专利名称：：抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种siRNA，具体涉及一种抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA及其在筛选弓形虫减毒活疫苗中的应用。
背景技术：
：弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫，生活史复杂，涉及的组织器官多，可引起人兽共患的弓形虫病，其危害严重程度在再现疾病中仅次于结核。孕妇感染弓形虫可引起流产、早产、畸胎、死胎、婴幼儿先天性弓形虫病、小儿智力障碍等，对人口素质和优生优育产生严重影响。近年来，随着宠物热的兴起，人与动物接触机会增加，给弓形虫病的流行带来了新的问题。弓形虫脑炎已成为艾滋病患者的主要死亡原因之一，也是器官移植患者死亡和精神病发病的主要原因之一。目前，尚无十分理想的弓形虫病治疗药物，现有的化学药物有治疗周期长、药物毒副作用大、不能根治等缺陷，迄今为止尚无一种药物能够杀灭包囊内的虫体，加之弓形虫的重复感染十分迅速，故虽经多方面努力仍未得以很好地遏制。因此，研制安全高效的弓形虫病疫苗已成为人们的迫切需要。关于弓形虫减毒或弱毒活疫苗已有不少报道，主要有Ts温度敏感株、T263突变株、S48速殖子等，其中Ts温度敏感株在多种动物体内获得了抗致死性攻击的保护力；T263突变株能有效抑制猫排卵囊的能力，由此切断传播途径；1988年，0'connd用S48速殖子有效地控制了绵羊的流产，现已用作抗绵羊弓形虫病的商用疫苗。本发明人通过具有保护性的抗弓形虫单克隆抗体免疫筛选弓形虫cDNA文库获得二个新的具有免疫保护性的候选分子，其中vv;c2基因^GenBank登录号为AY238892J序列长1515bp(SEQIDNO.l)，起始密码子位于734-736位碱基，编码183个氨基酸，蛋白质理论分析量为48.639kDa。wx基因(GenBank登录号AY208994)序列长984bp(SEQIDN0.2),起始密码子位于243-245碱基，编码198个氨基酸，蛋白质理论分子量为49.165kDa。我们利用近几年迅速发展起来的RNAi(RNAinterfetense)新技术，针对弓形虫wx2基因的228-247位序列设计的双链DNA，并将其导入弓形虫体内，获得体内能持续表达siRNA分子的RNA干扰虫株，动物感染实验表明其毒力显著减低，有望开发出家畜和宠物用弱毒或减毒活疫苗。
发明内容本发明的目的在于提供一种抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA。本发明的抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA是通过设计并体外合成双链DNA，构建逆病毒表达载体并导入弓形虫体内，获得在体内持续表达的siRNA分子。所述双链DNA的碱基序列为正义链5'-GATCCCCCATCCGTAAAGCGGTGAGTtTTCAAGAGA|ACTCACCGCTTTACGGATGTTTTTA-3';(SEQIDNO.5)反义链5'-AGCTTAAAAACATCCGTAAAGCGGTGAGT|rCTCTTGAA|ACTCACCGCTTTACGGATGGGG-3';(SEQIDNO.6)其干扰位点为wx2序列的895913位的19个核苷酸，方框内为为回文结构。所述siRNA的表达质粒为逆病毒表达载体pSUPER.retro，其分子大小为7196bp。本发明的另一目的在于提供上述siRNA在筛选弓形虫弱毒或减毒活疫苗中的应用。应用本发明的siRNA筛选弓形虫弱毒或减毒活疫苗的技术方案如下首先构建干扰质粒，经电穿孔法导入弓形虫体内，经筛选获得体内能持续表达siRNA分子的可遗传的RNA干扰虫株，采用RT-PCR鉴定其干扰效果，选取高效的RNA于扰虫株，通过动物攻击实验检验其干扰效果，进而利用筛选到的干扰虫株开发家畜和宠物用弱毒或减毒活疫苗。所述干扰虫株的筛选方法为干扰虫株的筛选方法为采用细胞内筛选和细胞外低温筛选结合的方法，首先在3^g/ml嘌呤霉素条件下、于L929细胞内培养8天，转到^g/ml嘌呤霉素条件下、于4'C细胞外选择8天，然后在4^g/ml嘌呤霉素条件下、于L929细胞内选择培养5天。