专利名称：采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用干细胞组织工程技术构建全层替代皮肤的方法，可以用于替 代活体动物(或人体)皮肤用于毒理学试验领域。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，是外源化学因素(化学品、药品、化妆品等)或物理机 械因素(紫外线、微波等)毒性作用的主要器官。利用动物或人体皮肤进行皮肤毒性 测试是化妆品、药品、食品添加剂及原料、农药、生物制品、化学品健康安全评价的 常规检测项目。传统的皮肤安全性评价实验不仅要求一定数量和高质量的实验动物， 而且试验周期长，成本高，某些反应会给动物造成极大的痛苦。世界各国非常重视实 验动物的福利问题，如上世纪欧洲各国、美国颁布的动物福利法，中国的《实验动物 管理条例》等。随着国际动物保护和动物福利运动的兴起，40多年前国外最先提出了 以〃减少(reduce) 〃、 〃替代(r印lace) 〃和〃优化(refine) 〃为核心内容的"3R原 则"，并在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，不再以动物 模式为基础的毒理学系统已被科学家采用，并被许多国家的政府、欧洲和国际法规所 接受。2002年11月7 H欧洲议会与欧盟理事会在布鲁塞尔达成协议，决定"从2009 年3月11 R起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏实验"，也"不允许 成员国从外国进口和销售进行动物实验的化妆品"。欧盟新化学品法规REACH (化学品 的注册、评估、许可和限制)也提出鼓励动物试验替代方法的开发和应用。采用体外 构建的组织工程皮肤进行毒性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。
组织工程化皮肤分为组织型表皮替代物、真皮替代物和器官型全层皮肤替代物几 类。1975年，Rheinwald和Green采用3T3成纤维细胞作滋养层，体外培养人自体表
皮细胞获得成功(Rheinwald JG， Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinozytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975, 6:331-344)。美国Advanced Tissue Science公司生产的商品名 为Dermagraft的人工真皮以高分子材料PGA、 PGL网为基础，植入新生儿成纤维细胞 后培养成人工真皮替代物，结合自体表皮膜片用于临床移植(HarisbroughJF， Dore C， Hansbrough WB. Clinical trails of a living dermal tissue replacement placed beneath mesh， split-thickness skin grafts on excised burn wounds. J Burn Care Rehabil， 1992， 13:519-529)。美国Organogenesis公司生产的Testskin人工皮肤 模型，其表皮层由人角质细胞分化形成，真皮层由人成纤维细胞种植于I型牛胶原支 架构成 (Rodriguez H， 0'Connell C, Barker PE, et al. Measurement of DNA biomarkers for the safety of tissue-engineered medical products, using artificial skin as a model. Tissue Eng，2004， 10 (9—10):1332-1345)。 2001年2 月6闩伍津津等人申请了有关专利(中国专利申请号01107099. 4)，该发明包括胶原 凝胶的制备和细胞的三维培养等。2002年9月2日金岩等人申请了有关专利(中国专 利申请号02139398. 2)，该发明包括胶原凝胶的制备和全层皮肤的培养等内容。但这 几种皮肤替代物主要用于烧伤和溃疡、创伤等皮肤缺损病人的临床治疗，还不能替代 活体动物皮肤成熟用于皮肤毒性检验。作为组织工程皮肤也存在以下缺点人工表皮 由于不含真皮层，还不是真正意义上的人工皮肤；现有的含双层结构的人工皮肤组织 构造上还有待改进；培养周期长，皮肤功能在体外维持时间短，不适用于慢性毒性试 验。因此，用于毒性检验的皮肤不仅要求形态和组织结构与人体皮肤接近，而且要求 生理功能和活性与活体皮肤相似，构建的皮肤重复性好，批间差异小，便于毒性效应 的统计学分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，就是提供一种利用诱导分化的表皮干细胞或原代分 离的表皮干细胞，采用筏式培养技术，制备毒性检验用全层皮肤的方法，该方法培养 周期短，皮肤含表皮与真皮双层结构，组织和结构与正常皮肤相似，功能和活性在体 外维持时间较长，能满足毒性检验领域的需要。
实现本发明依次包括以下几个步骤 1、高分子真皮支架的制备与修饰
1) PHBV支架制备:
(a) 将3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物(poly[3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvalericacid],PHBV)溶于氯仿中制成浓度为120-130g/L的溶液，然后每 升溶液加入930-950g的氯化钠(NaCI)为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；
(b) 将浓浆液倒入孔径为0.8 1.0cm圆形金属模具中，待氯仿溶剂挥发约70-80% 后，从模具中取出成形支架，再置于通风橱内室温48-54小时晾干，25'C-35i:温度下， 1000 1300Pa真空范围内千燥2小时 3小时除去残余溶剂；
