专利名称：一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法
技术领域：
本发明涉及一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法。
背景技术：
单倍体育种，主要是指通过花药培养或游离小孢子培养(以下简称小孢子培养)的方式得到单倍体植株，然后经秋水仙素等处理加倍为双单倍体，从而直接获得纯合的品系。无论是花药培养还是小孢子培养，从开始培养到获得完全纯合的品系一般只需要1年左右的时间。对果树来说，单倍体育种有可能使某些原来无性繁殖的果树也能用种子繁殖，并为基因型高度杂合的果树遗传性研究提供纯系材料，从而促进果树遗传理论工作的研究。因此，该项技术若应用于育种实践，必将大大加快育种的速度，节省大量的人力物力，是一项对育种工作极其有用的生物技术。
1953年，Tuleck用银杏花粉在人工培养基上第一次成功地诱导形成单倍体愈伤组织Guha和Maheshwari(1964)首次成功地从毛叶曼陀罗(Datura inoxia)花药培养中获得单倍体植株，随后证实是由胚状体途径获得的单倍体花粉植株，从此开创了利用花粉培育单倍体的新途径，近30年来，利用花药培养产生单倍体植株的技术已被广泛应用到10个科，24个属，34个种的250多种植物上。果树花药培养单倍体的研究起步较晚，20世纪70年代末到80年代初先后在柑橘、苹果、葡萄、草莓、荔枝、龙眼等树种上取得了成功。我国至今已经培育出了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株。枣(Ziziphus jujuba Mill.)是我国特色优势果树，关于枣的花药培养，迄今只在金丝小枣上有过报道，但存在愈伤组织诱导率较低(43.1％)的问题，在离体诱导冬枣花药愈伤组织方面尚未见相关报道，因此提高枣花药愈伤组织诱导率，将大大加快枣的单倍体育种进程。
发明内容
本发明建立了冬枣花药愈伤组织诱导技术体系，能保证获得冬枣花药的愈伤组织，并实现其增殖，为深入开展枣的单倍体育种研究提供了一种新的技术平台。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是首先建立合适的冬枣花药外植体的消毒方法，再对外植体进行初始愈伤组织的诱导，通过不同基本培养基、不同碳源，不同植物生长调节剂的调控，筛选出最适冬枣花药愈伤组织诱导培养基，获得花药的初始愈伤组织；然后在此基础上进行花药愈伤组织的增殖培养基筛选，以达到使愈伤组织快速增殖的目的。
本发明的具体内容，即离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法如下 外植体采集与消毒在5～6月选取田间直径为0.3～0.6cm、花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，4℃冰箱预处理1～3d。流水冲洗1～2h，超净工作台上将花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl2溶液中8min，无菌水冲洗3～4次后剥取花药。
培养条件 基本培养基为MS培养基，麦芽糖15～20g/L，琼脂3.5g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。光照周期为15小时光照、9小时黑暗。光照强度800～1000Lux。温度控制在27±1℃。
启动培养 将无菌花药接种在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.5-10mg/L+NAA0-0.5mg/L的培养基上进行暗培养三周，然后转至弱光下(800～1000Lux)培养。花药逐渐产生黄绿色的、松散颗粒状的愈伤组织，且随培养时间的延长逐渐增多。
增殖培养 将获得的初始愈伤组织转接到MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.1-0.5mg/L+NAA0-0.5mg/L的培养基中进行增殖培养。
本发明专利的有益效果是，通过对冬枣花药外植体的消毒、初始愈伤组织诱导、愈伤组织的增殖培养，可快速获得大量花药愈伤组织，诱导率高达86.23％，从而攻克了枣花药不易获得愈伤组织这一大技术难题，并大大提高了花药愈伤组织的诱导率(86.23％)。该发明可用于获得大量冬枣花药愈伤组织，为冬枣单倍体育种奠定基础，并可为其他枣品种的花药培养提供参考。
图1中是冬枣花药在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.5-1.0mg/L+NAA0-0.5mg/L的培养基上培养40～50d时获得的初始愈伤组织。
图2中是初始愈伤组织在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.1-0.5mg/L+NAA0-0.5mg/L的培养基中的增殖培养。
具体实施例方式 在5～6月选取田间直径为0.3～0.6cm、花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，4℃冰箱预处理1～3d。流水冲洗1～2h，超净工作台上将花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl2溶液中8min，无菌水冲洗3～4次后剥取花药。启动培养时将无菌花药接种在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.5-1.0mg/L+NAA0-0.5mg/L的培养基上进行暗培养三周，然后转至弱光下(800～1000Lux)培养。花药逐渐产生黄绿色的、松散颗粒状的愈伤组织，且随培养时间的延长逐渐增多。增殖培养时将获得的初始愈伤组织转接到MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.1-0.5mg/L+NAA0-0.5mg/L的培养基中进行增殖培养，愈伤组织可快速增殖。以上培养基基本培养基为MS培养基，麦芽糖15～20g/L，琼脂3.5g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。光照周期为15小时光照、9小时黑暗。光照强度800～1000Lux。温度控制在27±1℃。
权利要求
1.一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法，其特征在于通过对冬枣花药进行组织培养，获得其愈伤组织，愈伤组织诱导率达86.23％。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下培养步骤
(1)在5～6月选取田间直径为0.3～0.6cm、花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，4℃冰箱预处理1～3d后流水冲洗1～2h，在超净工作台上将流水冲洗后的花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl2溶液中8min，然后用无菌水冲洗3～4次，获得无菌花蕾；
(2)经步骤(1)将获得的无菌花蕾剥取花药接种在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.5-1.0mg/L+NAA0-0.5mg/L的培养基上进行暗培养三周，然后转至弱光下(800～1000 Lux)培养，培养30～50d后产生初始愈伤组织；
(3)经步骤(2)获得的初始愈伤组织，转接到MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.1-0.5mg/L+NAA0-0.5mg/L的增殖培养基中进行增殖培养。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于基本培养基为MS，含麦芽糖15～20g/L，琼脂3.5g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0，光照周期为15小时光照、9小时黑暗，光照强度800～1000Lux，温度控制在27±1℃。
全文摘要
一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法，即通过冬枣花药的组织培养获得其愈伤组织，愈伤组织诱导率达86.23％，包括外植体采集、消毒、初始诱导、增殖培养。在5～6月选取田间直径为0.3～0.6cm、花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，4℃冰箱预处理1～3d。流水冲洗1～2h，超净工作台上将花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl2溶液中8min，无菌水冲洗3～4次后剥取花药，启动培养时将无菌花药接种在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.5－1.0mg/L+NAA0－0.5mg/L的培养基上进行暗培养三周，然后转至弱光下(800～1000Lux)培养。花药逐渐产生黄绿色的、松散颗粒状的愈伤组织，且随培养时间的延长逐渐增多。增殖培养时将获得的初始愈伤组织转接到MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ0.1－0.5mg/L+NAA0－0.5mg/L的培养基中进行增殖培养，愈伤组织可快速增殖。以上培养基基本培养基为MS培养基，麦芽糖15～20g/L，琼脂3.5g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。光照周期为15小时光照、9小时黑暗。光照强度800～1000Lux。温度控制在27±1℃。该方法可在70d左右获得大量冬枣花药愈伤组织。
文档编号A01G7/00GK1934932SQ20061013909
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月9日 优先权日2006年10月9日
发明者刘孟军, 王娜, 赵锦, 秦子禹 申请人:河北农业大学