一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法。该检测方法包括如下步骤：针对所研究目的基因的外显子序列设计靶位点，构建TALEN质粒对；将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核或将TALEN质粒对体外转录为mRNA显微注射至受精卵胞质内；将注射成功的受精卵体外培养；巢式PCR扩增培养得到的单个胚胎的目的基因；将经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物进行测序，根据测序套峰出现的比例判断TALEN质粒的敲除效率，即可判断TALEN质粒内源活性的高低。本方法直接对目的细胞进行显微注射，能够直接评价TALEN质粒的内源活性；且排除了细胞转染效率的干扰，能够更准确的评价TALEN质粒的活性高低。
【专利说明】一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶的检测方法，特别涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法。
【背景技术】
[0002]目前用于检测转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-likeeffector nucleases, TALENs)活性的方法，有如下 3 种:
靶点酶切检测:该方法将TALEN质粒转染细胞系(GFP质粒共转染观察转染效率)，提取转染后细胞的基因组，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增目的DNA,将PCR扩增的DNA片段经限制性酶切，凝胶电泳检测，未打断序列为敲除成功，计算灰度值与对照组相比。该方法的局限性为=(I)TALEN设计时必须已考虑将靶点选择在有特异酶切位点的区域；(2)若FOLK酶剪切位点在酶切位点以外的部分，内切酶仍可发挥作用，检测不到这样的敲除，检测敲除效率的结果比实际偏低。
[0003]SURVEYOR突变检测:该方法将TALEN质粒转染细胞系(GFP质粒共转染观察转染效率)，提取转染后细胞的基因组，通过PCR扩增目的DNA，将PCR扩增的DNA片段加入外源DNA后将混合物解链-退火，得到异源多聚DNA片段，用异源多聚检测酶(SURVEYORNuclease)按试剂盒步骤进行检测，凝胶电泳显示结果，分析结果得到敲除效率。该方法的局限性为:(I)对PCR产物要求高；(2)敲除效率取决于异源多聚DNA片段的形成比例，不能直接反应确切的敲除效率。
[0004]Luciferase SSA检测:首先在Iuciferase的编码区中央插入一个终止子，此时Iuciferase没有活性。将TALEN剪切的靶点位置序列插在终止子后，在TALEN的剪切作用下，靶点位置双链断裂，细胞通过同源重组方式修复DNA，终止子一并剪切掉，重组的Iuciferase具有活性。通过与参照的比值变化反应TALEN剪切的活性水平。该方法的局限性为:(I)只检测了 TALEN的外源性活性，未在特定种属检测其是否具有内源活性；(2)通过参照比较荧光素活性的高低，只能反映TALEN是否具有活性，而敲除效率的高低不能反映。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，包括如下步骤:针对所研究目的基因的外显子序列设计靶位点，构建TALEN质粒对；将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核或将TALEN质粒对体外转录为mRNA显微注射至受精卵胞质内；将注射成功的受精卵体外培养；巢式PCR扩增培养得到的单个胚胎的目的基因；将经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物进行测序，根据测序套峰出现的比例判断TALEN质粒的敲除效率，即可判断TALEN质粒内源活性的高低。
[0007]所述的靶位点的设计优选为包括如下原则:(I) 5’端固定碱基T ; (2)从5’端起，第I位碱基不能为T，第2位碱基不能为A ；(3) GC含量小于40% ； (4) 3’端不能为G ；(5)左、右臂靶位点16-19bp ; (6)左右臂靶位点间隔18-24bp。
[0008]所述的受精卵优选为斑马鱼、大鼠、小鼠或猴等的受精卵。
[0009]所述的受精卵优选为通过如下方法获取:雌性大鼠超数排卵后，颈椎脱白处死，75% (v/v)酒精消毒后剪开腹腔，剪下输卵管置于37°C预热的M2液滴中，体式镜下用尖镊将输卵管壶腹部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体；用透明质酸酶消化卵细胞周围的颗粒细胞，M2洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中，置于37°C，5%的CO2培养箱培养；取出卵细胞置于显微镜下观察，选出可见清晰原核的受精卵用于显微注射。
[0010]所述的显微注射的方法优选为:安装拉制好的持卵针，持卵针通过塑料管连接于装有矿物油的带微调的注射器，通过调节油泵控制卵的位置；安装虹吸有质粒或mRNA的注射针，注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪；根据注射针的出液量调节注射压力，以可见胞质内有明显膨胀而细胞仍能存活为适宜注射量。
[0011]所述的体外培养的条件优选为:将注射成功的受精卵用大鼠胚胎培养液37°C，5%的CO2培养箱培养隔天换液，培养3-5天后用于扩增目的基因检测；所述大鼠胚胎培养液的配方为:葡萄糖 7.5 mmol /T,, L-谷氛酸胺 I mmol /T,, NaCl 77 mmol/L, KCl 1.34 mmol/L,MgCl2 0.44 mmol/L, CaCl2 1.78 mmol/L, NaHCO3 25 mmol/L,丙丽酸纳 0.59 mmol/L,乳酸钠25 mmol/L,牛血清白蛋白0.3% (质量体积比,g/mL)。
[0012]所述的敲除效率的计算公式为:敲除效率=出现套峰样本数/总的测序样本数 X 100%。
[0013]本发明与现有技术相比具有如下优点和效果:
