本发明属于组培技术领域，涉及一种利用组织培养技术获得马铃薯松散型胚性愈伤组织的诱导方法。
背景技术：
马铃薯在我国的广大农作物种子地区俗称土豆，马铃薯作为可食用"可布菜"可饲养"可加工的粮食作物，是一种在我国具有高产量"高效益的适合广大农作物地区耕作的粮食经济作物。近年来，我国广大地区通过对马铃薯的栽培与育种方面的广泛研究，取得了较多的突破，尤其是在马铃薯的组织培养方面取得了突出的成绩。
马铃薯生产上多利用块茎进行种植，新品种推广后，随着种植年限的增加，病毒也随着种薯无性世代繁殖的增加而在块茎中积累，导致田间经常出现植株变矮、簇生，茎秆细弱，分枝减少；叶片缩皱、卷曲、变小；叶色黄绿相间、失绿、颜色不正常，生长衰退；块茎变小、变形龟裂、内部坏死；产量逐年下降，品种的优良特性不断丧失、生产潜力和商品价值受到严重影响，而且随着使用年代的增加而急剧加重，最后失去种植价值，这种现象就是马铃薯种薯退化。目前，世界上公认马铃薯种薯退化是病毒危害造成的。
马铃薯脱毒的核心技术是茎尖组织培养(又叫分生组织培养)脱毒技术。是利用茎尖没有病毒的特性，在无菌操作条件下，经过茎尖剥离脱去主要危害马铃薯的病毒病及真菌、细菌性病害，用人工配制的培养基，培育出无毒试管苗(将茎尖组培苗进行病毒检测，淘汰仍带有病毒的茎尖苗)。然后把试管苗在温室或网棚内繁殖微型薯原原种，在隔离条件下，用原原种繁殖原种、用原种繁殖良种供生产使用。
目前，马铃薯脱毒培养主要依赖于茎尖脱毒技术，而采用松散型胚性愈伤组织进行组织脱毒的报道极少，其中有关于采用这一技术能否脱毒的争议，也有建立马铃薯松散型胚性愈伤组织的困难障碍。关于采用愈伤组织培养进行植物组织脱毒的研究已经有些报道，并在一些植物研究中获得了成功，但在马铃薯上还未见报道，因此可以初步判断可能是由于马铃薯胚性愈伤组织难于诱导的原因。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种马铃薯松散型胚性愈伤组织的诱导方法。本发明的目的就是建立一套马铃薯松散型胚性愈伤组织诱导体系，为马铃薯的脱毒培养奠定基础，同时还可以用于体细胞诱变育种研究，为马铃薯的育种方法拓宽了途径。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种马铃薯松散型胚性愈伤组织的诱导方法，步骤如下：
⑴马铃薯外植体的准备
选择带有外皮的部分；并不要选择带芽的部位进行消毒处理；
⑵马铃薯松软愈伤组织的诱导
将消毒处理好马铃薯外植体接种到事先配制好的1/2-1/4MS+1.0-2.0mg/L2,4-D+15-20g/L蔗糖的培养基上；进行松软愈伤组织的诱导培养；每个容器中加入30-50ml培养基；培养条件为：24-25℃,24h光照；光照强度为1000Lux；经过30-40d培养；在马铃薯切块的外围就可以诱导出质地柔软、浅白色的愈伤组织；
⑶马铃薯松散型愈伤组织的诱导
将诱导出的马铃薯松软愈伤组织转移到MS+0.5-1.0mg/LBA+0.25-0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上进行松散型愈伤组织的诱导；转移愈伤组织过程中要小心；否则会弄伤软的愈伤组织；使得愈伤组织过小而死亡；培养中10-14d继代一次；在继代过程中应尽可能选择质地较硬的愈伤组织；将变色、细软的愈伤组织在继代过程中逐渐淘汰；每个容器中加入20-40ml培养基；培养条件为：23-24℃,24h光照；光照强度为2000-2500Lux；经过3-5次继代培养；即可诱导出生长速度适中、质地较硬、结构松散的浅绿色愈伤组织；
⑷马铃薯松散型胚性愈伤组织的诱导
将步骤⑶中诱导出的马铃薯松散型愈伤组织在超净台中取出；转接到MS+1.0-1.5mg/LBA+0.5-1.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上进行松散型胚性愈伤组织的诱导；在愈伤组织培养过程中；每15-20d继代一次；继代时应选择结构松散、颜色浅绿色并呈现颗粒状的愈伤团保留下来；同时要结合显微镜进行镜检；进一步确定愈伤组织的胚性；经过5-8次继代；大约100-120d时间；即可诱导出马铃薯松散型胚性愈伤组织；诱导时采用100ml三角瓶；由于继代时间较长；本步骤要求在每个三角瓶中加入40ml的培养基；培养条件为：21-22℃,24h光照；光照强度为2500-3000Lux。
