一种高产中链脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌及其构建方法
【专利摘要】本发明提供一株高产中链脂肪酸乙酯酿酒酵母工程菌，是选用强启动子PGK1过表达编码醇己酰基转移酶的EHT1基因，同时敲除外源脂肪酸活化酶基因FAA1实现的，保藏号为CGMCC?No.7937。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下，与亲本菌株相比：模拟玉米原料液态白酒发酵15天后，己酸乙酯含量可以提高到2.23mg/L，为原菌的2.75倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量分别提高了52%和62%。发酵30天后，己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了120%、16.2%和16.7%。模拟高粱原料固态白酒发酵15天后，己酸乙酯的含量可以提高到2.83mg/L，为原菌的2.8倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了43.3%和40.9%。
【专利说明】一种高产中链脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及工业微生物的育种，尤其是一种高产中链脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌及其构建方法。
【背景技术】
[0002]酯香物质是饮料酒中主要的风味物质，是酒芳香的主要担体，提高酒中酯香物质的含量可以增进酒类的风味，改善饮料酒的品质。以己酸乙酯为主的脂肪酸乙酯是浓香型白酒的主体香，赋予了饮料酒重要的酯香(水果香)。国内普通白酒和黄酒是以纯种培养的酿酒酵母为主进行发酵的，其特点是发酵周期短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较差。而高档饮料酒(白酒、黄酒)中酯香物质含量较高的主要原因是采用自然网罗微生物制曲发酵，通过自然制曲网罗的产酯能力较强的汉逊酵母和假丝酵母以及提供产酯前体物的乳酸菌、己酸菌和霉菌等生香微生物来提高酒中各种酯的含量，而这些野生菌群的存在严重影响了原料出酒率，其酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致了我国高档白酒耗粮高、生产周期长、效率低、成本高。
[0003]如何提高饮料酒中酯香物质的含量，能否让酿酒酵母大量分泌己酸乙酯和酯化己酸和乙醇合成己酸乙酯，是一个长期困扰我国饮料酒业界的问题。目前提高普通白酒己酸乙酯含量的主要方法有如下三种:一是固液结合法，用液态法生产酒基，用固态法的酒糟、酒尾或成品酒来提高质量；二是调香法，用天然香料调制或用纯化学药品按某一名酒的香味成分组成来进行调香；三 是全液法，在发酵醪中加入产香微生物，己酸菌发酵液或将己酸发酵液经化学，生物法酯化后，再加到发酵醪中。这些提高酒中己酸乙酯含量的方法大多是从工艺水平上进行的，虽然酯香物质含量有一定提高，但酒质与高档名酒相差仍很大，特别是化学品的添加存在安全隐患。
[0004]研究表明，酯类是在酵母代谢时在酵母内合成的，形成的酯部分通过细胞扩散到发酵醪液中，构成饮料酒的香气成分。中链脂肪酸乙酯类，如己酸乙酯(苹果香气)，辛酸乙酯(酸苹果香气)和癸酸乙酯(花香)，相比乙酸酯类虽然含量较少，仍然是酒中重要的风味活性酯。
[0005]参与中链脂肪酸乙酯合成的酶主要是己酰基转移酶(AATase)，该酶催化乙醇和己酰基辅酶A形成中链脂肪酸酸乙酯。该酶是一种巯基酶，在酿酒酵母中存在三种同功酶形式，分别由EHT1，EEBl和YMR210W编码。而由FAAl基因编码的脂肪酸激活酶合成的长链酰基CoA抑制了乙酰基羧化酶的作用，当合成中链脂肪酸的重要酶乙酰基羧化酶收到抑制后，合成中链脂肪酸乙酯(如己酸乙酯)前体的中链脂肪酸(如己酸)就受到影响。从而导致了己酸乙酯等中链脂肪酸乙酯的生成受到抑制。而国内还没有己酰基转移酶和脂肪酸激活酶及其编码基因对饮料酒风味和品质影响的相关研究。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是解决酿酒酵母自身产酯能力较低的问题，提供一种高产中链脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌株及其构建方法。
[0007]为解决上述技术问题，本发明技术方案如下:
[0008]本发明提供的高产中链脂肪酸乙酯酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),具体为EY15，已于2013年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101，保藏号为CGMCC N0.7937，分类命名:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。模拟玉米原料液态白酒发酵后,本发明菌株与亲本菌株相比，发酵15天后，己酸乙酯含量为原菌的2.75倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量分别提高了 52%和62% ;发酵30天后，己酸乙酯含量为原菌的2.5倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了 16.2%和16.7%。模拟高粱原料固态白酒发酵15天后，己酸乙酯含量为原菌的2.8倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了 43.3%和40.9%。