(c) 将成形支架浸入去离子水中，每隔6-8小时换水1次，48-52小时内换水6-8 次直至将致孔剂滤除干净，室温晾干，25'C-35"C温度下，1000 1300Pa真空范围内干 燥24-48小时制成PHBV多孔三维支架；
(d) 将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡l-2h，用波长254nm、 36W的紫外 线正反面各照射1.5-2h，无菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，无菌条件下自然晾干；
2) 制备胶原-甲壳糖-硫酸软骨素-透明质酸修饰液(复合胶原修饰液) 按质量比例为14 16: 2 4: 1: 1制备原料I型胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软
骨素、透明质酸A;在36W紫外灯照射下，用0.1%乙酸搅拌溶解I型胶原然后加入 甲壳糖，待甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的6-透明质酸 和硫酸软骨素A溶液，继续搅拌溶解3小时；使胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、
透明质酸A最终浓度分别为7-8mg/ml、 l-2mg/ml、 0.5mg/ml和0.5mg/ml;然后在冰 浴条件下加入0.5ml 10XDMEM培养液，用lmol/L的NaOH快速调pH至7.2-7.3; 3)修饰PHBV支架
将2)歩制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的PHBV多孔三维支架表 面，室温条件下静置20-30min，以此面为真皮面，在PHBV多孔三维支架的另一面, 用浓度为0. 4。/。的人源IV型胶原蛋白浸泡20-30min，此面为表皮面； 2、制备表皮干细胞
采用两种途径获得表皮干细胞(ESC)，即从人胚胎干细胞定向诱导分化制备ESC 和从人皮肤原代分离培养制备ESC。
1) 从胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞
先制备羊膜片无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜， 用含100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中； 然后在无菌环境下，按6孔培养板或12孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半 圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入无白血 病抑制因子(LIF)的胚胎干细胞培养液，收集羊膜分泌液备用。
从商业途径购买人胚胎干细胞(hES)，传代培养48小时后，以终浓度为0.125% 的胰蛋白酶+O.OP/。EDTA消化液消化后按5 X 104个细胞/cm2密度接种于铺布有羊膜 的6孔或12孔培养板中，用无人LIF的ES细胞培养液培养；每隔l-2天半量换液； 经过4天诱导分化培养后，收集粘附在羊膜上皮表面的表皮干细胞(ESC);
2) 从人皮肤原代分离培养制备表皮干细胞
将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100 U/mL青霉素、100 ug/mL链霉素的 0. 1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织， 将包皮剪切成约2. OmmX3. Omm的皮片；用质量浓度0. 25M的裂解酶(Dispases)分离表
皮和真皮，然后用生理盐水或D-Hanks液清洗3-5次；
表皮部分用质量浓度0. 25%胰酶+0. 02%EDTA (按1 : 1比例混合)，4'C消化2±0. 5 小时，消化成单细胞悬液，然后接种于铺布有质量浓度为0. 4y。的IV型胶原包被的培养 皿中，置5°/。0)2、 37T:培养箱内快速黏附10-15min后，弃去未粘附细胞。将粘附细 胞吹打脱离培养壁，按lX10"个/cm2置于第2步1)制备的铺布有人羊膜的培养皿 上继续培养，培养基为无LIF的ES完全培养基；或将细胞接种于用5ug/ml丝裂霉 素C处理的小鼠3T3成纤维细胞滋养层上继续培养，所用培养基为全层皮肤专用培养 基。
采用上述两种方法制备的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19 (CK19)单克隆抗体和 鼠抗人e 1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和
ei整合素阳性。
3、 制备原代人成纤维细胞取外科环切手术获取的包皮组织，以第2歩2)所述 方法分离皮肤真皮部分，以0. 125%胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后 放入含l(W新生牛血清高糖DMEM (H-DMEM)培养基培养，每24-36小时半量换液。培 养3 4天，待细胞融合约80%时，县酶消化收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤 维细胞用于全层皮肤制备。
4、 全层皮肤专用培养基制备
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，经0.22ym微孔小组膜过滤后，与角质细胞 无血清培养基(KSM)与按体积比1. 5~2:8~8.5混合，再添加关键促生长因子5X 10—1() M 霍乱毒素、10rig/mL人重组表皮生长因子(EGF)、 5昭/mL胰岛素、0.5吗/mL氢化可 的松、30 jug/mL庆大霉素、15ng/mL两性霉素、30吗/mL牛垂体提取物、5 y g/ml 转铁蛋白、1X10 "o M甲状腺素T3、 24.3 ug/mL腺嘌呤等活性成分，培养基中钙终 浓度为0.10 mM;
