一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法
【专利摘要】一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法。将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；从发酵液中提取大肠杆菌基因工程菌湿菌体，用磷酸盐缓冲液重悬，获取反应液；用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，与反应液进行催化反应，后分离干燥获得海藻糖晶体。采用本发明的方法，自诱导培养基培养出来的细胞不需要经过外源处理，直接在磷酸盐缓冲体系中进行全细胞催化反应合成海藻糖，便可实现高效催化。
【专利说明】
一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，属于功能糖醇合成技术领域。【背景技术】
[0002]海藻糖(Trehalose)又名罩糖，是一种由葡萄糖分子以a，a-l，l-糖昔键相连而成的非还原性二糖，它广泛地存在于微生物、虾类、昆虫、脊椎动物以及植物等之中。海藻糖对于生物体及生物大分子、生物膜等都具有良好的非特异性保护作用，使得细胞对不良环境条件(如高温、冷冻、脱水、高渗透压等)具有高效的抗逆性，因此被誉为“生命之糖”。此外， 海藻糖还具有性质稳定、甜度低、人类吸收缓慢以及不形成龋齿的特点。因此，海藻糖被广泛应用于食品、医药、化妆品等精细化学品领域之中。
[0003]海藻糖的商品化制备始于20世纪40年代捷克用酒精从面包酵母中提取海藻糖。现代的制备方法主要包括化学合成法、微生物发酵法、酶转化法。其中，化学合成法产率低，分离困难，难以工业化;微生物发酵法转化率较低，发酵副产物较多，使得海藻糖的提取、精制困难。酶转化法是目前海藻糖生产的主要途径，许多生物体内部有合成海藻糖的酶系，可以利用基因工程手段高效表达出来，利用这些酶与底物进行催化反应，可以大规模的生产海藻糖。1995年，日本首次实现了酶法制备海藻糖的大规模生产，使海藻糖的价格大幅下降。 但是，海藻糖合酶属于胞内酶，酶法生产海藻糖过程中通常要破碎菌体，提取与纯化海藻糖合成酶系，而在破碎及纯化过程中容易造成酶的损失，这无疑加大了企业的生产成本。
[0004]利用全细胞催化合成海藻糖可以免去细胞破碎工序，提高酶的稳定性和利用率， 得到高纯度的产物，从而降低生产成本。但是，由于微生物细胞膜的通透性屏障，使反应底物和产物难以自由出入细胞，生物催化的效率明显低于纯酶催化反应体系。解决这个技术问题的关键是通过对细胞进行通透性处理，增强胞内酶的使用率，从而提高海藻糖在反应体系中的浓度。
[0005]现有技术中，提高细胞通透性的处理方法主要包括以超声法、冻融法为物理法;有机溶剂和表面活性剂等化学法。
[0006]物理法的技术原理为通过造成目标细胞细胞壁以及细胞膜的结构性损伤未提高其通透性。例如，文献通过冻干法来破坏细胞的分子结构，可以有效增加细胞的通透性，提高酶的催化活力。(薛璐，马莺.透性化海藻糖合酶的研究[J].食品与发酵工业，2001，28 (1): 16-18.)物理法提高通透性的技术缺陷为工业放大过程比较困难，实际生产中采用物理法提高通透性的技术有待设计与检验。
[0007]化学法的技术原理为渗透剂透过细胞壁后与细胞膜的脂质反应，通过破坏蛋白质的氢键使之变性，从而破坏细胞的结构和流动性，使细胞膜失去原有的对胞内外物质的传递调控能力。化学法添加的试剂多为毒性极强的有机试剂，例如，甲苯，二甲基亚砜，十六炕基三甲基澳化镜等等。因此，化学法中有毒试剂的残留会给用于食材的海藻糖生产带来极大的安全隐患，而且有机试剂的残留也会给海藻糖的下游分离纯化生产带来极大压力，不利于成本的降低。另外，化学法在增强细胞通透性的同时，还会造成酶的破坏。[00〇8]自诱导(auto-1nduct 1n)是最早由纽约厄普顿的布鲁克黑文国家实验室的 Studier等提出的一种利用培养基中碳源转换而诱导外源基因表达的方法，即首先以葡萄糖为碳源支持大肠杆菌生长至饱和，待葡萄糖消耗殆尽，培养基中另一种成分乳糖在lacY 与lacZ的基因产物透过酶(lactose permease)和￠-半乳糖苷酶(galactosidase)的协助下，乳糖穿过细胞膜并部分转化为异乳糖开启T7表达系统的方法。乳糖除了作为诱导物之夕卜，其代谢产物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操纵子的作用下也将转化成葡萄糖)也可作为细菌生长的碳源。与传统的IPTG (异丙基白D硫代半乳糖苷)诱导方法相比，在接种之后自诱导表达过程不需要对细胞的生长情况进行监测，从而减少了在培养过程中对培养物的处理，极大地方便了高通量筛选。而且，以价格低廉、无毒的乳糖替代价格高昂的IPTG可以大大地降低生产的成本，在重组蛋白的发酵生产中有着重要的意义。
