一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用

一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明公开了一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。这对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)由一对DNA识别蛋白分别与一个Fok1核酸酶单体融合得到，可以特异性地识别人Pax6基因exon6上的两个相邻位点并进行酶切。将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞时，其能对宿主细胞Pax6基因的exon6位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，从而实现对人Pax6基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。
【专利说明】
一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码 基因与应用。
【背景技术】
[0002] Pax6基因在动物中枢神经系统、眼睛、鼻子、胰腺和垂体发育过程中起重要作用。 Pax6基因突变导致多种疾病和症状，如人类无虹膜、虹膜发育不全、角膜炎、瞳孔异位、眼球 震颤、神经发育紊乱、视神经发育不良等，鼠小眼畸形，果蝇眼睛缺失等。Pax6基因是一种高 度保守的转录因子，位于11 ql 3-14，其编码蛋白Pax6从N-末端到C-末端由DNA结合域和转录 激活域组成。
[0003] 按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的 基因组上特异地删除或加入我们需要的序列，这样可以构建出各种动物模型用于生物学基 础研究和疾病机理研究。
[0004] 人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打 靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换，其打靶效率非常低，通常只有10-6- 10-8,这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用，而在其他模式动物及大型哺乳动物中都 因效率太低而得不到广泛应用。
[0005] 近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般由序列 特异的核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是首先 由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域，然后非特异性核酸内切酶切断双链 DNA从而造成DNA双链断裂(double-strand break，DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修复可 以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN) 是现在研究最清楚也是应用最广的序列特异的核酸酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两 段相隔5_7bp的DNA序列，并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白Fokl的两个单聚体定 位到了 一起，DNA切割蛋白形成双聚体时可以切断该位置的双链DNA，从而造成DSB。ZFN的出 现使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步，然而，ZFN技术还存在靶向不确定性、效率低、 拖把率高等问题，研究者很难自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶 仍然是制约ZFN广泛应用的瓶颈。而商业购买高效特异的锌指核酸酶又价格昂贵(20万人民 币/基因），一般研究者或商业公司根本无法承受这笔费用2009年两个研究组发现植物病原 体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子(transcript ion activator-like effector，TALE)表现出DNA结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单 化的特点，为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。