5、 全层皮肤制备
将第1步所得的PHBV多孔三维支架置于6孔或12孔培养板上，经复合胶原修 饰的真皮面向上，以最小容量100-200 ii 1接种以人KSM培养基悬浮的原代培养人皮 肤成纤维细胞，细胞密度为lX105cell/cm2—2X105Cell/Cm2，待4-8小时细胞粘附 后，加1.5-2ml足量角质细胞无血清培养基浸没培养，每36-48小时半量换液，培养 5-7天，完成全层皮肤真皮部分构建；
将P朋V支架反转，在表皮面接种第2步)或2)制备的人表皮干细胞，接种细胞 密度为lX105Cell/Cm2-2X105cell/Cm2，用第4歩制备的全层皮肤专用培养基代替含 10%新生牛血清的H-DMEM培养基，浸没培养72-96小时后，采用气-液界面培养，每 48-60小时半量换液，10-14天后完成全层皮肤制备；
6、 检测
同一批以12孔培养板制备的组织工程皮肤中，取其中一块皮肤固定于以PBS配 制的4%多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5um—6iim，苏木素-伊 红(H.E)染色；显微镜下观察人工皮肤的组织结构去除皮肤结构不完整、表皮分层 不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者， 即得表皮层含基底层、棘层、颗粒层和角化层等分化结构；真皮层含大量成纤维细胞， 与WIBV支架融合性好，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显的组织工程皮肤产 品，可用于皮肤毒性检测试验。
所述的用质量浓度0. 25。/。裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，是将表皮和真皮在 37'C的温度下经质量浓度0. 25°/。裂解酶消化3±0. 5小时；或在4。C的温度下经质量浓 度0. 25%裂解酶消化12-18小时。
所述的胚胎干细胞培养液为一种常规方法，其采用80。/。DMEM基础培养液，然 后加入20%胎牛血清，lmML-谷氨酰胺、0.1 mM 3-疏基乙醇，1000U/ml人白血
病抑制因子(LIF)， 100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
所述的人胚胎干细胞(ES细胞)为一种来源于的人胚胎内细胞团或原始生殖嵴的 全能干细胞，可从商业途径购买。
所述的小鼠3T3成纤维细胞为一种来源于SWISS小鼠的成纤维细胞株，可从商业 途径购买。
所述的胶原为商品，主要成份为来源于牛肌腱或猪皮或鼠尾的I型胶原粉木。 所述的角质细胞无血清培养基KSM (KeratinocyteSer咖-Free Medium )为商业 化购自国外公司，如美国BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或 GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium)。
有益效果本发明用表皮千细胞培养组织工程全层皮肤，细胞分裂增殖能力强， 皮肤的形态和组织结构完整、功能和活性体外维持时间较长，能满足亚毒性检验领域 的需要；人工合成的支架材料标准化程度高、批间差异小；皮肤构建过程中全程采用 无血清培养基，明确了组织构建的影响因素，为以后用于毒性试验减少干扰奠定了基 础。由此制备的组织工程全层皮肤重复性好、稳定性强。通过本发明制备的全层皮肤 在解剖和组织结构上更接近于天然皮肤，其应用于毒性检验的方式和检测指标更符合 皮肤毒性作用的实际情况，可以代替整体动物，直接应用于化学品、化妆品、药品、 农药等健康相关产品的皮肤毒性试验。
图1为筏式培养毒性检验用组织工程全层皮肤的模式图2 PHBV与表皮干细胞构建组织工程替代皮肤的组织结构图。HE染色，生物显 微镜观察，放大倍数200倍。
具体实施例方式
实施例1 依次包括以下几个步骤 1、高分子真皮支架的制备与修饰
1) PHBV支架的制备
(a) 将适量的PHBV粉末溶于氯仿中制成浓度为120-130g/L的溶液，然后每升 溶液加入940g的氯化钠(NaCI)为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；
(b) 将浓浆液倒入孔径为0.8 1.0cm圆形金属模具中，待约80%氯仿溶剂挥发 后，从模具中取出成形支架，再置于通风橱内室温48小时晾干，室温下真空干燥除 去残余溶剂；
(c) 将成形支架浸入去离子水中，每隔6小时换水1次，48小时内换水8次直 至将致孔剂滤除干净，室温晾干后真空干燥24小时制成PHBV多孔三维支架，制成 的支架的孔隙率>90%，孔径大小为80-200um;
(d) 将支架以无水乙醇浸泡l-2h，用波长254nm、 36W的紫外线正反面各照射 1.5-2h，无菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，无菌条件下自然晾千；
2) 制备复合胶原修饰液(胶原为商品，主要成份为来源于牛肌腱、猪皮或鼠尾 的I型胶原粉末)
在35W紫外灯照射下，用0.1%乙酸搅拌溶解鼠尾胶原然后加入脱乙酰甲壳糖， 待脱乙酰甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的透明质酸A 和6-硫酸软骨素溶液，继续搅拌溶解3小时；鼠尾胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨 素、透明质酸A净重比例为15: 3: 1: 1，四种材料的最终浓度分别为7.5mg/ml、 1.5mg/ml、 0.5mg/ml和0.5mg/ml;然后在冰浴条件下加入0.5ml 10XDMEM培养液， 用lmol/L的NaOH溶液快速调pH至7.2;
3) 修饰PHBV支架
