一种高催化活性的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种高催化活性的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用。该脂肪酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的S118?177突变脂肪酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的S122?196突变脂肪酶。本发明通过长时间的高温分子动力学模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程，分析了脂肪酶盖子1区域的解折叠关键亚区，有效地筛选出关键的突变位点。通过实测筛选所得的突变脂肪酶的热稳定性强，且催化活性高，特别适合在工业上进行应用。
【专利说明】
-种高催化活性的耐热突变脂肪酶及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于酶工程领域，特别设及一种高催化活性的耐热突变脂肪酶及其制备方 法与应用。
【背景技术】
[0002] 耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)对中长链脂肪酸甘油S醋(C12~C16)具有较高的催 化活性，被广泛应用于油脂水解、污水处理、食品加工、生物能源、化学合成W及膜腺缺乏症 的治疗等多个领域，具有广泛的应用前景。但该脂肪酶的热稳定性较差，在生产加工、储存、 运输等过程中损失较大，难于回收，造成应用成本较高。改造耶氏解脂酵母脂肪酶2的热稳 定性和催化活性，是降低使用成本的有效方法，具有十分重要的意义。
[0003] 大多数脂肪酶的活性中屯、上方被一段或多段盖子螺旋结构覆盖，底物无法直接进 入活性中屯、。当脂肪酶处于油水界面时，盖子较链区域发生复杂的重排，牵引盖子螺旋结构 移动，使催化中屯、暴露，底物通过"缝隙"自由地进入催化口袋，进行催化反应。可见，脂肪酶 盖子螺旋结构的柔性是发生催化反应的必要条件。但该结构的波动性较大，使其成为酶分 子不稳定的因素之一。此外，脂肪酶盖子螺旋结构与酶活中屯、形成的氨键网络，能稳定"中 间四面体"过渡态，促进催化反应。加强脂肪酶螺旋盖子结构的刚性，能同时增强脂肪酶的 热稳定性和催化活性。但是，如果螺旋盖子结构刚性过强，将限制盖子螺旋结构的运动，严 重影响酶的催化活性。因此，改造脂肪酶盖子螺旋结构的稳定性，同时增强脂肪酶的热稳定 性和催化活性成为难点。
[0004] 目前对蛋白质热稳定性改造主要分为定向进化、半理性设计和理性设计，其中定 向进化和半理性设计需要大量的人力物力，而理性设计需要对蛋白质结构与功能有全面的 理解。但是，目前的改造方法均没有关注蛋白质的解折叠模式，并没筛选出抑制其解折叠的 关键亚区。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，利用分子动力学模拟筛选出 脂肪酶盖子1区域的解折叠关键亚区，有针对性地引入二硫键突变，抑制盖子1区域的运 动，加强盖子1螺旋结构与酶活中屯、的氨键网络，W达到同时提高脂肪酶热稳定性和催化活 性的目的，并提供一种高催化活性的耐热突变脂肪酶。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述高催化活性的耐热突变脂肪酶的制备方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供所述高催化活性的耐热突变脂肪酶的应用。
[000引本发明的目的通过下述技术方案实现:一种高催化活性的耐热突变脂肪酶，是在 耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2盖子1区域的解折叠关键亚区引入二硫键突变；
[0009] 所述的盖子1区域的解折叠关键亚区为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第106位~ 127位氨基酸序列。
[0010] 所述高催化活性的耐热脂肪酶优选为S118-177突变脂肪酶或S122-196突变脂肪 酶；
[0011] S118-177突变脂肪酶的氨基酸序列如下：
[0012] VYTSTET 甜 ID 犯 SYNFF 邸 YA 化 ANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNWLIE 邸皿 PRLI 抑 VSGYLAVDHA SKQI 化 VIRGT 服 LEDVITDIRIMQAPLTN 抑 LAANISSTCTC 孤化 VHNGFIQSY 順 TYNQIGPKLDSVIEQYPDY QIAVTG 服 LGGAAALLFGINLKCNG 皿化 WTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFG 犯 NPDVSKVS 邸服 LYR 口 HRGDI VPQVPFWDGYQ 肥 SGEVFIDWPUHP 化 SNVVMCQGQSNKQCSAGN 化 LQQVNV 化 NHLQYFVTEGVCGI;
[0013] S122-196突变脂肪酶的氨基酸序列如下：
[0014] VYTSTET 甜 ID 犯 SYNFF 邸 YA 化 ANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNWLIE 邸皿 PRLI 抑 VSGYLAVDHA SKQI化VIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLAANISSTATCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDY QIAVTG 服 LGGAAALLFGINLKVNG 皿化 WTLGQPIVGNACFANWVDKLFFG 犯 NPDVSKVS 邸服 LYRITHRGDI VPQVPFWDGYQ 肥 SGEVFIDWPUHP 化 SNVVMCQGQSNKQCSAGN 化 LQQVNV 化 NHLQYFVTEGVCGI。
[0015] 编码所述高催化活性的耐热脂肪酶的核巧酸序列，如下所示：
[0016] S118-177突变脂肪酶的编码核巧酸序列如下：