本发明的优势在于本发明的siRNA分子能特异、高效地抑制弓形虫wx2基因的表达，体外干扰表达实验结果表明干扰质粒组蛋白质表达量较对照组减少60-70%;RT-PCR实验结果表明筛选的干扰虫株wx2b-i的干扰效果达到80%以上；进一歩的动物攻击实验表明千扰虫株vvx2b-i组动物发病及死亡时间显著推迟，平均存活时间延长一倍，因此该干扰虫株有望成为新的减毒虫株，可望进一步研制成应用于家畜和宠物的弱毒或减毒活疫苗。图l:pSUPER-retro质粒图图2:干扰质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果A.pSUPER-vv/JcCEcoiI，^7u7l双酶切；B.pSUPER-w义2cEcoRI,屈ol双酶切；C.pSUPER-wo:B五coM，报"i/llI双酶切；D.空泳道，无条带出现；E.pSUPER-wcc2bEcoRI，历rtdUI双酶切；F.pSUPER-no;2a五coiI，狄"dLU双酶切；G.pSUPER-CfcoWI,;^oI双酶切；H.pSUPER质茅站co/U^oI双酶切；图3:共转染干扰质粒与pcDNA3-vvx2在真核细胞COS-7细胞中蛋白质表达的Western-blot结果A.pcDNA3对照组；B.pSUPER-wx2c与pcDNA3-wx2共转染组；C.pSUPER-no:2b与pcDNA3-Ha2共转染组；D.pSUPER-vva;2a与pcDNA3-na2共转染组；E.pSUPER-C与pcDNA3-wx2共转染组；F.pcDNA3-wx2图4:干扰虫株的vv;c2基因RT-PCR检测结果A.干扰株wx2c-i;B.干扰株Hoc2b-i;C.干扰株C-i;D.野生型RH株弓形虫；E.干扰株Ha2a-i;F.P24对照图5:不同时间各组小鼠存活比率1.RH株组；2.C-i组；3.vwc2b-i组图6:速殖子攻击后各组小鼠平均生存时间具体实施例方式一、siRNA的设计与合成pSUPER-retro质粒(图l)为美国伊利诺伊大学罗树红博士惠赠。根据wx2、wjc基因cDNA序列和siRNA的设计原则以及载体pSUPER.retro的特点各设计三对具有发夹结构的包含N-19的核苷酸靶序列，序列由上海生工合成。1、盯ik(酶切位点为/厶历/7rffl7)(SEQIDNO.3)(SEQIDNO.4)2、盯ib.(酶切位点为餘〃/,〃^o!/Z7)5'-GATCCCCCATCCGTAAAGCGGTGAGTTTCAAGAGAACTCACCGCTTTACGGATGTTTTTA-3'(SEQIDNO.5)5'-AGCTTAAAAACATCCGTAAAGCGGTGAGTTCTCTTGAAACTCACCGCTTTACGGATGGGG-3'(SEQIDNO.6)3、(酶切位点为iW//,J力o/)5'-GATCCCCAGCGGTGAGTGTCGTTCTATTCAAGAGATAGAACGACACTCACCGCTTTTTTA-3'(SEQIDNO.7)(SEQIDNO.8)4、盯A.(酶切位点为5g7//,5'-GATCCCCGGGTGGCTTCTACAAGGAATTCAAGAGATTCCTTGTAGAAGCCACCCTTTTTA-3'(SEQIDNO.9)5，(SEQIDNO.10)5、(酶切位点为A^//,历/7说Z/)5'-((SEQIDNO.11)(SEQIDNO.12)6、wjfC.(酶切位点为5,-；(SEQIDNO.13)5，(SEQIDNO.14)7、阴性对照(C)(酶切位点为5'-GATCCCCTATCCGCACGCTCACTCTATTCAAGAGATAGAGTGAGCGTGCGGATATTTTTA-3'(SEQIDNO.15)5'-](SEQIDNO.16)二、干扰质粒的构建1、配对退火将配对的OligoDNA用去核酸酶的水溶解至3^g/ml，在PCR管中加入正义和反义核苷酸各及lxSTE退火缓冲液，90°C4min,7(TClOmin，然后逐渐冷却至10°C,-2(TC保存备用。2、双酶切、回收将pSUPER质粒(2^g)、州WU12.5^1、lOxTangobuffer2〃1、去离子水配成2(Vd体系，37。C酶切4hr，取反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确定酶切完全。在反应体系中加入Bg/Il2W，37'C酶切过夜。最后进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切胶回收质粒片段，测浓度并4'C保存备用。