[0009]本发明所述高产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌的构建方法，是通过用强启动子过表达醇己酰基转移酶基因，并同时敲除外源脂肪酸活化酶基因来实现。
[0010]所述过表达醇己酰基转移酶基因替换外源脂肪酸活化酶基因。
[0011]所述过表达醇己酰基转移酶基因为EHT1，所述外源脂肪酸活化酶基因为FAA1。
[0012]本发明高产中链脂肪酸乙酯酿酒酵母基因工程菌的构建方法具体包括如下步骤:
[0013]I)将通过PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码醇己酰基转移酶EHTl基因插入到PPGKl质粒上的启动子PGKlp和终止子PGKIt之间，得到质粒pUC_PE ；
[0014]2)将通过PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码脂肪酸激活酶FAAl基因的同源片段FA和FB分别连接到质粒pUC19上，得到质粒pUC_FAB ；
[0015]3)将来源于质粒pUG6上的1xP-KanMX-1oxP基因片段连到质粒pUC_FAB上，得到质粒 pUC-FABK ；
[0016]4)将pUC-PGKl-EHTl质粒上的启动子PGKlp-EHTl_PGKlT基因酶切下来后再与pUC-FABK质粒连接得到质粒pUC-APEKB ；
[0017]5)将通过PCR方法获得的来源于构建的质粒pUC-APEKB的APEKB重组盒，用醋酸锂转化法分别将其重组入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生孢分离获得的a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株，将a型和α型基因工程单倍体融合，得到酿酒酵母基因工程菌。
[0018]本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述高产脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌的基因序列，该基因序列是以E-S和B-X为引物，以所述高产脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列，如序列表1所示。
[0019]模拟玉米原料液态白酒发酵:将酵母菌ΕΥ15接入4mL8° Brix玉米水解液中，30°C过夜静置培养24h ;将菌液全部转至36mL12° Brix玉米水解液中，30°C静置培养16h。取60g玉米面，按1:3的料水比加入65~70°C的水，放置20min ;加耐高温α-淀粉酶(2万U) 30 μ L,混匀后升温到85~90°C后，液化90min，糊化醪冷却到55~60°C，加入糖化酶(200υ)90μ L及营养盐lmL，糖化20min，之后加酸性蛋白酶1.2mL, 20min后冷却到30°C，接种，30°C发酵15天。对发酵液进行分析，包括失重、酒度、残糖和GC-MS测定香气成分含量。(玉米水解液制备方法:称取1500g玉米粉，加入4500mL65~70°C的水，放置20min，是玉米颗粒充分吸水膨胀，加入α -淀粉酶(2万U)900 μ L，液化90min，糊化醪冷却到55~60°C，加入糖化酶(200U)3mL，糖化20h，将糖化液用滤布过滤得到澄清滤液，pH自然，煮沸灭菌IOmin,即可制得。)
[0020]模拟高粱原料固态白酒发酵:称取50g高粱，95~98°C浸泡3~4h，充分吸水无硬心，常压蒸煮30min左右,颗粒均匀、内心无白，摊晾降温至30°C,拌曲5g,培菌糖化24h后，按5%接菌量接菌EY15发酵。
[0021 ] GC-MS分析:发酵液经蒸馏后，取8mL样品，加入3g NaCl，平衡lOmin，用50/30 μ m的萃取头,萃取45min,经上述固相微萃取前处理后，采用气相质谱法测定。内标物为乙酸正戊酯。气相色谱仪为Agilent7890C ;质谱仪为Agilent5975C色谱柱HP5柱30mX320ymX20ym，配四级杆MS检测器。载气为高纯氦气，流速2.0mL/min。起始柱温为40°C保持3min，以6 V Mn的升温速度升至240°C，保持lOmin。检测器温度为250°C，进样口温度为230°C，分流比为10:1。
[0022]有益效果:
[0023]本发明选用强启动子PGKl过表达编码醇己酰基转移酶的EHTl基因并敲除外源脂肪酸活化酶，获得了高产乙酸酯酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)EY_15,保藏号为 CGMCC N0.7937。
[0024]本发明所获得的高产脂肪酸乙酯酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)EY15 (CGMCC N0.7 937)与初始的酿酒酵母菌AY15相比:该酿酒酵母在其他发酵性能不受影响的情况下，模拟玉米原料液态白酒发酵后，转化子菌株与亲本菌株相比，发酵15天后，己酸乙酯含量提高1.75倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量分别提高了 52%和62% ;发酵30天后，己酸乙酯含量提高1.5倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了 16.2%和16.7%。模拟高粱原料固态白酒发酵15天后，己酸乙酯提高了 1.8倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量分别提高了 43.3% 和 40.9%ο
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1重组质粒pUC-APEKB的构建流程示意图；
