄胜雄 申请人:合肥工业大学