[0017] gtgtacacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaa cattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttcccca acgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcc tccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggc tcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctacttgtacttgtgatgactgtcttgtccacaatggct tcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactac cagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaagtgtaacggcca cgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttct ttggCC3gg3g33CCCCg3tgtctCC33ggtgtCC333g3CCg333gCtct3CCg33tC3CCC3CCg3gg3g3t3tC gtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccc tcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcagg tcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
[0018] S122-196突变脂肪酶的编码核骨酸序列如下：
[0019] gtgtacacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaa cattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttcccca acgttg agctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgc ctccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcagg ctcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgattgttgtcttgtccacaatggc ttcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgacta ccagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggcc acgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttc tttggcc过gg过g过过ccccg过tgtctcc过过ggtgtcc过过过g过ccg过过过gctct过ccg过过tc过ccc过ccg过gg过g过t过t cgtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccacc ctcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcag gtcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa〇
[0020] 所述高催化活性的耐热的脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：
[0021] (1)通过Gromacs分子动力学软件，模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程;对所 得轨迹进行波动性分析，并进一步将盖子1区域与邻近结构划分成若干亚区，统计分析每个 亚区的波动变化，筛选出盖子1区域的解折叠关键亚区，最后使用Disulfide by Design软 件筛选潜在二硫键突变位点；
[0022] (2)通过反向PCR突变，将所选出的氨基酸位点突变为半脫氨酸，并转入大肠杆菌 中，进行扩增培养、质粒提取和测序；
[0023] (3)将测序正确的突变质粒W化el限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受 态毕赤酵母X33中，进一步通过博来霉素抗性平板和BMMY-罗丹明B产酶平板筛选，得到对应 的突变工程菌；
[0024] (4)将突变工程菌在YTO液体培养基中进行扩增繁殖培养后，转接至BMGY液体培养 基进行去抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离屯、获取上清粗酶液；
[0025] (5)使用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用儀柱一步法纯化，分离出带组氨酸 标签的脂肪酶蛋白，并W还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的脂肪酶；
[0026] (6)通过DSF巧光检测测定突变脂肪酶的烙解溫度(Tm)，初步筛选有效的热稳定突 变脂肪酶；
[0027] (7)通过DTNB法测定蛋白质中的游离琉基浓度和总琉基浓度，计算蛋白分子内的 二硫键数目，检测引入的二硫键突变是否成键；
[002引（8)通过P-NPP比色法测定突变脂肪酶的热稳定性指标：15min半失活溫度(Tsq)、50 °C下的半衰期(ti/2)和最适反应溫度(Topt);
[0029] (9)通过P-NPP比色法测定突变脂肪酶的催化活性指标:Km、Kcat和Kcat/Km值，最终筛 选出高催化活性的耐热突变脂肪酶。