[0009]本发明利用自诱导基培养发酵得到大肠杆菌细胞。在催化的过程中，无需经过外源处理，自诱导培养基培养出来的细胞在磷酸盐缓冲体系下即可以进行全细胞催化底物反应。目前，此种自诱导培养基培养出来的含有胞内酶的细胞不经外源处理，直接在磷酸盐体系下进行全细胞催化的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法。本发明不仅利用自诱导发酵体系取代传统的IPTG诱导发酵体系，降低了生产成本，而且利用自诱导培养得到的含有胞内酶的细胞，在不经外源处理的情况下，直接在磷酸盐体系下进行全细胞催化反应，生成海藻糖，提高利用全细胞催化合成海藻糖的效率，从而进一步降低海藻糖的生产成本。
[0011]为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案:一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，利用自诱导培养基发酵得到产海藻糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌细胞，该细胞可直接与麦芽糖底物在磷酸盐缓冲液体系下进行全细胞催化反应，得到富含海藻糖的液体。[〇〇12]具体的，本发明所述的方法，包括如下步骤:(1)将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产酶，获取发酵液；(2)从步骤(1)中的发酵液中提取大肠杆菌基因工程菌湿菌体，用磷酸盐缓冲液重悬， 获取反应液；(3)用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，与步骤(2)中的反应液进行催化反应，后分离干燥获得海藻糖晶体。[0〇13] 优选的，所述大肠杆菌细胞包含来源于灰产色链霉菌StrejOtoffijces griseocArawogaoes的海藻糖合成酶基因，并能表达合成海藻糖合酶。
[0014]优选的，所述步骤(1)中，在将大肠杆菌基因工程菌接种至诱导培养基前，还包括活化步骤，具体为:(1)采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌，获得大肠杆菌单菌落;挑取单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种，活化培养条件为37 °C，200rpm，培养时间8-12 h;(2 )取所述活化的菌种按接种量1.5% (V/V)接种到加氨苄的LB培养基继续活化，活化培养条件为37°C，200 rpm，培养时间8-12 h。
[0015]取步骤(2)中活化的菌种按体积比1.5% (V/V)的接种量将菌种接种到自诱导培养基发酵罐中，诱导产酶15-17 h，培养条件为37°C，200 rpm，获得发酵液。
[0016]优选的，所述加氨苄的固体LB培养基配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化纳10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L，琼脂20 g/L;所述加氨苄的液体LB培养基配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨节抗生素0.1 g/L。[0〇17] 所述自诱导发酵培养基配方为:甘油5 g/L、Na2HP〇4 6 g/L、K2HP〇4 3 g/L、NH4Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgS〇4,7H20 0.5 g/L、大豆蛋白胨 10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/L。
