本发明涉及组织培养技术领域，更具体地，涉及一种两面针愈伤组织的诱导培养基及诱导方法和应用。
背景技术：
两面针（Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.）为芸香科花椒属植物，具有很高的药用价值，其干燥根入药，为我国南方地区常见中药，1977年开始被收入《中国药典》。两面针具有行气止痛、活血化瘀、祛风通络之功效。其中的氯化两面针碱可以抗肝癌和乳腺癌；两面针还是牙膏工业的原料。两面针分布于我国南方各省，生于山野坡地灌木丛中。两面针分布虽然广阔，但资源并不丰富。由于两面针用量巨大，其野生资源几近枯竭，市场上两面针药材的伪品因此也较多。恢复两面针的资源首先需要种苗。可以通过种子萌发、扦插繁殖和组织培养获得种苗。另外两面针种质资源较为缺乏，随着细胞融合技术和基因转化技术的不断发展，对植物在分子水平上改进可大大促进种质资源的扩大，对植物在分子水平的改进需要先对植物进行处理，一般是诱导形成愈伤组织，现有技术中还没有两面针的愈伤组织的培养方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种两面针愈伤组织的诱导培养基。
本发明的第二个目的是提供一种两面针愈伤组织的诱导方法。
本发明的第三个目的是提供上述诱导培养基或者愈伤组织的诱导方法的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
6-糠基氨基嘌呤在两面针愈伤组织诱导中的应用，所述6-糠基氨基嘌呤在培养基中的浓度为0.2～6 mg/L。
发明人研究发现在两面针中加入6-糠基氨基嘌呤（又名激动素，简称KT）可诱导出两面针愈伤组织，利用愈伤组织进行组织培养或者细胞融合和基因转化的材料，为两面针种质资源的扩大提供基础。
优选地，所述6-糠基氨基嘌呤在培养基中的浓度为1～4 mg/L。
本发明还提供一种两面针愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA。
更优选地，所述愈伤组织诱导培养基为MS+4.0 mg/L KT＋2.0 mg/LNAA。
本发明还提供一种两面针愈伤组织诱导的方法，是以两面针无根苗的茎段为外植体，进行愈伤组织的诱导；所述愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA。
优选地，愈伤组织诱导培养条件为：温度23～27℃，相对湿度40%～60%，光照强度为32.5～34.5 μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半。
优选地，两面针无根苗的茎段是取带腋芽的两面针的幼嫩茎段，消毒后，再接种于于MS+1.0 mg/L～2.0 mg/L KT＋0.2 mg/L～0.4 mg/L NAA培养长成3～4cm的无根苗，再截取无根苗的茎段即可。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以两面针无根苗的茎段为外植体，在含有适宜激素配比的MS培养基上诱导愈伤组织形成；所得到的愈伤组织可以为两面针细胞融合或者基因转化研究提供材料，建立技术平台，为种子资源的改良打下基础，利用本发明所述愈伤组织进行后续的组织培养，建立的组织培养体系，提高了繁殖系数（现有通过丛生芽的诱导来实现增殖的方法的增殖系数为2.4～3.6，而本发明方法的增殖系数可以达到5.0），为大量种植两面针奠定基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
植物材料：两面针无根苗茎段。带腋芽的两面针幼嫩茎段采自广州中医药大学药用植物园，用70%乙醇浸泡30秒，再用0.1%HgCl2浸泡8分钟，用0.5%NaClO浸泡10分钟，最后用无菌水冲洗3次，接种于MS＋2.0 mg·L-1 KT＋0.4 mg·L-1 NAA中培养，12天后开始生长，约12周后可长成3～4 cm的无根苗。
以MS培养基为基础培养基，添加蔗糖30 g·L-1，卡拉胶8.0 g·L-1，pH5.8～6.0作为基础培养基。植物生长物质包括α－萘乙酸（α-naphthalene acetic acid，NAA）、吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）、6-糠基氨基嘌呤（kinetin，KT）。
愈伤组织诱导率：分别在茎段愈伤诱导培养第10、20、30天，观察愈伤组织生长情况，统计诱导率（诱导率=(出愈外植体数/接种外植体总数)×100%）。
愈伤组织分化率：愈伤组织分化培养4周或8周，统计愈伤组织分化率（分化率=(分化出芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织总块数)×100%）。
芽增殖系数：芽分化培养8周后，转接至增殖培养基中培养。培养4周或8周统计芽增殖系数(芽增殖系数=全部增殖芽数/接种芽数)。
生根率：生根培养8周，统计生根率（生根率=(生根的芽数/接种的芽数)×100%）。
实施例1
一、愈伤组织诱导
在无菌条件下将无根苗的茎切成约6 mm的小段，水平放置在愈伤组织诱导培养基的表面（愈伤组织诱导培养基的组成具体见表1）；每瓶接种3段；每种培养基各接种25瓶。培养条件：温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，光照强度为（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半，一个月继代1次。
两面针茎段在三种不同植物生长物质组合构成的诱导培养基（A1、A2、A3培养基由基础培养基和表1中的植物生长物质组成，其中基础培养基的含量相同）中都能产生愈伤组织，说明适当浓度的KT和NAA能够诱导产生愈伤组织。比较三种培养基产生愈伤组织的效果，在A3培养基中的诱导率最高，达到74.84%；其次是A1培养基，诱导率为66.84%；最差的是A2培养基，诱导率只有58.76%。产生的愈伤组织的质量也有不同，在A3和A1上产生的愈伤组织的颜色是淡黄色、颗粒状、质地疏松而且湿润的；而在A2上产生的愈伤组织的颜色是淡黄色、块状、质地干硬的；因此A3和A1培养基上产生的愈伤组织比较适宜作为愈伤组织分化的材料，由于A3培养基上的诱导率最高，所以选取A3培养基诱导的愈伤组织进行分化实验。
