专利名称：作物种子脂肪酶活性快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种种子中脂肪酶活性的检测方法。
背景技术：
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是一种甘油酯水解酶，可以水解脂肪分子中的甘油酯键，将脂肪(甘油三酯)水解为甘油及游离脂肪酸，是脂肪分解代谢中第一个参与反应的酶，所以一般认为是脂肪水解的调速酶，对脂肪的转化速率起着调控作用。其催化反应如下
脂肪酶广泛存在于动、植物及微生物中，对其脂类的消化和吸收过程中起重要作用。作物种子中的脂肪酶，其专一性不强，凡是由醇及有机酸构成的酯和脂肪都能被其分解或合成，不过不能作用得很完全。脂肪经水解后同样生成甘油和游离脂肪酸。
以水稻为例，稻谷中脂类含量约为3％，85％分布在稻谷的种皮和胚中。稻谷脂肪极易受储藏影响。稻谷在氧气及高温条件下储藏以后，脂肪极易发生水解、氧化，致使稻谷品质劣变。稻谷脂类的变化被认为是导致稻谷陈化的最主要因素。稻谷脂肪酶则是稻谷储藏过程中脂肪酸败变质的主要原因之一。随着稻谷的储藏，脂肪的分解，游离脂肪酸含量增加，脂肪酸组成发生变化，严重影响了稻谷的食用品质和营养品质。
长期以来，稻谷种子脂类与陈化的研究始终受到人们的关注，但对水稻脂肪酶的研究仅局限于米糠稳定化和大米风味营养的问题，而对水稻等作物种子脂肪酶与其储藏陈化变质的关系研究甚少。对于脂肪酶的检测，目前，还没有公认的统一的测定方法。通常的脂肪酶检测方法大致有碱滴定方法或用分光光度法两类。
碱滴定方法原理脂肪在脂肪酶的作用下产生游离脂肪酸，再利用酸碱中和反应使酸碱指示剂终点变色。缺点该方法只能用于大量整粒材料粉碎，且必须离心取上清，才能加底物反应，该方法的稳定性易受pH缓冲液，耗碱体积小及指示剂终点变色不明显影响。
分光光度法原理脂肪在脂肪酶的作用下产生游离脂肪酸，再利用脂肪酸与铜离子形成铜皂，经萃取后进行比色测定。缺点该方法也只能用于大量整粒材料粉碎，且必须离心取上清，才能加底物反应。在测定时，乳化体系、底物、体系的pH条件、温度、反应时间和稳定时间的变化，可能会使测定结果差别较大。另外，象PVA的聚合度、乳化液制备时的搅拌速度、体系的离子强度及终止剂的不同等也会影响测定结果，并且由于反应过程的复杂性，还会带进许多随机误差，难以确保测定的精密度。
发明内容
本发明的测定水稻等作物种子脂肪酶的酶活的快速检测方法主要原理在给定时间内，脂肪酶酶活大小与其催化水解生成的脂肪酸的物质的量成正比。可利用脂肪酶反应体系生成的脂肪酸的量的多少在有机溶剂中显色呈现深浅不同而得到区分。定量可用碱滴定方法或用分光光度计来测定脂肪酸的含量(脂肪酸与铜离子形成铜皂，经萃取后进行比色测定，铜皂在715nm附近有一宽的吸收峰)。
本发明的技术方案如下作物种子脂肪酶活性快速检测方法，包括以下步骤(1)、取种子中的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液配制粗酶液；(2)、配制由橄榄油和异辛烷组成的底物乳化液；(3)、配制乙酸铜指示剂；(4)、底物乳化液在35℃下预热后，加入粗酶液、CaCl2溶液、NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液，35℃水浴下搅拌至剧烈震荡，反应完毕后，加入HCl溶液，加热至沸腾，冷却后加异辛烷，再将溶液剧烈震荡混匀，静置后，观察颜色深浅，深则表示脂肪酶活性高，浅则表示脂肪酶缺失。