[0018] 优选的，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为:A液(0.04 mol/L NaH2P〇4):称取 NaH2P(V2H2〇 6.24 g，蒸馏水溶解，定容至 1 UB液(0.04 mol/L Na2HP〇4):称取恥2册〇4-12H20 14.32 g，蒸馏水溶解，定容至1 UA液与B液混合，调PH至7.4,获取0.04 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。[〇〇19]优选的，所述反应液的获取方法为:将步骤(1)所得的发酵液通过离心分离获得大肠杆菌基因工程菌湿菌体，离心条件为4°C，6000 rpm，离心时间为10 min;取湿菌体用与发酵液等体积的磷酸盐缓冲液洗涤2次后，用1/2体积磷酸盐缓冲液重悬，获得用于催化的反应液。
[0020]优选的，所述步骤(3)中，用磷酸盐缓冲液配制质量浓度为25%-30%麦芽糖溶液，按步骤(2)所述的反应液:麦芽糖溶液=1:3-5的体积比进行催化反应，反应条件为20-25°C，搅拌转速为 100-200 rpm，16-20 h。
[0021]现有技术中认为，对细胞进行全细胞催化，细胞需要经过外源处理增加通透性，再进行全细胞催化;而本发明研究发现，应用自诱导培养基培养出的细胞不需经过外源处理， 可直接进行全细胞催化。为了探究其原因我们对目的蛋白的氨基酸序列进行分析，酶蛋白并不含有信号肽序列部分，此海藻糖合酶为胞内酶。从催化反应角度看，此胞内酶可批次重复利用，目的蛋白存在于胞内，且麦芽糖可进入胞内与酶进行催化反应。由以上信息我们推测麦芽糖可能通过麦芽糖转运系统先由膜上转运蛋白(麦芽糖结合蛋白MBP)转运到胞内， 催化反应结束后转运系统将海藻糖转运出来。
[0022]通过本发明的技术方案即可实现海藻糖合成效率的提高和生产成本的降低。自诱导培养得到的含有胞内酶的细胞，在不经外源处理的情况下，直接在磷酸盐体系下进行全细胞催化底物反应被认为是最直接的原因。[〇〇23]本发明的有益效果在于:使用本发明的方法，用自诱导发酵体系取代传统的IPTG诱导发酵体系，无需人力实时监测OD600来确定IPTG添加时间，去除了 IPTG对菌体的毒害作用，有利于提高生物量，大大降低了生产成本，提高了生产效率。
[0024]本发明利用全细胞催化合成海藻糖的方法不造成细胞裂解以及不破坏细胞内部有机结构的情况下，使得小分子物质和一些较大分子物质能够自由地进出细胞。细胞整体结构保持完整，对胞内酶仍具有相当的保护作用，可保证胞内酶催化作用的充分发挥，并延长酶的使用寿命。
[0025]使用本发明的方法来进行催化合成海藻糖，无需外源处理的大肠杆菌以磷酸盐缓冲液配制的25%-30%麦芽糖为底物合成海藻糖，在20-25°C反应16-20 h底物的转化率可达到55%-65%，相对于现有技术，是一种高效的催化过程。[〇〇26]使用本发明的方法与物理法相比，操作方式简便，对仪器设备要求不高，能够进行规模化生产；与化学法相比，增加了生产过程的安全性，杜绝了毒物残留，减小了海藻糖分离纯化的压力。
[0027]使用本发明的方法对产品的品质影响微乎其微，对环境绿色友好，不会造成环境污染。【具体实施方式】 [〇〇28] 实施例1本实施例说明菌种的来源。
[0029]本专利所用的菌种为包含来源于灰产色链霉菌StrejOtoffi/ces gxiseocAroff1ge/jes的海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌，其中大肠杆菌基因工程菌构建方式采用专利CN201210160403中所述的方法，对构建的大肠杆菌基因工程菌编号为 BL21- trel(已在发明人的在先专利CN201310112536中公开)。[〇〇3〇] 实施例2本实施例说明应用LB培养基培养获得细胞，细胞在磷酸盐缓冲液体系下和在纯水体系下进行全细胞催化合成海藻糖的具体合成步骤以及合成效果。[〇〇31]取实施例1中所获得BL21-trel菌株用于海藻糖合成催化。
