专利名称：抑制PPFIA1基因表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种SiRNA，特别涉及一种抑制PPFIAl基因表达的siRNA及其应用。
背景技术：
慢性粒细胞性白血病(Chronic Myelogenous leukemia, CML)是一种以粒系增生为主的造血干细胞恶性增殖性疾病，其特征性的细胞遗传学标志是Ph染色体t(9 ；22)(q34 ；qll)。P210BCR-ABL融合蛋白是Ph染色体的产物，具有强酪氨酸激酶活性，与CML的发生有着密切的关系，它的产生可导致其下游一系列信号蛋白的持续性磷酸化，由此引起造血干细胞发生恶性增殖、抗凋亡、黏附功能缺陷等病理生理变化。流行病学调查显示，在我国白血病中，CML的发病率为1/105，仅次于急粒和急淋而居第三位，近年来表现出明显的增加趋势。目前，CML的治疗有以下几种方法1)化疗药物，如马利兰、羟基脲、干扰素等，由于缺乏肿瘤特异性，常造成较大的毒副作用；2)造血干细胞移植(HSCT)，这是现今 唯一能治愈CML的方法，但是受供者、年龄、病程、经济条件、移植相关病等多种因素的限制，仅有少数患者可以接受；3)甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate),是第一个成功的特异性抑制酪氨酸激酶的分子靶向药物，在治疗CML上取得了可喜的成就，但其价格昂贵，而且因为耐药性的问题往往导致治疗失败；4)反义技术(反义RNA或DNA)、RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，还未获得肯定疗效(吴国林.医学综述，2006，12(21) :1329-1332.)。近20年来，CML的治疗方法有了较大的进展，寻找肿瘤恶性转化的关键“靶标”，以此为基础开发靶向药物与现代化疗药物联合应用日益表现出巨大的治疗潜力，有待于我们进行不断地探索与研究。PPFIAl基因定位于人类基因组11ρ13. 3，其编码的蛋白质含有1202个氨基酸，分子量为126kDa,属于白细胞共同抗原相关蛋白(leukocyte common antigen-relatedprotein, LAR)-蛋白酪氨酸憐酸酶(protein-tyrosine phosphatase, PTPase)相互作用蛋白家族(Liprin family)。该蛋白N端含有螺旋卷曲结构，C端具有3个SAM(streyl alpha motif)结构域，SAM 结构域中含有 LH (liprin homology)结构。已有研究发现，SAM结构域可以与多种蛋白、RNA、脂膜相互作用(Feng Qiao, James U. Bowie.Science’s STKE: signal transduction knowledge environment,2005，286，re7.)。Serra-Pages C等的研究发现，PPFIAl可以结合到白细胞共同抗原相关的蛋白酪氨酸憐酸酶(leukocyte common antigen-related protein-tyrosine phosphatase,LAR PTPase)的 D2 结构域(Serra-PagSs C, Kedersha NL,et al.The EMBOJournal, 1995，14(12) :2827-2838.)。除了 LAR PTPase, PTPase 家族中的与其结构类似的 PTP δ、PTP σ 都可以与 PPFIAl 相互作用(Pulido R, Serra-Pages C，et al. Proc NatlNcad Sci USA, 1995，92 (25) : 11686-11690.)。另外，已有研究表明PPFIAl在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的发生发展密切相关。Jarvinen的研究小组通过DNA-RNA高密度芯片联合分析发现，在喉癌细胞系中，PPFIAl可能是llql3扩增区的靶基因，同时发现llql3扩增区基因的高水平扩增对PPFIA1RNA的表达影响较大(Jarvien AK, Autio R, Haapa-Paananen Set al. Oncogene, 2006, 25 (52) :6997-7008. )。Tan 等对头颈鳞癌标本做了类似的 DNA-RNA分析也发现到 PPFIAl 的表达显著上调(Tan KD, Zhu Y, Tan HK et al. Genes ChromosomesCancer, 2008，47 (4) :353-362. )。V Astro等发现PPFIAl在乳腺癌中存在高水平表达，通过功能研究发现该基因是MDA-MB-231细胞侵袭和迁徙过程的关键分子(AstroV，AspertiC，Cangi G et al. Oncogene, 2011，30 (15) : 1841-1849.)。利用微速摄影技术研究发现该基因可以影响细胞的迁徙和伪足数目，但并不会影响伪足覆盖的面积。降低和升高该基因的表达，可以抑制和增强细胞对胞外基质的水解能力。Spangler S A等的研究表明PPFIAl可以与突触小泡锚定和释放过程中的一种功能蛋白结合，对神经元突触结构的组装及稳定性有着一定的影响(Spangler S. A, Hoogenraad C. C. BIOCHEMICAL SOCIETY TRANSACTIONS, 2007，35(5) :1278-1282.)