[0030] 步骤（1)更具体包括如下步骤:使用Ambe计巧9SB-NMR-ILDN力场的参数，将蛋白 放置于十二面体的菱形盒子中央并填充TIP3P水分子与10个化+中和的体系电荷，并W Ste邱est算法对整个体系进行能量优化;随后在等溫等压体系(NPT)体系下，限制蛋白骨架 重原子的运动，在5(K)ps内缓慢地从0K升溫至303K，充分平衡酶周围的水分子，体系的溫度 和压力偶联使用Berendsen算法，得到预平衡模型；将预平衡模型在化S内从303K缓慢地升 溫至473K，然后在等溫等压体系(NPT)下进行30化S模拟;范德华力截断半径、静电相互作用 力截断半径、邻近捜索截断半径均根据AMBER力场推荐，设置为0.化m;所有的键长采用 LINCS算法约束，长程静电相互作用力采用PME算法，计算步长设置为2f S;通过波动性分析 盖子解折叠的相关区域:通过Gromacs自带的分析工具gmx_;rmsf计算Ca原子的均方根涨幅 随解折叠进程的变化，分析骨架氨基酸均方根涨幅曲线，确认盖子1区域具有较大的波动 性;并根据波动性分析结果，将盖子1区域和邻近结构划分成几个亚区，通过Gromacs自带的 分析工具gmx_rmsf，计算每个亚区的Ca原子RMSD随时间的变化曲线，确定盖子1区域的解折 叠关键亚区，最后使用Disulfide by Design软件筛选潜在二硫键突变位点。
[0031] 步骤(1)中所述的脂肪酶盖子1区域为第83位~136位氨基酸序列。
[0032] 步骤（1)中所述的脂肪酶盖子1区域的解折叠关键亚区为耶氏解脂假丝酵母脂肪 酶2的第106位~127位氨基酸序列，包括两端小0折叠和一段无规则卷曲，我们将其定义为 loop5结构。
[0033] 步骤（1)中所述的亚区为:氨基酸78位至87位，即防折叠;氨基酸88位至105位，即 盖子1螺旋结构;氨基酸106位至127位，即loops结构;氨基酸126位至150位，即a3螺旋。
[0034] 步骤(2)中所述的大肠杆菌工程菌优选为大肠杆菌T0P10。
[0035] 步骤(4)中所述的培养的条件优选为摇瓶培养96小时。
[0036] 所述高催化活性的耐热脂肪酶热稳定性强，催化能力高，特别适合在工业上进行 应用。
[0037] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0038] 本发明利用生物信息学对蛋白质改造属于理性设计的方法。该方法相对于传统的 非理性改造方法而言，能节约大量的人力物力，但需要对蛋白质分子结构进行全面的分析， 方能筛选出有效的改造点。
[0039] 本发明通过长时间的高溫分子动力学模拟，筛选出耶氏解脂酵母脂肪酶2盖子1区 域中的突变位点，关注脂肪酶的解折叠模式，有针对性地引入二硫键突变，快速地筛选出热 稳定型二硫键突变，并且有效地提高其催化活性。
[0040] 1)本发明在脂肪酶盖子1区域的loops结构内（氨基酸106位至127位)或loops结构 与相邻结构间，引入二硫键突变5105-124,5112-137,5118-177，5122-196和5125-193。 [0041 ] 其中S105-124二硫键加强了 loops结构的内部联系，S118-177二硫键加强了 loops 结构与a4螺旋(氨基酸161位至179位)的联系，S122-196加强了 loops结构与a5螺旋(氨基酸 191位至208位）的联系，W上突变二硫键均能抑制盖子1区域的解折叠。对于亲本脂肪酶， S105-124、S118-177 和 S122-196 突变脂肪酶的 Tm 值分别提升 4.55°(：、3.87°(：、3.33°(：^5〇分 别提升 9.01、8.79、8.77°(：;50°(：半衰期分别提升7.40、7.24、6.60倍；
[0042] 2)本发明分别在脂肪酶的loops结构与a4螺旋、loops结构与巧螺旋之间引入二硫 键突变S118-177和S122-196,能稳定盖子1区域与酶活中屯、的氨键网络，并提高了脂肪酶催 化活性。相对于亲本脂肪酶，5118-177和5122-196突变脂肪酶的1(。3*值分别提升40.86%和 51.48%。
[0043] 综上所述的二硫键突变S118-177和S122-196均能有效地抑制脂肪酶盖子1区域的 解折叠，并提高了热稳定性和催化活力。
【附图说明】
[0044] 图1是473K条件下的氨基酸均方根涨幅曲线图。
[0045] 图2是473K条件下盖子1区域的解折叠亚区均方根波动随模拟时间变化曲线图。
[0046] 图3是腿MY-罗丹明B产酶平板筛选图：A-F分别为在紫外光下脂肪酶^口2、5105- 124、5112-137、5118-177、5125-193和5122-196的水解光圈照片。
[0047] 图4是还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度的结果图：泳道1-6分别为脂肪酶^口2、5105- 124、5112-137、5118-177、5125-193和5122-196的蛋白条带。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0049] 材料与试剂:pPICZaA-Lip2毕赤酵母表达载体由上海金斯瑞生物公司全基因合成 与构建；质粒提取试剂盒购自Omega贸易有限公司，K0D-PLUS突变试剂盒购自东洋纺公司， Protein Thermal Shift筛选试剂盒购自化ermo公司；T0P10大肠杆菌感受态细胞购自天根 生物公司，突变引物由上海生工生物工程公司合成；PmeI限制性内切酶购自化W化gland Biolabs公司；PCR产物纯化回收试剂盒购自大连宝生物公司；电转仪购自Bio-Rad公司； 化8、化8+26〇^11、￥?0、816￥、811￥培养基均按照11^1化〇肖611毕赤酵母表达试剂盒操作手册 配制，儀柱纯化试剂盒购自上海生工生物工程公司，其余试剂均为国内外购买的分析纯级 别。
[0050] 实施例1耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠模型建立与二硫键的筛选。
[0051 ] (1)从RCSB PDB晶体数据库中捜索下载Lip2的晶体结构(PDB ID:300D)，精度为 1.7 A，晶体为屯聚体，每个聚体各有不同程度的原子缺失，因此选取骨架原子完整的A链 作为初始模型，使用Swiss-pdb Vi ewer软件对A链缺失的侧链氨基酸进行修复，并使用 Disulfide by Design软件，将A链中切S120-切S123二硫键重构，在模拟中保留A链的所有 结晶水，除了S联体中屯、的HIS289使用HID质子化状态，其余组氨酸均设置为Gromacs默认 下抑=7.00的质子化状态，得到预处理模型；