3、连接连接反应体系见表1，16'C连接过夜，构建的干扰质粒命名为pSUPER-vvjc2a、pSUPER舊2b、pSUPER督2c、pSUPER督A、pSUPER督B、pSUPER督C、pSUPER-C。表l干扰质粒连接体系退火Oligos2^1T4DNA连接buffer(10x)1^1pSUPERT4连接酶l川去离子水_^fi总体积_4、连接产物的转化1)冰上融化感受态细胞或用新鲜制备的感受态细胞；2)将冷却的10Al连接混合物加入感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴60min;3)42。C热休克90sec后迅速置冰水浴孵育2min;4)加入800^1LB液体培养基，混匀，37°C，220rpm振荡培养60min;5)取100培养物平铺到含Amp(100mg/L)的LB琼脂平板上，将平板放置室温下直至表面液体被吸收。倒置平皿，于37"培养箱中培养过夜。5、挑单克隆，初级摇菌从LB平板上挑取克隆，加入5ml液体LB(含Amp，100//g/ml)，在37'C300rpm摇床上振荡孵育1216h。三、弓形虫干扰质粒的鉴定pcDNA3-wx2、pcDNA3-wx质粒为本发明人构建并保存。1、重组质粒双酶切鉴定阳性克隆取1.5ml菌液按试剂盒说明书进行操作，小量提取质粒进行双酶切鉴定，37i:酶切4h，双酶切反应体系见表2。为了便于观察，酶切选用的位点是五coiI和i^V^UJ，观察的目的条带为281bp，阴性对照质粒采用EcoiI和屈ol双酶切，在248bp处出现相应条带。表2双酶切反应体系载体iowddH205EcoRI1.5WHindlII/Xho11.5^1BufferR_2川总体积_20W干扰质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示所有干扰质粒包括阴性对照质粒均在6.9Kb左右和281bp处各出现一条带。pSUPER空质粒对照在6.9Kb左右和248bp处各出现一条带，与预期一致，证明干扰构建成功(见图2)。2、重组质粒测序鉴定将前一步提取的质粒分装于EP管中，送上海生工测序。测序引物根据pSUPER载体设计并由上海生工公司合成5-GGAAGCCTTGGCTTTTG陽3'bindingsite:1241-12575'-GATGACGTCAGCGTTCG陽3'bindingsite:2645-2629测序结果与预期一致，说明构建成功，干扰质粒测序结果见SEQIDN0.17，阴性对照pSUPER空质粒测序结果见SEQIDN0.18。3、干扰质粒与>2真核表达质粒共转染COS-7细胞，初步观察其体外干扰表达的效果1)24孔板培养COS-7细胞，在50(Vd无抗生素的DMEM培基中接种2xl()S细胞，待细胞长到90-95%密度时开始转染。转染前1天换成无血清DMEM培基；2)转染混合物用5QtdOpti-MEM(无血清)培基稀释pcDNA3-wx2,pcDNA3-wx质粒DNA及干扰质粒各0.8^g，轻轻混匀。在5QalOpti-MEM(无血清)培基加入2.QalLipofectamin2000，室温孵育5min。然后混匀DNA与Lipofectamin2000(总体积100〃)，轻轻混匀，室温孵育20min;3)将DNA与Lipofectamin2000混合物加入24孔板细胞中，来回轻轻晃动培养板；4)37°C5%C02培养6hr后换培养基一次，培养48h-72h后收集细胞裂解液进行Westtern-blot鉴定。实验结果表明基因wx2的干扰质粒中pSUPER-wx2b组与pSUPER-wx2c组蛋白质表达量较阴性对照和野生型对照组有所减少，经灰度扫描，pSUPER-na2b组蛋白质表达量较对照组减少70%以上，pSUPER-wx2c组蛋白质表达量较对照组减少60%以上。pSUPER-wx2a组干扰效果不明显。基因wx的干扰质粒中pSUPER-wxC组表达减少不明显(图2)。四、RNA干扰虫株的建立及干扰效果观察1、质粒大量提取参照试剂盒说明进行。2、电转化干扰质粒入弓形虫体内DNA的处理干扰质粒(pSUPER-w;c2a,pSUPER-wx2b，pSUPER-wo:2c，pSUPER-w;cB,pSUPER-wjcC,pSUPER-C)50^g用去离子水稀释成300W体积，力fl100%乙醇600^1和3Qal醋酸钠(pH3.0，3M)，-20°(:过夜，14000rpm离心10min，弃上清，用lml70呢乙醇洗DNA(-20。C至少2h)，14000rpm离心10min,晾干后用100^1电转染buffer悬浮DNA。