将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)歩制备的支架表面，室温静置
20-30min，以此面为真皮面，在支架另一面，用浓度为0. 4。/。的人源IV型胶原蛋白浸泡 20-30min，此面为表皮面。
2、 从人胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞
1) 制备羊膜片无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜， 用含100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中； 然后在无菌环境下，按6孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再 将羊膜上皮面向上铺布于6孔板的孔底；最后加入无白血病抑制因子(LIF)的胚胎 干细胞培养液，收集羊膜分泌液备用，铺布好的羊膜片3天内可接种细胞；
其中的人胚胎干细胞培养液为一种常规方法，采用80^/。DMEM基础培养液，然 后加入20%胎牛血清，lmML-谷氨酰胺、0.1 mM 3-疏基乙醇，1000U/ml人白血 病抑制因子(LIF)， 100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。人胚胎干细胞(ES细胞)为 一种来源于胚胎内细胞团或原始生殖嵴的全能干细胞，从商业途径购买。
2) 胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞取传代培养48小时的ES细胞， 以终浓度为0.125。/。胰蛋白酶+0.0in/。EDTA消化液消化后按5 X 10^田胞/ml密度接种于 己铺布好羊膜的6孔培养板中，用无LIF的ES细胞培养液培养；每隔1-2天半量换 液；经过4天诱导分化培养后，收集粘附在羊膜上皮表面表皮干细胞。
将获得的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19 (cKi9)单克隆抗体和鼠抗人e 1整合素
单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和P 1整合素阳性。
3、 制备原代成纤维细胞将手术环切下的幼儿新鲜包皮用含青霉素、链霉素的 0. 1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗；然后在无菌条件下去除皮下组织，将包皮剪切成 约1. 0mmX2. Omm的皮片；用质量浓度0. 25%裂解酶(Dispases) 37。C下消化3小时分 离表皮和真皮。真皮部分以O. 125%胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，放入
含10%新生牛血清高糖DMEM (H-DMEM)培养基培养，每24-36小时半量换液。培养3~4 天，待细胞融合约80%时，县酶消化收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞 用于全层皮肤制备。
4、 组织工程全层皮肤专用培养基制备
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，经0.22um微孔小组膜过滤后，与角质细胞 无血清培养基(KSM)与按体积比1. 5~2:8~8.5混合，再添加关键促生长因子5 X l(r1Q M 霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子(EGF)、 5吗/mL胰岛素、0.5吗/mL氢化可 的松、30吗/mL庆大霉素、15 ng/mL两性霉素、30叱/mL牛垂体提取物、5 y g/ml 转铁蛋白、1X10 —1Q M甲状腺素T3、 24.3 ug/raL腺嘌呤等活性成分。培养基中钙终 浓度为0.10 mM。
角质细胞无血清培养基(KSM)为商业化购自GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium);
5、 组织工程全层皮肤制备
将第1歩所得的PHBV多孔三维支架置于12孔培养板上，经复合胶原修饰的真 皮面向上，以最小容量100-200n 1接种第3步以DMEM培养基悬浮的原代培养人皮肤 成纤维细胞，细胞密度为lX105cell/Crn2，待4小时细胞粘附后，加2ml足量角质细 胞无血清培养基浸没培养，每36-48小时半量换液，培养5-7天，完成组织工程皮肤 真皮部分构建；
将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步制备的来源于人胚胎干细胞的人表皮千 细胞，接种细胞密度为2X105cell/cm2，用第4步制备的组织工程全层皮肤专用培养 基浸没培养96小时，采用气-液界面培养，每48-60小时半量换液，10-14天后完成 组织工程全层皮肤产品制备；
6、 检测
同一批以12孔培养板制备的组织工程皮肤中，取其中一块皮肤固定于以PBS配 制的4%多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5um—6um，苏木素-伊 红(H.E)染色；显微镜下观察人工皮肤的组织结构去除皮肤结构不完整、表皮分层 不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者， 即得表皮层含基底层、棘层、颗粒层和角化层等分化结构；真皮层含大量成纤维细胞， 与PHBV支架融合性好，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显的组织工程皮肤产 品，可用于皮肤毒性检测试验。