。但是，在慢性粒细胞性白血病中，目前还未见有关PPFIAl基因的研究报道。RNAi是近几年发展起来的一种新型基因阻断技术，其主要功能成分为siRNA，siRNA具有高度的序列专一性，可特异性抑制靶目标mRNA的表达，使目的基因沉默。利用此技术，将细胞表型的改变与基因表达和功能的变化联系起来，不仅有助于了解肿瘤发生、发 展过程，而且有助于辨认和确定肿瘤基因治疗的靶点。目前，RNA干扰已广泛应用于肿瘤研究工作中，并取得了一些突破性进展，成为CML基因治疗研究的重要方向。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种抑制PPFIAl基因表达的siRNA。本发明的另一目的在于提供上述抑制PPFIAl基因表达的siRNA的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种抑制PPFIAl基因表达的siRNA，其序列为正义链5’-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3’，反义链5’-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3’；优选为，所述的抑制PPFIAl基因表达的siRNA序列(包括正义链和反义链)的3’端垂悬有dTdT，dTdT结构有利于保护RNA免受酶解；上述抑制PPFIAl基因表达的siRNA的应用抑制PPFIAl基因表达的siRNA可用于研究PPFIAl基因的功能，特别是用于进行PPFIAl基因与白血病细胞生长的相关性研究；抑制PPFIAl基因表达的siRNA可用于制备抗白血病药物。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明提供的抑制PPFIAl基因表达的siRNA能有效沉默PPFIAl基因，为研究PPFIAl基因的功能提供了新的技术方案。(2)本发明通过抑制PPFIAl基因表达的siRNA研究PPFIAl基因在白血病细胞中的功能，发现下调PPFIAl的表达可抑制白血病细胞生长，促进其凋亡。(3)本发明提供的抑制PPFIAl基因表达的siRNA可用于制备抗白血病药物，为慢性粒细胞性白血病的治疗做出贡献。
图I是Real-time PCR检测K562细胞内PPFIAlmRNA的相对表达水平图，*P〈0. 05。
图2是Western bloting检测K562细胞内PPFIAl蛋白的表达水平图。图3是Western bloting检测K562细胞内PPFIAl蛋白的相对表达水平图，*Ρ〈0· 05。图4是PPFIAlsiRNA抑制F562细胞生长的量效关系图，*Ρ<0. 05。图5是PPFIAlsiRNA抑制Κ562细胞生长的时效关系图，*Ρ<0. 05。图6是Annexin V/PI双染检测PPFIAlsiRNA对Κ562细胞凋亡的影响图，AnnexinV/PI双染检测结果。图7是Annexin V/PI双染检测PPFIAlsiRNA对Κ562细胞凋亡的影响图，各组早期凋亡细胞比例比较，*Ρ〈0. 05。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。使用的材料白血病Κ562细胞购自中国科学院上海细胞所；新生牛血清购自杭州四季青生物工程科技有限公司；1640培养基购自GIBCO公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；MTT及二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;Trizol试剂、RNA酶抑制剂、Oligo d(T) 15、蛋白质上样缓冲液购自天根生化科技(北京)有限公司，M-MLV逆转录酶购自Promega公司，Taq DNA Polymerase、dNTP购自Takara公司，SYBR Green I核酸染料购自厦门百维信生物科技有限公司；RIPA细胞裂解液购自上海申能博彩生物科技有限公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒购碧云天生物技术研究所；β -actin 一抗购自武汉博士德生物工程公司，β - actin 二抗购自北京博奥森生物技术公司，PPFIAl—抗购自abeam公司，PPFIAl 二抗购自北京聚研生物技术有限公司。统计学处理SPSS13. O统计软件处理数据，数据以均数土标准差(5±S)表示，采用完全随机设计的单因素方差分析法(one-way AN0VA)分析各组数据间差异的显著性。以P〈0. 05为有显著性差异。实施例I(一)PPFIAlsiRNA 的设计与合成根据GenBank 基因库中 PPFIAl 已知序列(Gene ID :8500, NM_003626. 2，NM_177423. I),按照siRNA设计原则，结合Ambion公司提供的在线设计工具siCatch siRNA Design针对编码区siRNA靶点位置设计；PPFIAlsiRNA 的序列为正义链5’-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3’，反义链5’-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3’；在PFIAlsiRNA的序列的3’端垂悬有dTdT，由广州锐博生物技术公司合成。以随机序列的RNA双链(scramble，SCR)作随机对照，随机序列的RNA双链购自上海吉玛制药技术有限公司，其目录号为A06001。(二)白血病K562细胞的培养