二、愈伤组织的分化
将继代1次，在A3培养基中诱导的愈伤组织块切成5 mm×5 mm大小，接种于分化培养基中（表2，培养基B1、B2、B3由基础培养基和表2的植物生长物质组成，其中基础培养基的含量相同），每瓶接种4块，每种培养基各接种50瓶。培养1个月后，将在培养基B3上产生的愈伤组织再转移到另4种分化培养基中培养（表3），每个培养皿接种8块，每种培养基各接种12个培养皿。培养条件：温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，光照强度为（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半。
结果见表2。在培养基B1中没有芽的分化。而在培养基B2和B3上可以分化出芽，但分化率低，只有4.50%和12.50%，每块愈伤组织的芽平均数为1.00和1.30。在培养基B1上没有分化出芽的原因可能是KT的浓度太低。从表2的结果可以看出，三种培养基中，含4 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA的B3培养基对愈伤组织分化有一定的效果，但效果还不够理想。为了进一步提高芽的分化率，将在B3进行过分化培养的不含芽的愈伤组织，转移到其他四种分化培养基中继续进行芽的分化培养（表3，B3、B4、B5、B6由基础培养基和表3的植物生长物质组成，其中基础培养基的含量相同）。
从表3结果可以看出，四种含植物生长物质组合的培养基都可以促进芽的分化，在培养基B4中的愈伤组织的分化效果较好，芽分化率为36.46%，显著高于在其它三个培养基中的分化率，且每块愈伤组织的平均芽数达到3.30。在培养基B3、B5和B6的中的愈伤组织芽分化率分别为20.83%、16.67%和23.96％，它们之间没有显著性差异。四种培养基中，B4的KT含量最高，分化出的芽较小、颜色偏黄、叶片细小，说明芽的质量较差。因此表3的结果表明，高浓度的KT对芽的分化有利，但KT的浓度太高，会使芽的质量变差。
综合表2和表3的结果分析，在芽分化培养中，除了KT的浓度不能过低外，生长素的浓度对芽的分化率也有影响，在KT浓度相同的处理中，生长素浓度高，则有芽分化率高的趋势。另外，表3的B3培养基的芽分化率高于表2中的B3培养基的芽分化率，原因可能是表3的愈伤组织的培养时间较长。
三、芽的增殖
将来自分化培养基B4的带芽愈伤组织转接到芽增殖培养基中（表4），每个培养皿接种6块愈伤组织，每块愈伤组织带1～2个芽，每种培养基各接种8个培养皿。4周后继代1次，接种到培养瓶中，每瓶接种3块带1～2个芽的愈伤组织，每种培养基各接种16瓶。培养条件：温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，光照强度为（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半。
B4培养基中芽的分化率明显高于其它培养基，但芽的质量较差，可能的原因是B4培养基的KT浓度过高。为了获得高的芽分化率而又得到好质量的芽，将B4培养基上的芽重新转接到低KT浓度的B3、B5和B6培养基中进行增殖培养。结果见表4。从表4可以看出，培养4周和8周后，芽增殖效果最好的是B6培养基，其芽增殖系数分别是3.33（培养4周）和5.00（培养8周）。其次是B3培养基，培养4周和8周后，芽增殖系数分别是2.66和3.50。增殖系数较高的这两个培养基的KT浓度都是4.0 mg·L-1，它们的芽生长速度较慢，芽稍短，但芽的颜色较绿，说明芽的质量是好的。B5培养基上的增殖效果最差，它的KT浓度为2.0 mg·L-1。所以，在增殖培养中，KT的浓度过低不利于芽的增殖。
比较B5和B6培养基中的植物生长物质组成，它们的KT与NAA的浓度比值都是5，但两者芽的增殖效果却不同，这说明当细胞分裂素和生长素比值相同，而它们的绝对浓度不同时，芽的分化能力也有差异，也就是说，芽的分化能力不但受细胞分裂素与生长素的比值的影响，还受两种激素的绝对浓度影响。4.0 mg·L-1 KT和0.8 mg·L-1 NAA的生长物质的组合更有利于芽的增殖。
四、生根培养
增殖培养后，将来自培养基B6的高于2 cm的芽块（带少量愈伤组织）转接到1/2 MS培养基中进行生根诱导（表5），每瓶接种4块愈伤组织，每块带1～3个芽，每种培养基接种20瓶。培养条件：温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，光照强度为（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期为光照与黑暗时间各半。
取生长在B6培养基中高于2 cm的芽进行生根培养。培养4周后发现芽下部开始分化形成根。培养8周后的生根情况见表5。三种生根诱导培养基（C1、C2、C3培养基由基础培养基和表5的植物生长物质组成，其中基础培养基的含量相同）中，生根效果较好的是C1和C2，它们的生根率分别是66.75%和46.85%，根多且长；而C3培养基的生根率较低，为25.30%，根也较短。表5的结果表明，随着KT浓度的升高，生根率下降。生根诱导最好的培养基是C1。
五、炼苗与移栽
将在C1培养基中获得的再生苗进行锻炼。把培养瓶放置在室内靠窗处接受散射的自然光照射3天，然后打开培养瓶盖，在相同位置又放置3天。之后取出再生苗，用清水洗净植株基部的培养基，移栽到含1/3砂、2/3土的培养基质中。除了注意在苗期时遮荫外，不需要特别护理。移栽后的两面针幼苗生长良好，移栽成活率为91%。
对比例1
实验方法同实施例1，唯一不同的是，本对比例中培养基不含有KT，其愈伤组织诱导率只有1.34～5.31%。