所得的人工皮肤产品用于皮肤刺激性检测将化妆品、化学品等固体或液体受试 物直接放置于人工皮肤表面，液体用量为10yl，固体用量为(10士2)mg并涂布均匀， 作用(15±1)分钟后，以无菌PBS冲洗去除受试物再孵育(42±1)小时。从12孔 细胞培养板中取下组织工程替代皮肤，部分组织固定于多聚甲醛，冊染色观察组织病 理学形态结构；部分组织采用MTT法分析细胞活性，或用酶联免疫吸附法(ELISA) 检测比-2等毒性效应指标。
所述的MTT法为一种检验细胞活性的常规方法，所述的ELISA检测法为一种检测 细胞因子的常规方法。 实施例2
1、高分子真皮支架的制备与修饰
1) PHBV支架的制备:
(a) 将适量的PHBV粉末溶于氯仿中制成浓度为130g/L的溶液，然后每升溶液 加入930g的氯化钠(NaCI)为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；
(b) 将浓浆液倒入直径为1.0cm圆形金属模具中0.15-0.2ml，待溶剂挥发后，从 模具中取出成形支架，置于通风橱内室温54小时晾干，真空干燥除去残余溶剂；
(c) 将成形支架浸入去离子水中，每隔7小时换水1次，49小时内换水7次直
至将致孔剂滤除干净，室温晾干后真空干燥24小时制成PHBV多孔三维支架；
(d)将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡2h，用波长254 nm、 36W的紫外 线正反面各照射2h，无菌PBS漂洗4次，每次20min，无菌条件下自然晾干；
2) 制备复合胶原修饰液
在紫外灯照射下，用0.1%乙酸搅拌溶解鼠尾胶原然后加入脱乙酰甲壳糖，待脱 乙酰甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的透明质酸A和6 硫酸软骨素溶液，继续搅拌溶解3小时；鼠尾胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、 透明质酸A净重比例为14: 4: 1: 1，最终浓度分别为7mg/ml、 2mg/ml、 0.5mg/ml 和0.5mg/ml;然后在冰浴条件下加入0.5ml 10XDMEM培养液混匀用lmol/L的NaOH 快速调pH至7.3;
3) 修饰PHBV支架
将2)歩制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)歩制备的支架表面，室温静置 30min，以此面为真皮面，在支架另一面，用浓度为0.4M的人源IV型胶原蛋白浸泡 30min，此面为表皮面。
2、人皮肤原代分离制备表皮干细胞
1) 制备羊膜片无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜， 用含双抗的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无菌环境下，按12 孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于 12孔板的孔底；最后加入角质细胞无血清培养基(SFM)，收集羊膜分泌液备用，铺 布好的羊膜片3天内可接种细胞；
2) 人皮肤原代分离制备表皮干细胞将手术环切下的幼儿新鲜包皮用含青霉素、 链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗；然后在无菌条件下去除皮下组织，将包 皮剪切成约2. 0mraX2. 5咖的皮片；用质量浓度0. 25%裂解酶(Dispases) 4。C消化过夜 (12小时)分离表皮和真皮，生理盐水清洗3次。表皮部分用质量浓度0.25%胰酶 +0.01%EDTA (按l:l比例混合)，4'C消化2小时，消化成单细胞悬液，然后接种于 铺布有质量浓度为0.4y。的IV型胶原包被的培养皿中，置5% C02 、 37'C培养箱内快速 黏附15min后，弃去未粘附细胞，将粘附细胞吹打脱离培养壁，按lXl(^个/cr/置 于第2歩1)制备的铺布有人羊膜的培养皿上继续培养，所用培养基为角质细胞无血 清培养基。将获得的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19 (CK19)单克隆抗体和鼠抗人ei 整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和P 1整合素 阳性。
角质细胞无血清培养基(KSM)为商业化购自GIBCO公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium);
3、 制备原代人成纤维细胞取第2步2)分离的皮肤真皮部分以0.125%胰酶消 化经获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后放入含10。/。新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM) 培养基培养，每24-36小时半量换液；培养3 4天，待细胞融合约80%时，县酶消化 收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备。
4、 组织工程全层皮肤专用培养基制备
取第2步1)收集的人羊膜分泌液，经0.22nm微孔小组膜过滤后，与角质细胞 无血清培养基(KSM)与按体积比1. 5~2:8 8.5混合，再添加关键促生长因子5X 10—1QM 霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子(EGF)、 5pg/mL胰岛素、0.5吗/mL氢化可 的松、30吗/mL庆大霉素、15 ng/mL两性霉素、30吗/mL牛垂体提取物、5 w g/ml 转铁蛋白、1X10 —1Q M甲状腺素T3、 24.3 ug/mL腺嘌呤等活性成分。培养基中钙终 浓度为0.10 mM。
5、 组织工程全层皮肤制备
将第1歩所得的PHBV多孔三维支架置于12孔培养板上，经复合胶原修饰的真