[0006] TALE与Fokl融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN) dTALEN的打革巴原理与ZFN相同，只是识别特 异DNA的蛋白不同。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联"蛋白模块"和两侧的N-末端及C- 末端序列组成。每个"蛋白模块"包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点， 被称作重复可变的di-residues (RVDs)位点。然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联 体碱基，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。
[0007] Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行 了基因组靶向修饰相关研究，两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》（Nature Biotechnology)杂志上。
[0008] Edward Rebar领导的研究小组将带有不同C-末端TALE的截短片段连接到核酸酶 FokI的催化结构域上。当研究人员将构建的TALENs靶向内源性的人类NTF3和CCR5基因时， 证实TALENs能够特异性地对这些基因片段进行剪切。哈佛大学研究小组开发了一种基于分 层连接的策略来构建包含12个重复模块的TALEs。他们在保留RVDs的基础上减少了每个模 块的DNA序列，同时将剩余序列的重复性降到最低。进而通过12重PCR获得了带有特异性连 接序列的单体，并将其克隆至包含TALEN-末端和C-末端序列的骨架载体中。为了构建TALE 转录因子，研究人员又将TALE融合到一个转录因子的激活域。在接下来的靶向性检测中，研 究人员证实其能特异地使四个检测内源基因中的两个基因表达上调。
[0009] 2011年7月MIT的Rudolf Jaenisch小组也验证了TALEN在人胚胎干细胞和人iPSC 中的打靶效果。其通过在五个位点的TALENs与之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果作对 比，得出五组TALENs在打靶效率和精确度上都与从Sangamo BioSciences公司购买的ZFNs 相似，进一步验证了 TALENs是非常好的基因组编辑工具。

【发明内容】

[0010] 本发明提供了一对短肽，利用这对短肽构建获得的一对转录激活子样效应因子 (TALE)能够特异性地识别人Pax6基因上的二段相邻核苷酸;利用这对转录激活子样效应因 子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，能够对人Pax6基因进行准确、高 效地打靶。
[0011] 一对融合蛋白，所述融合蛋白由氨基酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所示一 对蛋白质分别与DNA切割蛋白融合而成。
[0012] 这对融合蛋白可以分别特异性地识别人Pax6基因上的二段核苷酸序列，所述二段 核苷酸序列分别选自以下二个核苷酸序列：
[0013] (l)aaaccgagagtagcgact(SEQ ID N0.10序列）或者该序列的一个或二个核苷酸经 过取代所衍生的核苷酸序列；
[0014] (2)atactgggctattttgct(SEQ ID N0.13序列）或该序列的一个或二个核苷酸经过 取代所衍生的核苷酸序列。
[0015] 优选的，所述DNA切割蛋白为Fokl核酸酶。
[0016] 优选的，所述一对融合蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所 不。
[0017] 本发明还提供了一对多核苷酸，所述一对多核苷酸编码所述的一对融合蛋白。
[0018] 优选的，所述一对多核苷酸的碱基序列分别如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。
[0019] 所述的多核苷酸核心部分由分别识别人Pax6基因上核苷酸序列中相应碱基的 TALENs识别模块依序连接而成，其中，识别碱基A的TALENs识别模块为NI-A，识别碱基T的 TALENs识别模块为NG-T，识别碱基C的TALENs识别模块为HD-C，识别碱基G的TALENs识别模 块为NK-G。
[0020] 本发明还提供了一种包含所述一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的重组载体。