所述的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤(1)、取稻胚5～20粒或玉米胚1～2粒，或双子叶作物大豆、花生的种子子叶10～20mg，放入研钵中，加入1ml PH7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即为粗酶液；
(2)、底物乳化液的配制将橄榄油和异辛烷按2∶3体积比混合，经高速搅拌均质化，得到底物乳化液；(3)、铜指示剂的配制称取5g乙酸铜，溶解于100ml蒸馏水中，过滤，用吡啶将滤液的PH值调至6.1，得到铜指示剂；(4)、粗酶活力测定将5ml底物乳化液在35℃下预热后，加入1ml粗酶液、1ml 0.005mol/lCaCl2、1ml 0.5mol/l NaCl、5ml PH7.5 Tris-HCl缓冲液，35℃水浴下剧烈震荡搅拌30min；反应完毕后加入2ml 6mol/l HCl，加热至沸腾5min，冷却后加入5ml异辛烷，再将溶液剧烈震荡混匀，静置后，观察颜色深浅，深则表示脂肪酶活性高，浅则表示脂肪酶缺失。
精确测定上述第(4)步得到的溶液中，取上层异辛烷溶液2.5ml，(1)、加入1ml铜指示剂，取上层溶液，在715nm处测定其吸光度，以1ml PH7.5 Tris-HCl缓冲液代替粗酶液作空白；(2)、或置于干燥的锥形瓶中以酚酞作指示剂用0.025mol/1KOH乙醇溶液滴定生成的脂肪酸，在上述反应条件下，将每分钟催化产生1μmol脂肪酸所需的酶量定义为1个活力单位(U)。
本发明的快速检测方法优点①、能直接取稻胚等作物种子胚作材料，用量少，无需整粒种子，无需离心。
②、能利用脂肪酸的含量不同在有机溶剂中显色呈现深浅不同而得到区分，这样做具有过程简单、快速、稳定性好、结果准确等特点。因为提供脂肪酶存在和缺失的阴、阳对照，对结果判别一目了然。用于选育种子脂肪酶缺失和脂肪酶抑制酶活性高的水稻等作物品种，可从根本上解决稻谷陈化变质的问题。
③、不需复杂的实验条件和高精密的试验仪器。易于制成试剂盒，便于携带和推广。对使用者来说，不要求较高的文化，步骤简单，并可根据对照进行结果判断，易于操作；④、本快速显色方法也可用碱滴定方法或用分光光度计进行定量。
⑤、本快速显色方法也可用于其它作物如大豆、玉米、油菜、花生等种子脂肪酶活性检测。
本发明的快速检测方法用途①、可供农作物育种者在选择脂肪酶缺失和脂肪酶抑制酶活性高的材料、品系、品种中，根据脂肪酶酶活性有无判断脂肪酶或脂肪酶抑制酶基因的表达情况，决定该材料的利用价值。
②、粮食部门(特别是国家、地方、部队专用粮贮备库)中长期种子库、农民贮粮大户作为检测其耐贮藏性，加工品质的依据。
③、种子部门作为品种储藏特性鉴定的指标之一。
④、食品、医药行业作为原料质量标准之一。
具体实施例方式
一、粗酶的提取取稻胚5～20粒(玉米胚则取1～2粒，双子叶作物大豆、花生等取种子子叶10～20mg)放入研钵中，加入lml PH7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即为粗酶液。
二、底物乳化液的配制将橄榄油和异辛烷按2∶3(V/V)混合，经高速搅拌均质化，得到底物乳化液。
三、铜指示剂的配制称取5g乙酸铜，溶解于100ml蒸馏水中，过滤，用吡啶将滤液的PH值调至6.1，得到铜指示剂。
四、粗酶活力测定将5ml底物乳化液在35℃下预热后，加入lml粗酶液、lml 0.005mol/l CaCl2、lml 0.5mol/l NaCl、5ml PH7.5 Tris-HCl缓冲液，35℃水浴下搅拌30min(剧烈震荡)。反应完毕后加入2ml 6mol/l HCl，加热至沸腾5min，冷却后加入5ml异辛烷，再将溶液混匀(剧烈震荡)，静置后，观察颜色深浅。深则表示脂肪酶活性高，浅则表示脂肪酶缺失。