收获纯化弓形虫速殖子，每次转染用5-10xl(^个速殖子，1600rpm离心6min,弃上清，用5ml电转染缓冲液漂洗速殖子1次，再将速殖子重悬于电转染缓冲液30Q1中，再加入处理过的质粒DNA10Qal，混匀，转入4mm电击杯进行电穿孔。条件1.5千伏，25//F电击一次，时间lms，室温放置15min，然后将虫体转入细胞中培养(含5%小牛血清)，37°C，5%(202培养12h后换成嘌呤霉素选择培养。3、质粒转染虫株的筛选选取不同细胞株HeLa、3T3、HFF、L292，用DMEM完全培基培养至长满培养瓶，接种干扰质粒转染的弓形虫，37°C、5%(202培养12小时，换成不同浓度嘌呤霉素培养基(分别含0.5^g/ml、1^g/ml、1.5^g/ml、2^ag/ml、3^g/ml、4^g/ml质量百分比浓度嘌呤霉素及5%小牛血清)选择培养。在不同时间观察虫子及细胞生长情况，在选择培养后8天，收集虫子，离心收集沉淀，用4^g/ml嘌呤霉素溶解沉淀，(C细胞外选择8-15天，回复到细胞内用^g/ml嘌呤霉素选择培养5天，收集虫子接种昆明小鼠，大量收集弓形虫用于提取RNA进行后续检测及电镜检査。实验结果表明HeLa、3T3、HFF细胞对于嘌呤霉素的耐受不同，在浓度为0.5-1.5^g/ml之间，对干扰质粒转染虫体的选择性杀伤不理想，对照组野生型虫株在选择5天后仍没有明显死亡，细胞死亡也少；在2/zg/ml以上时，野生型对照组的虫体虽然死亡明显，但细胞在培养第3天就大量死亡，不足以维持虫体的生长。L929细胞对嘌呤霉素的耐受力较前几种细胞好，在3^g/ml时可以耐受选择5-8天左右，而细胞死亡速度较慢，在4^g/ml时仍可以耐受4-5天，所以选择L929细胞作为宿主细胞。DMEM完全培养基的小牛血清浓度为5%，以限制细胞生长速度，细胞生长速度过快不利于虫体的筛选。干扰虫株在L929细胞中选择培养8天后，野生型虫株组虫体在显微镜下观察不到，培养上清接种昆明小鼠(盲传)均无发病现象。4、RT-PCR在mRNA水平检测基因wx2的表达1)总RNA的提取取2-3xl()7个弓形虫干扰株(wx2a-i，wx2b-i，w;c2c-i,wxB-i,wxC-i，C-i)速殖子加入lmlTrizol，室温放置5min，再加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15min，室温放置3min,4。C，10000rpm离心15min，吸取水相部分，于水相中加入0.5ml异丙醇，室温放置10min,4'C，10000rpm离心10min，弃上清，留沉淀，用75%的乙醇洗涤沉淀，4'C，lOOOOrpm离心5min，晾干10min,用2QalDEPC处理水55-6(TC溶解沉淀，-7(TC保存备用。2)逆转录采用Ferment公司的逆转录试剂盒进行，在冰浴试管中加入总RNA5/d(5^g)，引物01igo(dT)^1^1,DEPC处理水定容至12W，混匀，瞬时离心5sec，然后7(TC水浴5min，冰浴30sec,瞬时离心5sec，将试管冰浴再加入5xreactionbuffer4/d，RNaseinhibitor(20u/^l)2/zl,dNTPMix(10mmol/L)2/d,37。C水浴5min，再加入AMVRT1^1(20U/^1)，总体积为20W，37'C水浴60min,7(TC加热10min结束反应，-2(TC保存备用。3)PCR扩增以逆转录的cDNA为模板，引物分别为ho:2,正向引物GCGAATTCCTTGCGGAGACACATG;反向引物CCGCTCGAGATTCGTTTAGAGAGG。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>cDNA模板3ul无菌双蒸水__总体积___PCR扩增条件94。C预变性4分钟，94。C变性80秒，53。C/52。C退火80秒，72°C延伸120秒，共35个循环，72"C再延伸8分钟，4"C保存。实验结果表明干扰虫株wx2c-i、wx2b-i均获得一定的基因沉默效果，其中干扰虫株vvx2b-i(B泳道)基因沉默效果尤其理想，经灰度扫描RNA干扰效果达到80%左右(图4)。考虑到有些序列可能在二级结构或在高一级巻曲内被隐藏，部分靶mRNA不能被dsRNA作用，因此，干扰效果能够达到80%是相当成功的。五、干扰虫株毒力及动物攻击实验观察实验分三组，每组各10只昆明小鼠(22±5g)，分别记数500个干扰虫株、阴性虫株C-i、野生型RH株弓形虫速殖子腹腔接种小鼠，观察小鼠死亡时间。