[0021] 优选的，可以先将能特异性识别SEQ ID N0.10或SEQ ID N0.13所示碱基序列的多 核苷酸连接到中间载体pCMV-NLS-TALE backbone-Fokl(R)-intermediate上，再将该中间 载体连接到最终载体pEFla-NLS-TALE backbone-Fokl(R)-pA或最终载体pEFla-NLS-TALE backbone-Fokl (L)-IRES-PUROpA上，构建获得包含编码转录激活子样效应因子核酸酶基因 的质粒载体，能表达转录激活子样效应因子核酸酶。
[0022]本发明还提供了所述一对融合蛋白或所述一对多核苷酸在对人Pax6基因靶向修 饰中的应用。
[0023]本发明还提供了一种人Pax6基因打靶的方法，包括:将所述一对多核苷酸或者含 有所述一对多核苷酸的重组载体转入人离体细胞，于30~37°C扩增培养3-7天，得到Pax6基 因被靶向修饰的细胞。
[0024]本发明针对人Pax6基因的一个位点设计了一对转录激活子样效应因子核酸酶 (Pax6-TALEN-L 1和Pax6-TALEN-R2)，这对TALENs分别由可以识别Pax6基因上一段核苷酸的 DNA识别结构域与一个Fokl核酸酶单体融合得到。将这对转录激活子样效应因子核酸酶同 时转入宿主细胞时，其能对宿主细胞Pax6基因的位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，包 括碱基缺失、碱基插入等，从而实现对人Pax6基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、 准确度高等优点。
【附图说明】
[0025] 图1为人工设计的转录激活子样效应因子核酸酶识别的DNA序列及位点示意图；
[0026] 图2为18个识别模块连接策略示意图，其中，
[0027] A:PCR为每个识别模块添加酶切识别序列和连接接头过程示意图，
[0028] B:PCR为每个识别模块添加酶切识别序列和连接接头后示意图，
[0029] C:PCR扩增6模块片段与中间载体示意图，
[0030] D:最终构建的TALEN质粒示意图；
[0031 ]图3为中间载体pCMV-NLS-TALE backbone-Fokl(R)-intermediate不意图；
[0032] 图4为最终载体pEFla-NLS-TALE backboneFokl(R)pA不意图；
[0033] 图5为最终载体pEFla-NLS-TALE backboneFokl(L)-IRESPUR0-pA示意图；
[0034] 图6为基因在打靶位点的基因型变化;其中，表示碱基缺失，"+"表示碱基插入。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1TALENs靶序列的设计
[0036] 1、从NCBI上下载人Pax6基因 （GENE ID:5080);
[0037] 2、设计引物并PCR扩增基因组上打靶位点片段，并测序，其中，PCR引物及测序引物 见表1;
[0038] 表1
[0039]
[0040] 3、设计TALENs识别序列(靶序列）：
[0041]根据测序得到的序列，并依照以下原则确定TALENs识别序列：
[0042] (1)第0位碱基为T(识别序列第一位之前的碱基为第0位）；
[0043] (2)最后一位碱基为T;
[0044] (3)识别序列长度在13-19之间；
[0045] (4)二个识别序列之间的间隔序列（Spacer)长度控制在14-21之间（12、13也可，但 效率可能较低）。
[0046] 设计得到的靶序列位置如图1所示，具体序列见表2。
[0047] 表 2
[0048]
'[0049]~实施例2TALENS识别模块之间的连接及^组载体的构建 '
[0050] 1、TALENs 识别模块(modular)的获得
[0051 ] (1)合成分别识别碱基A、T、C、G的四个识别模块NI、NG、HD、NK，序列见表3。
[0052] 表 3
[0053]
[0055] (2)将四个片段连入pEASY-B载体(购自北京全式金公司），直接平末端连接，连接 方法为：
[0056] ①取 PCR 产物 3yL;
[0057] ②加入lyL pEASY-B载体；
[0058] ③ 25°C，7min;
[0059] ④转化DH5a感受态细胞，涂布含卡纳霉素的琼脂平板；
[0060] ⑤挑取克隆、小量提取质粒、酶切、测序验证，最后得到连接到载体PEASY-B中的识 别模块 NI、NG、HD、NK。
[0061 ] 2、识别模块之间的连接
[0062]连接策略：以19个识别模块的连接为例，说明连接策略。因最后一个可以识别碱基 T的半个模块已在载体上，所以只要连18个模块即可，连接示意图见图2。
[0063] (1)将识别序列(靶序列)分为三个部分(分别为表2中原序列去掉最后一个碱基）， 即每条识别序列先分为三段，每段含有3-6个碱基，相应地每段对应3-6个识别模块，先以每 段为单位，将该段的3-6个识别模块连接。
[0064] (2) 3-6个识别模块之间的连接方法