皮面向上，以最小容量100-200 u 1接种第3培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细 胞，细胞密度为lX105cell/cm2，待4小时细胞粘附后，加2ml足量角质细胞无血清 培养基浸没培养，每48小时半量换液，培养5天，完成组织工程皮肤真皮部分构建;
将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步制备的来源于人皮肤组织和原代人表皮 干细胞，接种细胞密度为2X10^ell/cm2，用第4步制备的组织工程全层皮肤专用培 养基浸没培养80小时，然后采用气-液界面培养，每48小时半量换液，12天后完成 人组织工程皮肤产品制备；
6、检测
同实施例1。
实施例3
1、高分子真皮支架的制备与修饰
1) PHBV支架的制备
(a) 将适量的PHBV粉末溶于氯仿中制成浓度为130g/L的溶液，然后每升溶液 加入940g的氯化钠(NaCI)为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；
(b) 将浓浆液倒入直径为1.0^11圆形金属模具中0.15-0.21111,待溶剂挥发后，从 模具中取出成形支架，置于通风橱内室温54小时晾干，真空干燥除去残余溶剂；
(c) 将成形支架浸入去离子水中，每隔8小时换水1次，56小时内换水7次直 至将致孔剂滤除干净，室温晾干后真空干燥24小时制成PHBV多孔三维支架；
(d) 将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡2h，用波长254 nm、 36W的紫外 线正反面各照射2h，无菌PBS漂洗4次，每次20min，无菌条件下自然晾干；
2) 制备复合胶原修饰液
在紫外灯照射下，用0.1%乙酸搅拌溶解鼠尾胶原然后加入脱乙酰甲壳糖，待脱 乙酰甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的透明质酸A和6
硫酸软骨素溶液，继续搅拌溶解3小时；鼠尾胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、 透明质酸A净重比例为16: 2: 1: 1，最终浓度分别为8mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml 和0.5mg/ml;然后在冰浴条件下加入0.5ml 10XDMEM培养液，用lmoil/L的NaOH 快速调pH至7.3;
3)修饰PHBV支架
将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的支架表面，室温静置 30min，以此面为真皮面，在支架另一面，用浓度为0.4y。的人源IV型胶原蛋白浸泡 30min,此面为表皮面。
2、人皮肤原代分离制备表皮干细胞
1) 制备羊膜片无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜， 用含双抗的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无菌环境下，按12 孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于 12孔板的孔底；最后加入角质细胞无血清培养基(SFM)，收集羊膜分泌液备用，铺 布好的羊膜片3天内可接种细胞；
2) 人皮肤原代分离制备表皮干细胞将手术环切下的幼儿新鲜包皮用含青霉素、
链霉素的O. 1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗；然后在无菌条件下去除皮下组织，将包 皮剪切成约1. 5mmX2. 5mm的皮片；用质量浓度0. 25%裂解酶(Dispases) 4。C消化过夜 (12小时)分离表皮和真皮，生理盐水清洗3次。表皮部分用质量浓度0.25%胰酶 +0.01%EDTA (按l:l比例混合)，4'C消化2小时，消化成单细胞悬液，然后接种于 包被IV胶原的培养皿中，置5%0)2 、 37'C培养箱内快速黏附15min后，弃去未粘附 细胞，将粘附细胞吹打脱离培养壁，接种于用5iig/inl丝裂霉素C处理的小鼠3T3成 细胞滋养层上。所用培养基为角质细胞无血清培养基。将获得的表皮干细胞以鼠抗人 角蛋白19(CK19)单克隆抗体和鼠抗人fU整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞
化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和0 1整合素阳性。
角质细胞无血清培养基(KSM)为商业化购自美国BioWhittaker公司的 KBM(Keratinocyte Basal Medium)。
3、 制备原代人成纤维细胞取第2步2)分离的皮肤真皮部分以0. 125%胰酶消 化经获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后放入含10%新生牛血清高糖DMEM(H-DMEM) 培养基培养，每24-36小时半量换液；培养3 4天，待细胞融合约80%时，县酶消化 收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备。
4、 组织工程全层皮肤专用培养基制备
取第2歩1)收集的人羊膜分泌液，经0.22um微孔小组膜过滤后，与角质细胞 无血清培养基(KSM)与按体积比1. 5~2:8~8.5混合，再添加关键促生长因子5X 10_1Q M 霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子(EGF)、 5吗/mL胰岛素、0.5吗/mL氢化可 的松、30吗/mL庆大霉素、15ng/mL两性霉素、30吗/mL牛垂体提取物、5 y g/ml转 铁蛋白、1X10^M甲状腺素T3、 24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分。培养基中钙终浓度 为0.10 mM。