[0026]图2构建重组质粒pUC-APEKB的酶切和PCR验证电泳图；
[0027]图3重组质粒pUC-APEKB与酵母基因组的同源重组示意图；
[0028]图4重组酿酒酵母单倍体的验证，其中(A)为a型重组单倍体验证结果；(B)为α型重组单倍体验证结果；
[0029]图5重组酿酒酵母菌基因工程菌的PCR验证凝胶电泳图；
[0030]图6高产脂肪酸乙酯酿酒酵母工程菌的构建路线图。
【具体实施方式】
[0031]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0032]本发明所使用的酿酒酵母双倍体菌体是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。
[0033]实施例1:高产己酸乙酯酿酒酵母基因工程菌的构建
[0034](I)基因工程菌株的构建
[0035]I) pUC-APEKB 质粒的构建
[0036]以pUC-19为基础质粒构建同源重组质粒pUC-APEKB，构建流程如图1所示，以AY15的单倍体a8或α 5为模板PCR扩增得到411bp的上游同源臂FA和409bp的下游同源臂FB，分别通过EcoRI/Kpnl和Pstl/HindHI双酶切连入pUC_19中得到质粒pUC_FAB。以AY15的单倍体a8或α 5为模板PCR扩增得到1356bp的醇己酰基转移酶基因EHTl，通过XhoI单酶切插入到pPGKl质粒上的启动子PGKlp和终止子PGKIt之间，得到质粒pPGKl_E ；以pPGKl-E质粒为模板，PCR扩增得到3145bp的PGKlp-EHTl_PGKlT片段。用BamHI分别单酶切PGKlp-EHTl-PGKlT片段和质粒pUC_FAB，用Solution I连接酶连接，构成质粒pUC-FAPEB ;用以pUG6为模板PCR扩增获得1613bp的KanMX基因，Kpn I分别酶切KanMX基因和质粒pUC-FAPEB，用Solution I连接酶连接，构成重组质粒pUC_FAPEKB ;整个过程所用引物的序列如表1。
[0037]表1PCR 引物
[0038]
【权利要求】
1.一株高产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌，具体为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EY15，保藏号为 CGMCC N0.7937。
2.根据权利要求1所述的一株高产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌，其特征在于，在其他发酵性能不受影响情况下，所述酵母工程菌模拟玉米原料液态白酒发酵，发酵15天后，己酸乙酯含量为亲本菌株的2.75倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量较亲本菌株分别提高了52%和62% ;发酵30天后，己酸乙酯含量为亲本菌株的2.5倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量较亲本菌株分别提高了 16.2%和16.7% ;模拟高粱原料固态白酒发酵15天后，己酸乙酯含量为亲本菌株的2.8倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量较亲本菌株分别提高了 43.3%和40.9%。
3.高产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过用强启动子过表达醇己酰基转移酶基因，并同时敲除外源脂肪酸活化酶基因来实现。
4.根据权利要求3所述的高产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述过表达醇己酰基转移酶基因替换外源脂肪酸活化酶基因。
5.根据权利要求3或4所述的高产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述过表达醇己酰基转移酶基因为EHT1，所述外源脂肪酸活化酶基因为FAA1。
6.根据权利要求3或4所述的高产中链脂肪酸乙酯的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将通过PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码醇己酰基转移酶EHTl基因插入到PPGKl质粒上的启动子PGKlp和终止子PGKIt之间，得到质粒pUC_PE ； (2)将通过PCR方法获得的来源于酿酒酵母编码脂肪酸激活酶FAAl基因的同源片段FA和FB分别连接到质粒pUC19上，得到质粒pUC_FAB ； (3)将来源于质粒pUG6上的1xP-KanMX-1oxP基因片段连到质粒pUC_FAB上，得到质粒 pUC-FABK ； (4)将pUC-PGKl-EHTl质粒上的启动子PGKIp-EHT1-PGK It基因酶切下来后再与pUC-FABK质粒连接得到质粒pUC-APEKB ； (5)将通过PCR方法获得的来源于构建的质粒pUC-APEKB的APEKB重组盒，用醋酸锂转化法分别将其重组入酿酒酵母生孢分离获得的a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株，将a型和α型基因工程单倍体融合，得到酿酒酵母基因工程菌。
【文档编号】C12N15/81GK103571764SQ201310375827
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年8月26日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】陈叶福, 肖冬光, 李锋, 郭学武, 张翠英, 董健, 杜丽平 申请人:天津科技大学