[0065] ① PCR扩增添加酶切识别序列和连接接头
[0066] 以6个识别模块之间的连接为例：图2(A)为6个模块PCR添加酶切识别序列和连接 接头过程示意图，其中引物F1、F7、F8、R6、R7、R8带有Bbs 1酶切识别序列，引物F2、F3、F4、F5、 尺1、1?2、1?3、1?4、1?5带有88&1酶切识别序列。肋81识别序列为644640顺'顺顺，88 &1的识别序列 为GGTCTCN'NNNN，这两个酶都属于type IIs enzymes，同一个酶切识别序列可以产生多个 粘性识别末端，理论上可以产生44个粘性识别末端，再加上每个模块的结尾和开头Gly密码 子4种，Leu密码子6种的限制，利用一个type IIs enzyme可以产生24种接头。选取其中的16 种设计了引物，除了 F1与R8外，Rn可与Fn+Ι的粘性末端相连，而不能与其他引物上的粘性末 端相连。
[0067] 同样地，如果是5模块，4模块，3模块连接，则分别在第4，第3，第2个连接模块添加 F4R6，F3R6，F2R6引物即可，相应的前面的模块和最后一个模块加的引物保持不变，连接的 片段数则相应的减少1、2、3个模块片段。各个引物序列（SEQ ID N0.20~35)见表4。
[0068] 表 4
[0069]
[0070]
[0071 ]注:小写加粗字母为酶切位点的识别序列。
[0072] PCR 扩增体系（50yL)为：
[0073] DNA模板（Template) :0.5yL(约50ng);
[0074] 引物(Primer):每个 1μL(50μΜ);
[0075] LA Taq酶（Takara公司）：0.3yL;
[0076] 10 X 缓冲液（buffer): 5yL;
[0077] dNTP：2.5yL(2.5yM)；
[0078] ddH20:40.7yL。
[0079] PCR 程序：95°C 预变性 2min;95°C 变性 158,55.8°(：退火3〇8,72°(：延伸118,36个循 环；72°C 延伸 lOmin。
[0080] PCR后即可得到如图2(B)中的片段，每个模块按照目的结合序列被加上不同的内 切酶识别序列和不同的接头，相同颜色的两个接头表示两者产生的粘性末端可以相连。 [0081 ] ②纯化
[0082]将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定浓度。使用天根公司的通用型DNA纯 化回收试剂盒(离心柱型）纯化PCR片段，纯化后在进行琼脂糖凝胶电泳标定各个产物的浓 度。
[0083]③酶切连接
[0084] 因相邻的模块连接后不再能被Bsal切开所以本连接可以酶切连接同时进行，酶切 连接体系为：
[0085] 模块：100ng/模块（3-6);
[0086] Bsal(NEB 公司）：lyL;
[0087] T4连接酶（fermentas公司）：lyL;
[0088] T4连接酶缓冲液(NEB公司）：2yL;
[0089] ddH20:补至 20yL。
[0090] PCR 酶切连接程序：37 °C 5min，20 °C 5min，35 ~45 个循环；80 °C lOmin。
[0091] (3)将三段3-6模块的片段连接到中间载体pCMV-NLS-TALEbackbone-Fokl(R)- intermediate上
[0092] ①扩增3-6模块片段
[0093]将上一步骤酶切连接的20yL产物全部进行琼脂糖凝胶电泳，会出现一个模块长度 倍数大小的一个数条有梯度的条带，切胶回收最上面的条带。把切回的小块凝胶小心地放 在带滤膜的200yL移液枪的枪头中，把枪头放在1.5mL离心管(EP管）中；以最大转速离心 5min，离心后用200yL的移液枪将枪头中没有全部甩到离心管中的液体全部吹到离心管中； 离心下来的液体既可作为PCR扩增多模块片段的模板之用。PCR扩增的引物为F-a s s em和R- assem，序列见表5〇 [0094]表 5 「00951
[0096] PCR 体系（50yL):
[0097]模板:2yL;
[0098] 引物：各0·5μLΧ50μΜ);
[0099] Accuprime pfx：0.3yL；
[0100] 10X 缓冲液：5yL;
[0101] ddH20：42.2yL〇
[0102] ?^?程序：95°(：预变性21^11;95°(：变性158,64°(：退火3〇8,68°(：延伸5〇8,35个循环 ；68°C 延伸 lOmin。
[0103] ②纯化PCR产物
[0104] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认有无杂带以及目的条带的浓度。如果无杂带 或杂带相对于目的条带比例很低则用直接Kit纯化PCR产物;如果杂带较多则需要胶回收纯 化。纯化后电泳标定条带浓度。
[0105] ③酶切中间载体pCMV-NLS-TALE backbone-Fokl(R)-intermediate