5、 组织工程全层皮肤制备
将第1歩所得的PHBV多孔三维支架置于12孔培养板上，经复合胶原修饰的真 皮面向上，以最小容量100-200y 1接种第3培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细 胞，细胞密度为lX105cell/Cm2，待4小时细胞粘附后，加2ml角质细胞无血清培养 基浸没培养，每48小时半量换液，培养5天，完成组织工程皮肤真皮部分构建；
将RiBV支架反转，在表皮面接种第2步制备的来源于人皮肤组织和原代人表皮 干细胞，接种细胞密度为2X10Scell/cffl2，用第4步制备的组织工程全层皮肤专用培 养基浸没培养96小时，采用气-液界面培养，每48小时半量换液，12天后完成人组 织工程皮肤产品制备；6、检测 同实施例1。
权利要求
1、一种采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，依次包括以下的步骤I、高分子真皮支架的制备与修饰1)PHBV支架制备(a)将3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物PHBV溶于氯仿中制成浓度为120-130g/L的溶液，然后每升溶液加入930-950g的氯化钠为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；(b)将浓浆液倒入孔径为0.8～1.0cm圆形金属模具中，待氯仿溶剂挥发约70-80％后，从模具中取出成形支架，再置于通风橱内室温48-54小时晾干，25℃-35℃温度下，1000～1300Pa真空范围内干燥2小时～3小时除去残余溶剂；(c)将成形支架浸入去离子水中，每隔6-8小时换水1次，48-52小时内换水6-8次直至将致孔剂滤除干净，室温晾干，25℃-35℃温度下，1000～1300Pa真空范围内干燥24-48小时制成PHBV多孔三维支架；(d)将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡1-2h，用波长254nm、36W的紫外线正反面各照射1.5-2h，无菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，无菌条件下自然晾干；2)制备胶原-甲壳糖-硫酸软骨素-透明质酸修饰液按质量比例为14～16∶2～4∶1∶1制备原料I型胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A；在36W紫外灯照射下，用0.1％乙酸搅拌溶解I型胶原然后加入甲壳糖，待甲壳素完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的6-透明质酸和硫酸软骨素A溶液，继续搅拌溶解3小时；使胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A最终浓度分别为7-8mg/ml、1-2mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml；然后在冰浴条件下加入0.5ml 10×DMEM培养液，用1mol/L的NaOH快速调pH至7.2-7.3；3)修饰PHBV支架将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的PHBV多孔三维支架表面，室温条件下静置20-30min，以此面为真皮面，在PHBV多孔三维支架的另一面，用浓度为0.4％的人源IV型胶原蛋白浸泡20-30min，此面为表皮面；II、制备表皮干细胞采用两种途径获得表皮干细胞(ESC)1)从胚胎干细胞定向诱导分化制备表皮干细胞先制备羊膜片无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无菌环境下，按6孔培养板或12孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再将羊膜上皮面向上铺布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入无白血病抑制因子LIF的胚胎干细胞培养液，收集羊膜分泌液备用；从商业途径购买人胚胎干细胞hES，传代培养48小时后，以终浓度为0.125％的胰蛋白酶+0.01％EDTA消化液消化后按5×104个细胞/cm2密度接种于铺布有羊膜的6孔或12孔培养板中，用无人LIF的ES细胞培养液培养；每隔1-2天半量换液；经过4天诱导分化培养后，收集粘附在羊膜上皮表面的表皮干细胞ESC；2)从人皮肤原代分离培养制备表皮干细胞将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织，将包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；用质量浓度0.25％的裂解酶Dispases分离表皮和真皮，然后用生理盐水或D-Hanks液清洗3-5次；表皮部分用质量浓度0.25％胰酶+0.02％EDTA按1∶1比例混合，4℃消化2±0.5小时，消化成单细胞悬液，然后接种于铺布有质量浓度为0.4％的IV型胶原包被的培养皿中，置5％CO2、37℃培养箱内快速黏附10-15min后，弃去未粘附细胞；将粘附细胞吹打脱离培养壁，按1×104个/cm2置于第2步1)制备的铺布有人羊膜的培养皿上继续培养，培养基为无LIF的ES完全培养基；或将细胞接种于用5μg/ml丝裂霉素C处理的小鼠3T3成纤维细胞滋养层上继续培养，所用培养基为全层皮肤专用培养基；将上述两种方法之一制备的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19 