而且，所述步骤⑴的具体操作如下：
取马铃薯块茎在自来水中反复冲洗；用解剖刀切取马铃薯块茎；要选择带有外皮的部分；并不要选择带芽的部位；将切下的马铃薯块茎放到超净台中；再用解剖刀切成直径大约为5-10mm的小块；然后采用70％的乙醇浸泡块茎30S；再用40％的安替福民水溶液进行表面消毒处理；消毒时间为20Min；消毒结束后；将块茎在无菌水中反复冲洗5次；每次10Min；然后用无菌的吸水纸将多余的水分吸干；并用解剖刀将块茎最外部的一层组织切除。
本申请的优点和积极效果如下：
本发明的目的就是要采用这一脱毒新途径建立马铃薯无毒苗培养体系，为生产上获得优质无毒的马铃薯种源。采用松散型胚性愈伤组织进行脱毒培养的方法较其它依靠愈伤组织脱毒的方法具有以下几点优势：一是，松散型胚性愈伤组织中细胞间彼此联系较少，为病毒在细胞间的转移制造了障碍；二是，松散型胚性愈伤组织比一般愈伤组织生长速度要快，病毒在细胞间的传播会因此受到抑制，会经过多代分化后获得无毒的细胞；三是胚性愈伤组织很容易获得再生苗，一旦愈伤组织脱毒，即可通过胚状体再生的方式获得再生苗；四是松散型胚性愈伤组织再生方式多为单细胞再生，因此不会由于再生芽中没有脱毒细胞的影响而使得再生苗再次感染带毒，从而简化了脱毒步骤，节省了时间、提高了效率。因此总的来看就是可以获得高效、优质的无毒材料。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
一种马铃薯松散型胚性愈伤组织的诱导方法，步骤如下：
⑴马铃薯愈伤组织培养外植体的准备
将“中薯5号”马铃薯在自来水中反复冲洗，用解剖刀切取马铃薯块茎，要选择带有外皮的部分，并不要选择带芽的部位。将切下的马铃薯块茎放到超净台中，再用解剖刀切成直径大约为5mm的小块。然后采用70％的乙醇浸泡块茎30S，再用40％的安替福民水溶液进行表面消毒处理。消毒时间为20Min，消毒结束后，将块茎在无菌水中反复冲洗5次，每次10Min，然后用无菌的吸水纸将多余的水分吸干，并用解剖刀将块茎最外部的一层组织切除，因为这些组织在消毒液的作用下容易褐变死亡，影响愈伤组织诱导效果。处理后的马铃薯块茎即可作为愈伤组织初步诱导的外植体。
⑵马铃薯松软愈伤组织的诱导
将消毒处理好的马铃薯块茎外植体接种到事先配制好的1/4MS+1.0mg/L2,4-D+15g/L蔗糖的松软愈伤组织诱导培养基上。采用100ml三角瓶作为培养容器，每个三角瓶中加入30ml培养基。培养条件为：25℃,24h光照，光照强度为1000Lux。经过40d培养，就可以诱导出质地柔软、浅白色的愈伤组织。
⑶马铃薯松散型愈伤组织的诱导
将诱导出的马铃薯松软愈伤组织转移到MS+0.5mg/LBA+0.25mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的培养基上进行松散型愈伤组织的诱导。转移愈伤组织过程中要小心，否则会弄伤软的愈伤组织，使得愈伤组织过小而死亡。培养中10d继代一次，在继代过程中应尽可能选择质地较硬的愈伤组织，将变色、细软的愈伤组织在继代过程中逐渐淘汰。采用100ml三角瓶作为培养容器，每个三角瓶中加入20ml培养基。培养条件为：24℃,24h光照，光照强度为2000Lux。经过3-5次继代培养，即可诱导出生长速度适中、质地较硬、结构松散的浅绿色愈伤组织。
⑷马铃薯松散型胚性愈伤组织的诱导
将上一步骤中诱导出的马铃薯松散型愈伤组织在超净台中取出，在超净台中用解剖刀切成直径为5mm的小块，小心地转移到转接到MS+1.0mg/LBA+0.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖的松散型胚性愈伤组织诱导培养基上进行再次培养。在愈伤组织培养过程中，每20d继代一次，继代时应选择结构松散、颜色浅绿色并呈现颗粒状的愈伤团保留下来。同时要结合显微镜进行镜检，进一步确定愈伤组织的胚性。经过5-8次继代，大约120d时间，待处理中出现胚性愈伤组织时停止试验。愈伤组织从外观上出现了较大的变化，其中一些愈伤组织表面出现瘤状颗粒，结构松散、质地紧密，在显微镜下可以看到愈伤组织细胞个体较小、细胞质浓度增大、细胞核较大，细胞处于旺盛的分裂状态，表现出高度的胚性状态。诱导试验采用100ml三角瓶，在每个三角瓶中加入40ml的培养基。培养条件为：22℃,24h光照，光照强度为2500Lux。