在动物感染实验中，vv义2b-i组动物存活时间较阴性C-i组和野生型RH株弓形虫组明显延长，40%小鼠存活期长达21天，平均存活时间为319.1土175.6h;而对照组小鼠在10天内基本全部死亡阴性，其中C-i组和野生型RH株组平均存活时间分别为161.2±11.98h与165.4±6.09h，统计学分析具有显著性差异，P<0.05;发病及死亡时间推迟，说明干扰虫株毒力有所减低(图6、图7)。SEQUENCELISTING〈110〉中南大学〈120〉抑制弓形虫wx2基因表达的siRNA及其应用〈130〉<160〉18〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1515〈212〉廳<213〉Toxoplasmagondii〈400〉1ggcacgagcgagcgtgttgcgaaggcaaaccgataaacagttcttgctctctgcctgttg60gaaaccatgttcttacgatggctgggctgttttcgcgcatcctcgtttgacgtaggttag120tgacatgcttctactccgtgcttcgtcagtgaaaactttgtgttgccgaaacaagcaatg180tgcctctactgggcaacttcctcttaacatgttcaaggtcga^aaaaaaaaaaaaaa犯240ctcgagagatcttttgagcacaagaaggtacacgtttctttcccttctgctcgcctcggc300ggtaaggctggtgcgcatttgttgcacgcgcatctttccacatgaaaaaagagcgcgtat360cgggataacgggagacagagcgaaaataaaagagggcgggtttc3tttgg犯caacgcca420agacattgtttctgcaacatacaccgcgagaaactgctgcaccccgcagtagagattgaa480cttcaccggaatcgagtgtaatccacacgctagaccaggcctaaagacgtttacccagtt540cctaaccgggcgccgcgcttgtccttcgagaaaaaacttcatggaagaaaaaagctcaca600ctttgtaccgacaaacggcaaacattagcgccatacgcaaaaggaaccgcatgcacacag660ctcggtaagctcctcctctcgacggtacctgacctaattcggtgcaccgagcgatagaca720attgcggagacacatgtatatctgtatagaaggtacgcaaaaaggtaggatcacagacgc780gcatgcaaaaacacattcctcacagacgcgatggcgtcctgcacctgcagtgccgcttct840tcattcaccgattcacatgacattttccttcgaccggagagacgaaaacatccgtaaagc900ggtgagtgtcgttctacgtatcgcctctcgtcgccgaagagaagaaattcctccatactc兆Oaggactcttcggatttcctcagtttgcttctgcattccgtgttcccttcttcgtcgtctc1020tcctccctcctccccatttctttgcttcctctctctcctttctaaccgtctctgcggctc1080tccgccgtcgctccgttcctcgactttgcttctcggagtcgagcgcgtcgacccttcctc1140ccggtttctctcttctctggatacgagcgaacgcgagctgaccgcgtcgcaccaccctca1200aaacactcgcacggggtcccatgtgaggtacacacacgaagtatttttcctccggctgca1260cttgaacgtacacagaagtcaggcgacaccgtgagtgcagcaggcccgcggcttggggga1320gctccggcctctctaaacgaatctgaaaatgcgcgaaagaaaagcgacttgcccttcccg1380cacagtccgtggtgtggcgcgagcgacattccacgcctgggatttgcgtcatcacaaaac1440tatcgaaccagcaaatgcacttgtttttcgccaccgcagagacacgtgagtcattgttgc1500tctcgcttctttgcc1515〈210〉2〈211〉984〈212〉腿<213〉Toxoplasmagondii〈400〉2ggcacgaggcgcttttggcttcgttccgatcgtccgcgagtcttcccctcgtttttacac60aatggcggaccggtactctgtgaagctgttgcggcccatggagggcgtccccgtccccga120gcggaccaagaccaagatcgcccgggacgtcaagcttctcaacaagatgaagcaggcgaa180ggaagcccacgcaaagaaggttcatgcacagcgtcatgcgctcaagatgaggacatacaa240gtatgtcagcgagtacagggaaggagagagaigaacctcatcaagctgaagcgcgaggcca300aggcgaagggtggcttctacaaggaacccgaggc犯aggttatcctggccactcgtatca兆Oagggtatcaacaagcttgctcccaagccgaagatgattctccgtctcttccggctgcgcc420agctcc.acaacgcggtcttcatcaaggtcaacaaagccaccattgaaatgttgaaggctg480tccagcccttcatcacttacggctacccgaccctgaaaactatccgccagctcatctaca540agcgtggctacgctaaggtcggcaagcccggcgcccactcgcgcatccgcctgcaagcga600acgacatcgtgtcccagcacttgggcaagtacggcatccacggagtcgaggatttggttc660acgaaatctacacttgcggcccgtacttcaagcaggcgaacaactttttgtggccgttta720agctcaactctccccgcaagggattcaccagcaagcgccacggctacaacgagccccgca780agggagactggggcaacagagaggaaatgatcaacgagttggtccagcgaatgatctaaa840agcagacggcgtccgcgcgggagggtggccgagggccgctgaatctcgtgcacgtggtgt■ctttgttctgtagtgaagcaactgcgcatccaactctcaccgtccaatcgtaacagtgac%0<210>3<211〉60<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉3gatccccacacattcctcacagacgcttcaagagagcgtctgtgaggaatgtgtttttta〈210〉4<211>60<212>腿〈213〉人工序列〈400〉4agcttaaaaaacacattcctcacagacgctctcttgaagcgtctgtgaggaatgtgtggg<210>5〈211〉60<212>DNA9846060〈213>人工序列〈400〉5gatcccccatccgtaaagcggtgagtttcaagagaactcaccgctttacggatgttttta60<210>6〈211〉60〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>6agcttaaaaacatccgtaaagcggtgagttctcttgaaactcaccgctttacggatgggg60〈210〉7<211〉60〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>7gatccccagcggtgagtgtcgttctattcaagagatagaacgacactcaccgctttttta60〈210〉8〈211〉61<212>DNA<213>人工序列〈400〉8tcgagtaaaaaagcggtgagtgtcgttctatctcttgaatagaacgacactcaccgctgg60〈210>9<211>60〈212〉DNA<213>人工序列<400>9gatccccgggtggcttctacaaggaattcaagagattccttgtagaagccaccctt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