将白血病K562细胞接种于含体积分数10%的新生牛血清、无抗生素的1640培养基中，置于37°C、体积分数为5%的CO2培养箱，饱和湿度下培养；每2 3天换液传代；实验选用对数生长期、O. 2%台盼蓝拒染率>95%的细胞。(三)Real-timePCR检测K562细胞内PPFIAlmRNA的相对表达水平(I)实验分PPFIAlsiRNA组、随机对照组(SCR)和空白对照组(Control)，各组细胞以I. 5 X 105/mL的密度接种于24孔板，每孔400 μ L ；(2)使用 Invitrogen 公司 Lipofectamine 2000 转染 PPFIAlsiRNA和随机对照(转染方法参照Lipofectamine 2000说明书)，PPFIAlsiRNA组和随机对照组的核酸转染终浓度为lOOnmol/L，空白对照组加入与药物等体积(100 μ L)的无血清Opti-MEM，转染终体积500 μ L ；
(3)转染后的Κ562细胞培养6h后加入500 μ L含体积分数20%的新生牛血清的1640培养基继续培养；(4)继续培养细胞48h后，使用Trizol试剂提取各组细胞总RNA (提取细胞总RNA的方法参照天根生化科技有限公司的Trizol试剂说明书)，提取的总RNA用紫外分光光度仪(UVPupland，USA)测A260ZA280进行RNA纯度及浓度计算；(5)利用 SYBR Green I Real-time PCR 以 GAPDH 为内参检测 K562 细胞内 PPFIAlmRNA的表达水平将步骤2)提取的总RNA进行逆转录和Real_timePCR，逆转录条件37°C 持续 lh，95°C 持续 5min ；Real-time PCR 条件① 94°C 持续 5min，② 94°C 持续 30s，③PPFIA160°C、GAPDH57. 5°C持续30s，④72°C持续30s，⑤读板，⑥步骤② ⑤循环39次，⑦融解曲线分析，从60°C到95°C，每0. 3°C读一次板，停留I秒；PPFIAlmRNA的相对表达水平用Λ Ct和2_AAct计算；其中PCR所用引物自行设计，由上海生物工程技术有限公司合成，PPFIAl 上游引物5’ -GCTTCAGTTAACCTTTTTCATGTATATCCA-3’，下游引物5’ -TCGACAGTTAACATAAACGTAAAATCCTT-3’ ；GAPDH 上游引物5’ -CAACGGATTTGGTCGTATT-3 '，下游引物5’-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3'。Real-time PCR检测结果如表I和图I所示终浓度100nmol/L的PPFIAlsiRNA作用于K562细胞后48小时后，PPFIAlmRNA的表达水平显著降低，与随机对照组和空白对照组相比有显著差异(*Ρ〈0· 05)，表明PPFIAlsiRNA能有效抑制PPFIAlmRNA的表达。表I. Real-time PCR检测 K562 细胞中 PPFIAl mRNA 表达水平结果统计(i±s，n=3)
权利要求
1.一种抑制PPFIAl基因表达的siRNA，其序列为 正义链5’ -CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3’， 反义链5’ -UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3’。
2.根据权利I所述的抑制PPFIAl基因表达的siRNA，其特征在于所述的抑制PPFIAl基因表达的siRNA序列的3’端垂悬有dTdT。
3.权利要求I或权利要求2所述的抑制PPFIAl基因表达的siRNA在研究PPFIAl基因的功能中的应用，其特征在于所述的抑制PPFIAl基因表达的siRNA用于研究PPFIAl基因对白血病细胞生长的影响。
4.权利要求I或权利要求2所述的抑制PPFIAl基因表达的siRNA在制备抗白血病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制PPFIA1基因表达的siRNA及其应用，所述的siRNA的正义链序列为5'-CCACAAAGCUCUGGAUGAA-3'，反义链序列为5'-UUCAUCCAGAGCUUUGUGG-3′，在该siRNA序列的3'段垂悬有dTdT。本发明抑制PPFIA1基因表达的siRNA能有效沉默PPFIA1基因，为研究PPFIA1基因的功能提供了新的技术方案，PPFIA1基因被沉默后可抑制白血病细胞生长，促进其凋亡；该siRNA可用于制备抗白血病药物。
文档编号C12N15/113GK102827840SQ20121023461
公开日2012年12月19日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者费嘉, 朱雪娇, 骆小闯, 李育敏 申请人:暨南大学