[0106] 因最终载体上有bbsl酶切位点，而与3个3-6模块片段连接时，连接与bbsl的酶切 是同时进行的。所以不能直接连到最终载体上，而只能先连到没有bbsl酶切位点的中间载 体上。中间载体的示意图见图3。
[0107] 中间载体酶切体系：
[0108]质粒：5yg;
[0109] BsmBl：2yL；
[0110] DTT(100mM)：lyL；
[0111] ddH20:补足 100yL。
[0112] 37°C酶切过夜，酶切中每过两个小时补0.5yL BsmBl，并混匀，最好换一个管子，以 消除钉在管壁上未被酶切的环形质粒。酶切好后电泳确定质粒是否已全部线性化。确定好 后，Kit纯化酶切产物，电泳标定载体浓度。
[0113]④三片段与中间载体的连接
[0114]与Bsal相同，Bbsl也是type IIs enzyme，酶切产生的粘性末端连接后是不能被该 酶切开的，所以这个连接也可以酶切连接同时进行的。
[0115]载体：100ng;
[0116]模块:2〇〇ng/模块；
[0117] Bbsl (fermentas公司）：lyL;
[0118] T4连接酶（fermentas公司）：lyL;
[0119] T4连接酶缓冲液(NEB公司）：2yL;
[0120] ddH20:补至 20yL。
[0121] 酶切连接程序:PCR 程序：37 °C 5min，20 °C 5min，35 ~45 个循环;80 °C lOmin。
[0122] ⑤转染，挑选克隆，小量提取质粒，酶切鉴定，测序鉴定
[0123] 连接完后取10yL转化DH5a感受态，剩下的10yL于-20°C冻存。第二天挑一定数量的 单克隆（大于10个/板），第三天小量提取质粒，得到的质粒用BamHl和Pstl酶切鉴定，连接正 确的应该有2kb左右的条带，而自连的会有约550bp条带。酶切正确后送测序，测序正确即可 得到14-19个片段连接成功克隆了。测序引物见表6,其中，连接成功的Pax6-TALE-Ll和 Pax6-TALE-R2的氨基酸序列分别如SEQIDN0.1，SEQIDN0.2所示；
[0124] 表6
[0125] _
[0126] (4)将连接入中间载体并测序正确的片段连入最终载体pEFla-NLS-TALE backbone-Fokl(R)-pA与pEFla-NLS-TALE backbone-Fokl(L)-IRES_PUR〇-pA
[0127] 最终载体pEFla-NLS-TALE backbone-Fokl(R)-pA与pEFla-NLS-TALE backbone- Fokl(L)-IRES-PUR〇-pA是在ZFN载体(购于Sigma公司）的基础上，用BamHI+Kpnl酶切后加上 TALEN的N末端和C末端后得到的。最终载体的示意图见图4与图5。
[0128] 将连有正确片段的中间载体与两个最终载体同时用BamHl和Pstl双酶切，切胶回 收相应的片段。按照设计时的左右顺序将含有Modulars的TALE连入最终载体的左右两个载 体上。连接、转染、挑取克隆、小量抽取质粒，BamHl和Pstl双酶切鉴定，测序鉴定。鉴定正确 的克隆即为最终我们需要的TALENs质粒。
[0129] 实施例3293T细胞中基因敲除
[0130] 1、质粒转染
[0131] (1)在6孔板每个孔中加入100yL基质胶，来回晃动，使之铺满整个孔的底部，铺好 后置于5 % C02培养箱中30min。
[0132] (2)将培养293T细胞的T25瓶中的培养基吸出，PBS吸一遍，加入lmL 0.25 %胰酶， 来回晃动，使其均匀覆盖瓶底，置于5 % C02培养箱中5min。
[0133] (3)消化完成后加入lmL 10 % DMEM中和胰酶，将消化下来的细胞转移至15mL离心 管中，细胞计数，离心，1200rpm，5min。
[0134] (4)用适量的10 %DMEM重悬细胞，取200万293T细胞置于已铺好基质胶的6孔板中， 加入2mL新鲜的10 % DMEM。
[0135] (5)传代同时进行转染。
[0136] (6)将构建好的Pax6-TALE-Ll，Pax6-TALE-L2，Pax6-TALE-Rl，Pax6-TALE-R2按表7 两两配对组合转染细胞，共4种组合。
[0137] 表7
[0138]
[0139] 根据下列方案混合质粒、转染试剂和介质溶液： TALENs-L 质粒 2.5 ,ug TALENs-R 质粒 2.5 pg
[0140] Lv-EF1 α-Mchcrry 1 pg Fugenc 15 μL.. Opti MEM 300 ,uL
[0141 ]体系中各成分的比例：TALEN-L: TALEN-R: v-EFla-Mcherry = 5:5:2
[0142] 总DNA:opti MEM=2yg:100yL
[0143] SDNA:Fygene = 2yg:5yL
[0144] (7)转染后第二天，即可在荧光显微镜下观察Mcherry荧光亮度以及转染效率。若 转染成功，则将6孔中的培养基吸掉，加入2. Oμg/ml puro (puromycin，噪呤霉素）的2mL新鲜 的 10%DMEM〇