[0化2] (2)使用63014〔5 5.04软件对预处理模型进行^维建模，使用411166计巧958-醒尺- ILDN力场的参数，将蛋白放置于十二面体的菱形盒子中央并填充TIP3P水分子与10个Na+中 和的体系电荷，并WSte邱est算法对整个体系进行能量优化。随后在等溫等压体系(NPT)体 系下，限制蛋白骨架重原子的运动，在5(K)ps内缓慢地从0K升溫至303K，充分平衡酶周围的 水分子，体系的溫度和压力偶联使用Berendsen算法，得到预平衡模型；
[0053] (3)将预平衡模型在化S内从303K缓慢地升溫至473K，然后在等溫等压体系(NPT) 下进行300ns模拟。范德华力截断半径、静电相互作用力截断半径、邻近捜索截断半径均根 据AMB邸力场推荐，设置为0.化m。所有的键长采用LINCS算法约束，长程静电相互作用力采 用PME算法，计算步长设置为2f S;
[0054] (4)对分子模拟所得轨迹进行分析：
[0055] 1)通过波动性分析盖子解折叠的相关区域：通过Gromacs自带的分析工具gmx_ rmsf计算Ca原子的均方根涨幅随解折叠进程的变化，分析骨架氨基酸均方根涨幅曲线，结 果如图1所示，我们发现盖子1区域(氨基酸83位至136位)具有较大的波动性。
[0056] 2)进一步分析盖子1区域解折叠关键位点:根据W上波动性分析的结果，我们划分 出四个亚区：氨基酸78位至87位，即防折叠;氨基酸88位至105位，即盖子1螺旋结构;氨基酸 106位至127位，即loop5结构；氨基酸126位至150位，即a3螺旋。通过Gromacs自带的分析工 具gmx_rmsf，计算每个亚区中每段结构的Ca原子RMSD随时间的变化曲线，W寻找分析盖子1 区域的解折叠关键位点。
[0057] 结果如图2所示，盼折叠和a3螺旋的波动性较小，而盖子1螺旋结构和loops结构的 波动性较大。于是我们判断loops结构是盖子1区域解折叠的关键结构，加强loops结构与周 围区域的联系能抑制盖子1区域的解折叠进程。
[0化引 （7)通过Disulfide by Desi即软件筛选存在于loop5结构（氨基酸106位至127 位)与周围区域之间的潜在突变位点。经过计算，共筛选出5对潜在的二硫键，分别为105- 124、112-137、118-177、122-196 和 125-193 二硫键。具体信息如表 1所示。
[0化9]主1 *
[0060]
[0061] 5段氨基酸序列如下所示：
[0062] S105-124突变脂肪酶：
[0063] VYTSTET 甜 ID 犯 SYNFF 邸 YA 化 ANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNWLIE 邸皿 PRLI 抑 VSGYLAVDHA SKQI化VIRGTHSLEDVITDIRIMQAPCTNFDLAANISSTATC孤CCVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDY QIAVTG 服 LGGAAALLFGINLKVNG 皿化 WTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFG 犯 NPDVSKVS 邸服 LYR 口 HRGDI VPQVPFWDGYQ 肥 SGEVFIDWPUHP 化 SNVVMCQGQSNKQCSAGN 化 LQQVNV 化 NHLQYFVTEGVCGI;
[0064] S112-137突变脂肪酶：
[00 化] VYTSTET 甜 ID 犯 SYNFF 邸 YA 化 ANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNWLIE 邸皿 PRLI 抑 VSGYLAVDHA SKQI化VIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLACNISSTATC孤CLVHNGFIQSYNNTCNQIGPKLDSVIEQYPDY QIAVTG 服 LGGAAALLFGINLKVNG 皿化 WTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFG 犯 NPDVSKVS 邸服 LYR 口 HRGDI VPQVPFWDGYQ 肥 SGEVFIDWPUHP 化 SNVVMCQGQSNKQCSAGN 化 LQQVNV 化 NHLQYFVTEGVCGI;
[0066] S118-177突变脂肪酶：
[0067] VYTSTET 甜 ID 犯 SYNFF 邸 YA 化 ANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNWLIE 邸皿 PRLI 抑 VSGYLAVDHA SKQI 化 VIRGT 服 LEDVITDIRIMQAPLTN 抑 LAANISSTCTC 孤化 VHNGFIQSY 順 TYNQIGPKLDSVIEQYPDY QIAVTG 服 LGGAAALLFGINLKCNG 皿化 WTLGQPIVGNAGFANWVDKLFFG 犯 NPDVSKVS 邸服 LYR 口 HRGDI VPQVPFWDGYQ 肥 SGEVFIDWPUHP 化 SNVVMCQGQSNKQCSAGN 化 LQQVNV 化 NHLQYFVTEGVCGI;
[0068] S122-196突变脂肪酶：
[0069] VYTSTET 甜 ID 犯 SYNFF 邸 YA 化 ANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNWLIE 邸皿 PRLI 抑 VSGYLAVDHA SKQI化VIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLMNISSTATCDCCLVHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDY QIAVTG 服 LGGAAALLFGINLKVNG 皿化 WTLGQPIVGNACFANWVDKLFFG 犯 NPDVSKVS 邸服 LYR 口 HRGDI VPQVPFWDGYQ 肥 SGEVFIDWPUHP 化 SNVVMCQGQSNKQCSAGN 化 LQQVNV 化 NHLQYFVTEGVCGI;
[0070] S125-193突变脂肪酶：