[0032]磷酸盐缓冲液体系下海藻糖合成催化步骤如下:(1)采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌获得大肠杆菌单菌落。其中加氨节的固体培养基的配方为:蛋白胨10 g/L，酵母5 g/L，氯化钠10 g/L，氨节抗生素0.1 g/L，琼脂20 g/L。具体的操作过程为，按要求配制培养基，将配制好的培养基于 121°C下灭菌30min，待冷却后倒平板，采用划线法接种，于恒温培养箱中培养获取大肠杆菌单菌落。[〇〇33](2)挑取上述单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种活化培养条件为37°C，200 rpm，培养时间8-12 h。其中加氨苄的LB液体培养配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨节抗生素0.1 g/L。按照上述要求配制好培养基后，分装于250 ml摇瓶中，装液量为50 ml，将配制好的培养基于121°C下灭菌30 min，冷却至室温，于无菌条件挑取单菌落接种于摇瓶中活化菌种。[〇〇34](3)取第(2)步中活化的菌种按接种量1.5% (V/V)接种到加氨苄的LB培养基继续活化，活化培养条件为37°C，200 rpm，培养时间8-12 h。
[0035]本实施例中，采取5 L发酵罐来培养菌体。待灭菌结束冷却至室温后，取活化的菌种按接种量1.5% (V/V)接种到加氨苄的LB液体培养基发酵罐中。保持培养条件为37°C，搅拌转速200 rpm，通气量为2 vvm。诱导产酶15-17 h 〇
[0036](4)转移第(3)步所得到的部分发酵液，离心分离获得大肠杆菌基因工程菌湿菌体，离心条件为4°C，离心转速为6000 rpm，离心时间为10 min。
[0037](5)获取第(4)步离心所得到的湿菌体，将其悬浮于与第(4)步发酵液等体积的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲中。[〇〇38] 磷酸盐缓冲液配制的具体步骤为，A液:称取NaH2P〇4.2H20 6.24 g，蒸馏水溶解，定容至1 L，获取0.04 mol/L NaH2P〇4;B液:称取Na2HP〇4.12H20 14.32 g，蒸馏水溶解，定容至1 1，获取0.04 111〇1/1恥2册044液与財夜混合，调节?11至7.4，获取0.04 111〇1/1?117.4磷酸盐缓冲液。[0〇39] (6)将第(5)步所得样品进行洗涤、重悬。离心条件为6000 rpm，离心10 min，取沉淀细胞。用与步骤(4)中发酵液等体积的磷酸盐缓冲液洗涤2次后，用1/ 2体积磷酸盐缓冲液重悬，获得用于催化的酶液。
[0040] (7 )用磷酸盐缓冲液配制质量浓度为25%-30%麦芽糖溶液，按体积比为步骤(6)所述酶液:麦芽糖溶液为1:3-5进行催化反应，反应条件为20-25 °C，搅拌转速为100-200 rpm，16-20 h获得富含海藻糖的混合溶液。
[0041]用高效液相色谱法测定体系中的海藻糖浓度，并计算海藻糖的转化率，以此来评价细胞的催化活性。其中，色谱柱为Alltima Amino 100A 5u柱(4.6mmX250mm);流动相为75%，乙腈/25% H20。[〇〇42] (8)分离干燥获得海藻糖纯品。
[0043]纯水体系下海藻糖合成催化方式同上，将磷酸盐缓冲液换成纯水，重复步骤(4)到 (8)操作。
[0044]经过测算，结果显示利用LB培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，在磷酸盐缓冲体系下细胞对麦芽糖的转化率为〇.6%，在纯水体系下细胞对麦芽糖的转化率为0.4%。
[0045]通过此对比试验发现，利用LB培养基培养细胞，在磷酸盐缓冲体系下和纯水体系下全细胞均不能催化麦芽糖生成海藻糖。
[0046]实施例3本实施例说明应用LB培养基培养获得细胞，细胞破碎后形成酶液，酶液在磷酸盐缓冲液体系下和纯水体系下进行催化合成海藻糖的具体合成步骤以及合成效果。[〇〇47]取实施例1中所获得BL21_trel菌株用于海藻糖合成催化。
[0048]实施步骤:在实例2中第(6)步，细胞洗涤并重悬好之后，用超声破碎仪破碎获得酶液，其余步骤与实例2保持一致。