CK19单克隆抗体和鼠抗人β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳性；III、制备原代人成纤维细胞取外科环切手术获取的包皮组织，以第2步2)所述方法分离皮肤真皮部分，以0.125％胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后放入含10％新生牛血清高糖DMEM培养基培养，每24-36小时半量换液，培养3～4天，待细胞融合约80％时，县酶消化收集细胞，制备以KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备；IV、全层皮肤专用培养基制备取第2步1)收集的人羊膜分泌液，经0.22μm微孔小组膜过滤后，与角质细胞无血清培养基KSM与按体积比1.5～2∶8～8.5混合，再添加关键促生长因子5×10-10M霍乱毒素、10ng/mL人重组表皮生长因子EGF、5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、30μg/mL庆大霉素、15ng/mL两性霉素、30μg/mL牛垂体提取物、5μg/ml转铁蛋白、1×10-10M甲状腺素T3、24.3ug/mL腺嘌呤等活性成分，培养基中钙终浓度为0.10mM；V、全层皮肤制备将第1步所得的PHBV多孔三维支架置于6孔或12孔培养板上，经复合胶原修饰的真皮面向上，以最小容量100-200μl接种以人KSM培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细胞，细胞密度为1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，待4-8小时细胞粘附后，加1.5-2ml足量角质细胞无血清培养基浸没培养，每36-48小时半量换液，培养5-7天，完成全层皮肤真皮部分构建；将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步1)或2)制备的人表皮干细胞，接种细胞密度为1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，用第4步制备的全层皮肤专用培养基代替含10％新生牛血清的H-DMEM培养基，浸没培养72-96小时后，采用气-液界面培养，每48-60小时半量换液，10-14天后完成全层皮肤制备；VI、检测同一批以12孔培养板制备的组织工程皮肷中，取其中一块皮肤固定于以PBS配制的4％多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5μm-6μm，苏木素-伊红H.E染色；显微镜下观察人工皮肤的组织结构去除皮肤结构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者，即得表皮层含基底层、棘层、颗粒层和角化层等分化结构；真皮层含大量成纤维细胞，与PHBV支架融合性好，胶原纤维有序列排列；表皮真皮分界明显的组织工程皮肤产品，可用于皮肤毒性检测试验。
2、 根据权利要求1所述的采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，其特 征在于所述的用质量浓度0. 25%裂解酶Dispases分离表皮和真皮，是将表皮和真皮在37 。C的温度下经质量浓度0. 25%裂解酶消化3±0. 5小时；或是将表皮和真皮在4'C的温度下经 质量浓度0. 25%裂解酶消化12-18小时。
3、 根据权利要求2所述的采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，其特 征在于所述的胚胎干细胞培养液为采用80% DMEM基础培养液，然后加入20%胎牛 血清、lmML-谷氨酰胺、0.1 mM e-疏基乙醇、1000U/ml白血病抑制因子LIF 100U/ml青 霉素及100ug/ml链霉素。
4、 根据权利要求3所述的采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，其特 征在于所述的胚胎干细胞ES为一种来源于的胚胎内细胞团或原始生殖嵴的全能干细胞。
5、 根据权利要求4所述的采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，其特 征在于所述的小鼠3T3成纤维细胞为一种来源于SWISS小鼠的成纤维细胞株，可从商业途 径购买。
6、 根据权利要求5所述的采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，其特征在于所述的胶原为商品，主要成份为来源于牛肌腱或猪皮或鼠尾的I型胶原粉末。
7、 根据权利要求6所述的采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，其特 征在于所述的角质细胞无血清培养基SFM-KC可采用KBM或DK-SFM。
全文摘要
一种采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法1.高分子真皮支架制备与修饰，2.从胚胎干细胞和皮肤组织制备表皮干细胞，3.制备原代人成纤维细胞，4.制备全层皮肤专用培养基，5.构建全层皮肤。本全层皮肤利用表皮干细胞分化增殖能力强的特点，构建的皮肤形态、组织结构和功能活性能满足亚慢性毒性检验的需要；人工合成的支架材料标准化程度高、批间差异小；皮肤构建全程采用无血清培养基，减少了影响组织构建的因素，为以后用于毒性试验奠定了基础。通过本发明制备的全层皮肤更接近于天然皮肤，其应用于毒性检验的方式和检测指标更符合实际情况，可以代替整体动物，直接应用于化学品、化妆品、药品等健康相关产品的皮肤毒性试验。
文档编号C12N5/08GK101352586SQ20081003038
公开日2009年1月28日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者红 焦, 瑶 秦, 程树军, 黄亚东 申请人:程树军;广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心