定量时，取上层异辛烷溶液2.5ml，①加入1ml铜指示剂，取上层溶液，在715nm处测定其吸光度。以1ml PH7.5 Tris-HCl缓冲液代替粗酶液作空白对照；②或取上层异辛烷溶液置于干燥的锥形瓶中以酚酞作指示剂用0.025mol/IKOH乙醇溶液滴定生成的脂肪酸，在上述反应条件下，将每分钟催化产生1μmol脂肪酸所需的酶量定义为1个活力单位(U)。
权利要求
1.作物种子脂肪酶活性快速检测方法，包括以下步骤(1)、取种子中的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液配制粗酶液；(2)、配制由橄榄油和异辛烷组成的底物乳化液；(3)、配制乙酸铜指示剂；(4)、底物乳化液在35℃下预热后，加入粗酶液、CaCl2溶液、NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液，35℃水浴下搅拌至剧烈震荡，反应完毕后，加入HCl溶液，加热至沸腾，冷却后加异辛烷，再将溶液剧烈震荡混匀，静置后，观察颜色深浅，深则表示脂肪酶活性高，浅则表示脂肪酶缺失。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)、取稻胚5～20粒或玉米胚1～2粒，或双子叶作物大豆、花生的种子子叶10～20mg，放入研钵中，加入1ml PH7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即为粗酶液；(2)、底物乳化液的配制将橄榄油和异辛烷按2∶3体积比混合，经高速搅拌均质化，得到底物乳化液；(3)、铜指示剂的配制称取5g乙酸铜，溶解于100ml蒸馏水中，过滤，用吡啶将滤液的PH值调至6.1，得到铜指示剂；(4)、粗酶活力测定将5ml底物乳化液在35℃下预热后，加入1ml粗酶液、1ml 0.005mol/l CaCl2、1ml 0.5mol/l NaCl、5ml PH7.5 Tris-HCl缓冲液，35℃水浴下剧烈震荡搅拌30min；反应完毕后加入2ml 6mol/l HCl，加热至沸腾5min，冷却后加入5ml异辛烷，再将溶液剧烈震荡混匀，静置后，观察颜色深浅，深则表示脂肪酶活性高，浅则表示脂肪酶缺失。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于上述第(4)步得到的溶液中，取上层异辛烷溶液2.5ml，(1)、加入1ml铜指示剂，取上层溶液，在715nm处测定其吸光度，以1ml PH7.5 Tris-HCl缓冲液代替粗酶液作空白对照；(2)、或取上层异辛烷溶液置于干燥的锥形瓶中以酚酞作指示剂用0.025mol/lKOH乙醇溶液滴定生成的脂肪酸，在上述反应条件下，将每分钟催化产生1μmol脂肪酸所需的酶量定义为1个活力单位(U)。
全文摘要
本发明公开了一种作物种子脂肪酶活性快速检测方法，是选取种子的脂肪酶的富集部位，配制粗酶液，在底物乳化液及其它试剂中反应，然后加异辛烷进行显色反应，并据此判定脂肪酶的活性。加乙酸铜指示剂，测量其吸光度，进行脂肪酶的量化测量。本发明方法也可用于水稻、大豆、玉米、油菜、花生等种子脂肪酶活性检测。可供农作物育种者在选择脂肪酶缺失和脂肪酶抑制酶活性高的材料、品系、品种中，根据脂肪酶酶活性有无判断脂肪酶或脂肪酶抑制酶基因的表达情况，决定该材料的利用价值。
文档编号C12Q1/44GK1680587SQ200510037720
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月27日 优先权日2005年1月27日
发明者张瑛, 吴跃进, 余增亮, 王钰, 佘德红, 宋美 申请人:中国科学院等离子体物理研究所