[0071] VYTSTET 甜 ID 犯 SYNFF 邸 YA 化 ANIGYCVGPGTKIFKPFNCGLQCAHFPNWLIE 邸皿 PRLI 抑 VSGYLAVDHA SKQI化VIRGTHSLEDVITDIRIMQAPLTNFDLMNISSTATC孤CLCHNGFIQSYNNTYNQIGPKLDSVIEQYPDY QIAVTG 服LGGAAALLFGINLKVNG皿PLVVTLGQPIVCNAGFANWVDKLFre犯NPDVSKVSKD服LYR口HRGD IVPQVPFWDGYQ肥SGEVFIDWPUHP化SNVVMCQGQSNKQCSAGN化LQQVNV化NHLQYFVTEGVCGI。
[0072] 编码上述序列的脂肪酶的核骨酸序列，如下所示：
[0073] S105-124突变脂肪酶的编码核骨酸序列：
[0074] gtgtacacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaa cattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttcccca acgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcc tccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggc tccttgtacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgttgtgtccacaatggct tcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactac cagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggcca cgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttct ttggcc过gg过g过过ccccg过tgtctcc过过ggtgtcc过过过g过ccg过过过gctct过ccg过过tc过ccc过ccg过gg过g过t过tc gtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccc tcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcagg tcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
[0075] S112-137突变脂肪酶的编码核骨酸序列：
[0076] gtgtacacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaa cattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttcccca acgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcc tccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggc tcctctgacgaactttgatcttgcttgtaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtcttgtccacaatggct tcatccagtcctacaacaacacctgtaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactac cagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggcca cgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttct ttggcc过gg过g过过ccccg过tgtctcc过过ggtgtcc过过过g过ccg过过过gctct过ccg过过tc过ccc过ccg过gg过g过t过tc gtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccc tcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcagg tcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
[0077] S118-177突变脂肪酶的编码核骨酸序列：
[007引 gtgtacacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaa cattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttcccca acgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcc tccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggc tcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctacttgtacttgtgatgactgtcttgtccacaatggct tcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactac cagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaagtgtaacggcca cgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttct ttggcc过gg过g过过ccccg过tgtctcc过过ggtgtcc过过过g过ccg过过过gctct过ccg过过tc过ccc过ccg过gg过g过t过tc gtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccc tcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcagg tcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcg tcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
[00巧]S122-196突变脂肪酶的编码核骨酸序列：