[0145] (8)置于5^^02培养箱中37°(：培养两天，每天换2.(^8/1^?虹 〇的21^新鲜的10% DMHM培养液。
[0146] (9)撤掉药杀，37°C的5%C02培养箱中培养至细胞量够抽基因鉴定之用，培养液换 为 2mL 10%DMEM。
[0147] 2、细胞打靶结果鉴定
[0148] (1)将药杀后的6孔板中用加入300yL0.25%胰酶，来回晃匀。37°C放置5min，用枪 吹打使所有细胞都被消化下来。
[0149] (2)将300yL液体吸入1.5mL EP管中，用400yL的PBS洗6孔板两次，也加入EP管中。
[0150] (3)13200rpm 离心 5min，弃去上清液。
[0151] (4)用直接PCR Kit(thermo公司，货号：F-140)抽提基因组，并PCR扩增打靶区域 DNA片段。
[0152] (5)鉴定打靶细胞的基因型及打靶效率
[0153] 将上述的Pax6-TALE-Ll/Pax6-TALE-R2组合处理的293T细胞的基因组的PCR片段 加 A后连入PMD18-T载体中，单克隆化DNA片段，测序后得到Pax6基因的打靶位点的基因型。
[0154] 加 A体系为：
[0155] DNA：10yL；
[0156] rTaq：0.5yL；
[0157] 10 Xbuffer ： 1.5；
[0158] dNTP：0.5yL；
[0159] ddH20：2.5yL；
[0160] 然后混匀，置于72°C20min。
[0161] 结果显示:共送14个样品测序有4个克隆发生了突变，其中4个克隆发生了碱基删 除。因为293T是二倍体，在假设细胞中没有双敲除的前提下，Pax6-TALE-Ll/Pax6-TALE-R2 组合使Pax6基因发生突变的概率是(4 X 2)/14，即57.1 %。
[0162] 实施例4hES细胞中基因敲除
[0163] 按实施例3相同的方法对hES细胞进行基因敲除实验。
[0164] 结果显示:共送14个样品测序有3个克隆发生了突变，见图6,其中3个克隆发生了 碱基删除。因为XI是二倍体，在假设细胞中没有双敲除的前提下，Pax6-TALE-Ll/Pax6- 丁八1^-1?2组合使?&16基因发生突变的概率是（3\2)/14，即42.9%。本研究只在?&16基因的 一个位点设计了 TALENs分子就得到可以定点修饰该基因的一对TALENs，并且效率非常高。 可见TALENs技术的相较于ZFN技术的优越性。该对多核苷酸可以识别SEQ ID N0.10和SEQ ID NO. 13的核苷酸序列，而且可以识别这二个序列的一个或二个核苷酸被取代后所衍生的 核苷酸序列。该对多核苷酸或其表达的融合蛋白是可以对人基因高效打靶的TALENs，它们 为通过同源重组修正Pax6基因的的突变或其他基因修饰提供了一个非常高效的工具。
【主权项】
1. 一对融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由氨基酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示一对蛋白质分别与DNA切割蛋白融合而成。2. 如权利要求1所述的一对融合蛋白，其特征在于，所述DNA切割蛋白为Fokl核酸酶。3. 如权利要求1或2所述的一对融合蛋白，其特征在于，所述一对融合蛋白的氨基酸序 列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4. 一对多核苷酸，其特征在于，所述一对多核苷酸编码如权利要求1或2所述的一对融 合蛋白。5. -对多核苷酸，其特征在于，所述一对多核苷酸编码如权利要求3所述的一对融合蛋 白。6. 如权利要求5所述的一对多核苷酸，其特征在于，所述一对多核苷酸的碱基序列分别 如SEQIDN0·5和SEQIDN0·6所示。7. -种包含如权利要求4所述一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的重组载体。8. -种包含如权利要求5或6所述一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的重组载体。9. 如权利要求3所述一对融合蛋白或如权利要求6所述一对多核苷酸在对人Pax6基因 靶向修饰中的应用。10. -种人Pax6基因打靶的方法，其特征在于，包括:将如权利要求5或6所述一对多核 苷酸或者含有如权利要求5或6所述一对多核苷酸的重组载体转入人离体细胞，于30~37 °C 扩增培养3-7天，得到Pax6基因被靶向修饰的细胞。
【文档编号】C12N15/55GK105838691SQ201610243278
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月18日
【发明人】李文静, 林喜娟, 肖磊
【申请人】浙江大学