(I)以往的检测方法均是在可传代的细胞系(hepatocellular carcinoma即HCC细胞，293T细胞等)进行外源活性检测，本方法直接对目的细胞(大鼠、小鼠、猴等的受精卵)进行显微注射，能够直接评价TALEN质粒进行靶基因敲除的内源活性。
[0014](2)以往的检测方法有的(Luciferase SSA检测)只能反映活性的有无,不能反映活性的高低；有的受转染效率、酶切位点(靶点酶切检测)或异源多聚DNA片段形成比例(SURVEYOR突变检测)的影响，不能准确反映TALEN质粒的实际敲除效率。本方法通过直接受精卵显微注射，可以直接判断TALEN质粒或质粒转录的mRNA是否注射成功，避免进行质粒的细胞转染这一实验过程，排除了细胞转染效率的干扰，能够更准确的评价TALEN质粒的活性高低。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是质粒敲除检测结果图，A:未敲除；B:敲除成功。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0017]实施例1质粒的构建与体外转录在 NCBI 网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/)搜索 NLRC4 基因相关信息，限定物种为大鼠。找到NLRC4的基因序列(Gene ID:298784),在外显子I利用TALEN Targeter(https://boglab.pip.1astate.edu/)按如下原则在线选择TALEN识别的祀位点:(I) 5，端固定碱基T ; (2)从5’端起，第I位碱基不能为T，第2位碱基不能为A ; (3)GC含量小于40% ； (4) 3，端不能为G ; (5)左、右臂靶位点16-19bp ; (6)左右臂靶位点间隔18_24bp。外显子I序列如下:
GTGAACTTTATAAAGGAAAACAGCCAAGCCCTTATTCAGAGGATGGGCATAGTGGTTATAAAGCAAATCTGT
GATGACCTATTTGCATTGAACGTTCTCAACGGGGAAGAAGTTGCCATCATTTGCAGTCATCGGGTGGAGCAGGACGC
TGCACGAGACATCGTCCATATGATTTTGAAGAAGGGCTCAGCGGCCTGCAACCTCTTTCTTAAGAGTCTTGAAAACT
GGAACTATCCTGTGTATCAGGACTTAACTGGACACA。
[0018]选择的TALEN识别靶位点如上述有下划线标记的序列所示，针对TALEN所识别的靶位点分别构建对应的TALEN质粒的左臂和 右臂。TALEN质粒左臂和右臂的构建模块如下表所示:
【权利要求】
1.一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于包括如下步骤:针对所研究目的基因的外显子序列设计靶位点，构建TALEN质粒对；将TALEN质粒对显微注射至受精卵的原核或将TALEN质粒对体外转录为mRNA显微注射至受精卵胞质内；将注射成功的受精卵体外培养；巢式PCR扩增培养得到的单个胚胎的目的基因；将经琼脂糖凝胶电泳鉴定的PCR产物进行测序，根据测序套峰出现的比例判断TALEN质粒的敲除效率，SP可判断TALEN质粒内源活性的高低。
2.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于:所述的靶位点的设计包括如下原则:(I) 5’端固定碱基T ; (2)从5’端起，第I位碱基不能为T，第2位碱基不能为A ; (3)GC含量小于40% ；(4) 3’端不能为G ; (5)左、右臂靶位点16-19bp ；(6)左右臂靶位点间隔18-24bp。
3.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于:所述的受精卵为斑马鱼、大鼠、小鼠或猴的受精卵。
4.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于:所述的受精卵通过如下方法获取:雌性大鼠超数排卵后，颈椎脱白处死，75%酒精消毒后剪开腹腔，剪下输卵管置于37°C预热的M2液滴中，体式镜下用尖镊将输卵管壶腹部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体；用透明质酸酶消化卵细胞周围的颗粒细胞，M2洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中，置于37°C，5%的CO2培养箱培养；取出卵细胞置于显微镜下观察，选出可见清晰原核的受精卵用于显微注射。
5.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于:所述的显微注射的方法为:安装拉制好的持卵针，持卵针通过塑料管连接于装有矿物油的带微调的注射器，通过调节油泵控制卵的位置；安装虹吸有质粒或mRNA的注射针，注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪；根据注射针的出液量调节注射压力，以可见胞质内有明显膨胀而细胞仍能存活为适宜注射量。
6.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于:所述的体外培养的条件为:将注射成功的受精卵用大鼠胚胎培养液37°C，5%的0)2培养箱培养隔天换液，培养3-5天后用于扩增目的基因检测；所述大鼠胚胎培养液的配方为:葡萄糖 7.5 mmol/L，L-谷氛酸胺 I mmol /T,, NaCl 77 mmol/L, KCl 1.34 mmol/L,MgCl2 0.44mmol/L, CaCl2 1.78 mmol/L, NaHCO3 25 mmol/L,丙丽酸纳 0.59 mmol/L,乳酸纳 25 mmoI /L，牛血清白蛋白0.3%。
7.根据权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法，其特征在于:所述的敲除效率的计算公式为:敲除效率=出现套峰样本数/总的测序样本数 X 100%O
【文档编号】C12Q1/34GK103468801SQ201310375783
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】唐其柱, 卞洲艳, 邓伟, 周恒 , 杨政, 徐蔓, 张洁钰, 廖海含 申请人:武汉大学