[0080] gtgtacacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaa cattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttcccca acgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcc tccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggc tcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgattgttgtcttgtccacaatggct tcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactac cagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggcca cgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtcggtaacgcttgttttgctaactgggtcgataaactcttct ttggcc过gg过g过过ccccg过tgtctcc过过ggtgtcc过过过g过ccg过过过gctct过ccg过过tc过ccc过ccg过gg过g过t过tc gtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccc tcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcagg tcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa；
[0081] S125-193突变脂肪酶的编码核骨酸序列：
[0082] gtgtacacctctaccgagacctctcacattgaccaggagtcctacaacttctttgagaagtacgcccgactcgcaaa cattggatattgtgttggtcccggcactaagatcttcaagcccttcaactgtggcctgcaatgtgcccacttcccca acgttgagctcatcgaggagttccacgacccccgtctcatctttgatgtttctggttacctcgctgttgatcatgcc tccaagcagatctaccttgttattcgaggaacccactctctggaggacgtcataaccgacatccgaatcatgcaggc tcctctgacgaactttgatcttgctgctaacatctcttctactgctacttgtgatgactgtctttgtcacaatggct tcatccagtcctacaacaacacctacaatcagatcggccccaagctcgactctgtgattgagcagtatcccgactac cagattgctgtcaccggtcactctctcggaggagctgcagcccttctgttcggaatcaacctcaaggttaacggcca cgatcccctcgttgttactcttggtcagcccattgtctgtaacgctggctttgctaactgggtcgataaactcttct ttggcc过gg过g过过ccccg过tgtctcc过过ggtgtcc过过过g过ccg过过过gctct过ccg过过tc过ccc过ccg过gg过g过t过tc gtccctcaagtgcccttctgggacggttaccagcactgctctggtgaggtctttattgactggcccctgatccaccc tcctctctccaacgttgtcatgtgccagggccagagcaataaacagtgctctgccggtaacactctgctccagcagg tcaatgtgattggaaaccatctgcagtacttcgtcaccgagggtgtctgtggtatctaataa〇
[0083] 实施例2突变脂肪酶表达质粒的构建
[0084] W耶氏解脂酵母脂肪酶2序列(Genbank ID:AJ012632.1)为目的片段，WEcoRI与 Notl为限制性酶切位点，全基因合成并构建pPICZaA-Lip2，W其为模板，通过两次连续反向 PCR方法引入二硫键突变。
[0085] W 表2 的 105C-F 和 105-R、112C-F 和 112-R、118C-F 和 118C-RU22C-F和 122C-R、 125C-F 和 125C-R 作为引物，分别得到 5105-124、5112-137、5118-177、5122-196和5125-193 的第一次扩增引物。
[0086] PCR 扩增条件为:941：2111111;94°(：1〇3、661：3〇3、681：5111111，10个循环。反应体系如下 表3所示。
[0087] 扩增产物WDnpI酶消化模板，在琼脂糖凝胶电泳检测突变条带大小后，用T4连接 酶连接环化过夜，随后使用热激法将突变质粒转入T0P10大肠杆菌感受态细胞，并涂布于 LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25iig/ml)平板37°C过夜培养，挑选阳性转化子进行质粒的测序。
[0088] 将测序正确的阳性转化子于化化Zeocin(Zeocin浓度为25iig/ml)液体培养基过夜 扩培后，提取质粒。W质粒为模板，W表2的124C-F和124C-RU37C-F和137C-RU77C-F和 177〇1?、196(：斗和196(：-1?、193(：斗和193(：-1?为引物，分别得到5105-124、5112-137、5118- 177、S122-196和S125-193的第二次扩增引物。PCR反应条件和体系同第一次PCR。
[0089] 表2突变引物汇总
[0094]扩增产物WDnpI酶消化模板，在琼脂糖凝胶电泳检测突变条带大小后，用T4连接酶连接环化过夜，随后使用热激法将突变质粒转入T0P10大肠杆菌感受态细胞，并涂布于
[C
[C
[C LLB+Zeocin(Zeocin浓度为25iig/ml)平板37°C过夜培养，挑选阳性转化子进行质粒的测序。
[0095] 实施例3:线性化质粒电转化毕赤酵母、转化子筛选与产酶筛选
[0096] 将测序正确的阳性转化子于化化Zeocin(Zeocin浓度为25iig/ml)液体培养基过夜 扩培后，提取质粒，W化el线性化处理并纯化回收，W总量为化g的质粒线性化产物与感受 态X33毕赤酵母混合电击转化。感受态毕赤酵母制备参照Invitrogen公司操作手册。电转程 序按照Bio-Rad公司推荐参数设置。
[0097] 电转完毕立刻加入ImL Imol/L山梨醇溶液，将菌液在30°C解育复苏1小时后，均匀 涂布于YPDS+Zeocin(Zeocin浓度为20化g/ml)抗性平板上筛选;培养3天后，将生长出的单 菌落挑取至BMMY-罗丹明B平板上进行产酶筛选，每12小时添加1(K)化甲醇诱导;诱导3天后 观察脂肪酶水解圈，筛选出正常产酶的基因工程菌。
[0098] 结果如图3所示，通过观察水解圈，发现突变脂肪酶S125-193严重影响了酶活性， 突变脂肪酶S105-124也一定程度影响了酶活性，其余突变脂肪酶的酶活性无明显变化。
[0099] 实施例4:工程菌摇床发酵
[0100] 参考Invi化ogen公司毕赤酵母表达试剂盒操作手册并稍作修改，修改内容如下： 把工程菌株单菌落接种到2mL YPDS-Zeocin(Zeocin浓度为20化g/mL)液体培养基中进行纯 化培养过夜，离屯、将细胞WBMGY液体培养基重悬并过夜培养，再接种至30mL BMMY液体培养 基，W25°C、300r/min培养96小时，每天补充甲醇至终浓度为1 %。
[0101] 实施例5:脂肪酶的分离和纯化
[0102] 1)超滤浓缩
[0103] 将lOOmL发酵液于4°C5000r/min离屯、5分钟后吸取上清液并用lOkDa超滤管于 SOOOr/min 4°C离屯、50min，收集浓缩酶液。
[0104] 2) -步法儀柱纯化
[0105] ①用5mL的含咪挫lOmM的结合缓冲液(Binding Buffer)平衡儀柱，充分除去残留 的乙醇；
[0106] ②浓缩酶液与含咪挫120mM的Binding Buffer按照1:1比例混合后添加至儀柱中 结合；
[0107] ③用15mL含咪挫60mM的清洗缓冲液(Washing buffer)充分洗脱杂蛋白；
[010引④用15mL含咪挫300mM的洗脱缓冲液化lution Buffer)洗脱目标蛋白；
[0109] ⑤纯化酶液按照上述条件超滤浓缩；
[0110] 得到纯化的脂肪酶，最后W还原性SDS-PAGE垂直电泳检测酶纯度，纯度均在99% W上，结果如图4所示。
[0111] 实施例6:突变脂肪酶的DSF筛选
[0112] 利用巧光定量PCR仪，按照Protein Thermal Shift试剂盒推荐反应程序测定突变 脂肪酶的Tm值，结果如表4所示，除S112-137突变脂肪酶外，其余的二硫键突变脂肪酶均大 幅度提升了 Tm。
[0113] 表4 DSF测定结果
[0114]
[0115] 实施例7:二硫键测定
[0116] 1)将纯化蛋白样品W含8M尿素的Tris-Gly缓冲液巧OmM，抑=8.00)稀释至0.5111邑/ mL。混合均匀后，分装2mL至两支4mL离屯、管中，A管用于测定游离琉基的浓度，B管用于测定 总半脫氨酸含量，并在B管中加入SOiiLP-琉基乙醇还原分子内的二硫键，于37°C保溫1小时。
[0117] 2)在B管中加入2mL 30%(w/v)S氯乙酸溶液，37°C水浴1小时，充分沉淀蛋白，随 后W1200化/min离屯、30min，弃上清，沉淀使用2mL 30%S氯乙酸溶液重悬润洗并再次离 屯、，惊干5min，挥发残余的0-琉基乙醇。最后用2mL含8M尿素的lYis-Gly缓冲液（50mM，pH = 8.00)重新溶解沉淀。每管吸取ImL做为空白组，并在剩余反应液中加入10化DTNB(4mg/血） 显色。解育30min后W1200化/min离屯、lOmin，除去沉淀，吸取上清，并稀释一定的倍数，于 412nm测定吸光值，保证其吸光值在0.2-0.8之间。二硫键数量由W下公式计算：
[011 引 甜=73.53XA412XD/V----------------(公式 1)
[0119] S册二甜1-甜2----------------(公式2)
[0120] SS = N/2X(S 册/SH1)----------------(公式 3)
[0121] 其中甜为琉基浓度(皿ol/mL)，SH3为成键半脫氨酸琉基浓度(皿ol/mU，SH2为游 离半脫氨酸琉基浓度(皿ol/mL)，SH1为总半脫氨酸琉基浓度(皿ol/mL)，A"2为除去空白样 品后的吸光光度值，D为稀释倍数，V为溶液体积(mU，SS为蛋白质内部二硫键的数目。
[0122] 经过二硫键测定，发现除S112-137突变脂肪酶未能形成二硫键，其余突变脂肪酶 均正确成键，结果如表5所示。
[0123] 亲5^.磕键擲日娜I吿
[0124]
[0125] 实施例8:突变脂肪酶热稳定性质和催化性质的测定。
[0126] Tso测定方法：W〇.lmg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中精确保溫15min，W50mM含 40mM的P-NPP的lYis-Hcl缓冲液为反应体系(pH=7.50)，精确反应lOmin后，添加 20%(w/v) 的S氯乙酸终止反应5min，在20 % (w/v)的碳酸钢溶液显色，测定410皿处吸光值，计算不同 溫度保溫后，脂肪酶残余的相对酶活。
[0127] ti/2测定方法：W0.1 mg/mL的纯化蛋白溶液在PCR仪中50°C精确保溫0、5、10、15、 30、45、60min，W50mM含40mM的P-NPP的lYis-Hcl缓冲液为反应体系（抑二7.50)，精确反应 lOmin后，添加20% (w/v)的S氯乙酸终止反应，20% (w/v)碳酸钢溶液显色，测定410皿处吸 光值，计算不同溫度保溫后，脂肪酶残余的相对酶活。
[0128] 最适反应溫度测定方法:将0.1 mg/mL的纯化蛋白溶液加入在30、35、40、45、50、55 °C条件下预热的50mM含40mM的P-NPP的lYis-Hcl缓冲液(pH = 7.50)，精确反应lOmin后，添 加20 % (w/v)的S氯乙酸终止反应，20 % (w/v)碳酸钢溶液显色，测定410皿处吸光值，计算 不同溫度下脂肪酶的相对酶活。W上结果如表6所示：
[0129] 表6热稳定性测定结果
[0130]
[0131] 可见，S105-124、S118-177 和 S122-196 突变脂肪酶的 15min 的 Tso 和 50°C 的 ti/2 均大 幅度提高，热稳定性得W增强。此外，突变脂肪酶的最适反应溫度均提升至40°C。
[0132] 催化性质的测定方法:将0.1 mg/mL的纯化蛋白溶液加入不同浓度的P-NPP底物，浓 度分别为0.050、0.065、0.080、0.100、0.150、0.200、0.350、0.500、0.650和0.800111]\1，在301： 下，精确反应5min后，添加20% (w/v)的S氯乙酸终止反应，再加入20% (w/v)碳酸钢显色， 在41化m处测定吸光值，根据P-NP标曲法计算绝对酶活，W非线性法拟合米氏方程，计算Km、 Kcat 和 Kcat/Km 值，
[0133]
[0134] 由于二硫键的引入，S105-124突变脂肪酶的催化能力大幅度下降，因此未作测定。 S118-177和S122-196突变脂肪酶的Kcat均显著提升，分别提高40.86%和51.48%。
[0135] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种高催化活性的耐热突变脂肪酶，其特征在于:是在耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2盖 子1区域的解折叠关键亚区中引入二硫键突变； 所述的盖子1区域的解折叠关键亚区为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的第106位~127位 氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述高催化活性的耐热突变脂肪酶，其特征在于:所述高催化活性的 耐热突变脂肪酶为S118-177突变脂肪酶或S122-196突变脂肪酶； S118-177突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示； S122-196突变脂肪酶的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。3. 编码权利要求2所述高催化活性的耐热突变脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于： 编码所述的S118-177突变脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示； 编码所述的S122-196突变脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4. 权利要求1所述高催化活性的耐热突变脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步 骤： (1) 通过Gromacs分子动力学软件，模拟耶氏解脂酵母脂肪酶2的解折叠过程;对所得轨 迹进行波动性分析，并将盖子1区域和邻近结构划分成几个亚区，统计分析每个亚区的波动 变化，筛选出盖子1区域的解折叠关键亚区，最后使用Disulfide by Design软件筛选潜在 二硫键突变位点； (2) 通过反向PCR突变，将所选出的氨基酸位点突变为半胱氨酸，并转入大肠杆菌中，进 行扩增培养、质粒提取和测序； (3) 将测序正确的突变质粒以Pmel限制性内切酶线性化处理，并电击转化至感受态毕 赤酵母X33中，进一步通过博来霉素抗性平板和BMMY-罗丹明B产酶平板筛选，得到对应的突 变工程菌； (4) 将突变工程菌在YPD液体培养基中进行扩繁培养后，转接至BMGY液体培养基进行去 抑制培养，最后接种BMMY液体培养基进行发酵，将菌液离心获取上清粗酶液 (5) 使用超滤管将粗酶液进行超滤浓缩后，使用镍柱一步法纯化，分离出带组氨酸标签 的脂肪酶蛋白，并以还原性SDS-PAGE检测蛋白纯度，获取纯化后的脂肪酶； (6) 通过DSF荧光检测测定突变脂肪酶的熔解温度，初步筛选有效的热稳定突变脂肪 酶； (7) 通过DTNB法测定蛋白质中的游离巯基浓度和总巯基浓度，计算蛋白分子内的二硫 键数目，检测引入的二硫键突变是否成键； (8) 通过p-NPP比色法测定突变脂肪酶的热稳定性指标：15min半失活温度、50°C下的半 衰期和最适反应温度； (9) 通过p-NPP比色法测定突变脂肪酶的催化活性指标:Km、Κα4ΡΚ_/Κω值，最终筛选出 高催化活性的耐热突变脂肪酶。5. 根据权利要求4所述高催化活性的耐热脂肪酶的制备方法，其特征在于： 步骤(1)为:使用Amberff99SB-匪R-ILDN力场的参数，将蛋白放置于十二面体的菱形盒 子中央并填充TIP3P水分子与10个Na+中和的体系电荷，并以Steepest算法对整个体系进行 能量优化；随后在等温等压体系体系下，限制蛋白骨架重原子的运动，在500ps内缓慢地从 0K升温至303K，充分平衡酶周围的水分子，体系的温度和压力偶联使用Berendsen算法，得 到预平衡模型;将预平衡模型在2ns内从303K缓慢地升温至473K，然后在等温等压体系下进 行300ns模拟；范德华力截断半径、静电相互作用力截断半径、邻近搜索截断半径均根据 AMBER力场推荐，设置为0.9nm;所有的键长采用LINCS算法约束，长程静电相互作用力采用 PME算法，计算步长设置为2fs;通过波动性分析盖子解折叠的相关区域:通过Gromacs自带 的分析工具gmxjmsf计算C。原子的均方根涨幅随解折叠进程的变化，分析骨架氨基酸均方 根涨幅曲线，得到具有较大波动性的盖子1区域;根据波动性分析结果，将盖子1区域和邻近 结构进一步分成亚区，通过Gromacs自带的分析工具gmx_rmsf，计算每个亚区中的C a原子 RMSD随时间的变化曲线，得到盖子1区域的解折叠关键亚区，最后使用Disulfide by Design软件筛选潜在二硫键突变位点。6. 根据权利要求4所述高催化活性的耐热脂肪酶的制备方法，其特征在于： 步骤(1)中所述的盖子1区域为第83位~136位氨基酸序列； 步骤（1)中所述的脂肪酶盖子1区域的解折叠关键亚区为耶氏解脂假丝酵母脂肪酶2的 第106位~127位氨基酸序列。7. 根据权利要求4所述高催化活性的耐热脂肪酶的制备方法，其特征在于： 步骤(2)中所述的大肠杆菌工程菌为大肠杆菌T0P10; 步骤(4)中所述的培养的条件为摇瓶培养96小时。8. 权利要求1所述的高催化活性的耐热脂肪酶在工业中的应用。
【文档编号】C12R1/84GK106047838SQ201610397111
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】管武太, 吴炜坤, 李力浪
【申请人】华南农业大学