[0049]经过测算，应用LB培养基培养获得细胞，细胞破碎后，在磷酸盐缓冲液体系下进行催化合成海藻糖，麦芽糖的转化率为53.8%，在纯水体系下，麦芽糖的转化率为52.6%。
[0050]通过此对比试验发现，应用LB培养基培养获得细胞，细胞破碎后形成酶液，酶液在磷酸盐缓冲液体系下和纯水体系下均可以催化麦芽糖合成海藻糖。[0051 ] 实施例4本实施例说明应用自诱导培养基培养获得细胞，细胞在磷酸盐缓冲液体系下和在纯水体系下进行全细胞催化合成海藻糖的具体合成步骤以及合成效果。[〇〇52]取实施例1中所获得BL21_trel菌株用于海藻糖合成催化。[〇〇53] 具体步骤如下:(1)采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌获得大肠杆菌单菌落。其中加氨节的固体培养基的配方为:蛋白胨10 g/L，酵母5 g/L，氯化钠10 g/L，氨节抗生素0.1 g/L，琼脂20 g/L。具体的操作过程为，按要求配制培养基，将配制好的培养基于121°C下灭菌30 min，待冷却后倒平板，采用划线法接种，于恒温培养箱中培养获取大肠杆菌单菌落。[〇〇54](2)挑取上述单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种活化培养条件为37°C，200 rpm，培养时间8-12 h。其中加氨苄的LB液体培养配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨节抗生素0.1 g/L。按照上述要求配制好培养基后，分装于250 ml摇瓶中，装液量为50 ml，将配制好的培养基于121°C下灭菌30min，冷却至室温，于无菌条件挑取单菌落接种于摇瓶中活化菌种。
[0055](3)取第(2)步中活化的菌种按接种量1.5% (V/V)接种到加氨苄的自诱导培养基继续活化。其中加氨苄的自诱导培养基配方为:甘油5 g/L、Na2HP〇4 6 g/L、K2HP〇4 3 g/L、 NH4CI 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgS〇4,7H20 0.5 g/L、大豆蛋白胨 10 g/L，氨苄抗生素0.1 g/ L。按照上述要求配制好培养基后，分装于250 ml摇瓶中，装液量为50 ml，将配制好的培养基于121°C下灭菌30 min，冷却至室温。[〇〇56]本实施例中，采取5L发酵罐来培养菌体。待灭菌结束冷却至室温后，取活化的菌种按接种量1.5% (V/V)接种到加氨苄的自诱导培养基发酵罐中。保持培养条件为37°C，搅拌转速200 rpm，通气量为2 vvm，诱导产酶15-17 h。[〇〇57](4)转移第(3)步所得到的部分发酵液，离心分离获得湿菌体，离心条件为4°C，离心转速为6000 rpm，离心时间为10 min。[〇〇58](5)获取第(4)步离心所得到的菌体，将其悬浮于与第四步发酵液等体积的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲中。[〇〇59]磷酸盐缓冲液配制的具体步骤为，A液:称取NaH2P(V2H20 6.24 g，蒸馏水溶解，定容至1 L，获取0.04 mol/L NaH2P〇4;B液:称取Na2HP〇4.12H20 14.32 g，蒸馏水溶解，定容至1 1，获取0.04 111〇1/1恥2册044液与財夜混合，调节?11至7.4，获取0.04 111〇1/1?117.4磷酸盐缓冲液。[0〇6〇](6)将第(5)步所得样品进行洗涤、重悬。离心条件为6000 rpm，离心10 min，取沉淀细胞。用与步骤(4)中发酵液等体积的磷酸盐缓冲液洗涤2次后，用1/ 2体积磷酸盐缓冲液重悬，获得用于催化的酶液。[〇〇611(7 )用磷酸盐缓冲液配制质量浓度为25%-30%麦芽糖溶液，按体积比为步骤(6)所述酶液:麦芽糖溶液为1:3-5进行催化反应，反应条件为20-25°C，搅拌转速为100-200 rpm，16-20 h获得富含海藻糖的混合溶液。
[0062]用高效液相色谱法测定体系中的海藻糖浓度，并计算海藻糖的转化率，以此来评价细胞的催化活性。其中，色谱柱为Alltima Amino 100A 5u柱(4.6mmX250mm);流动相为75%，乙腈/25% H20。[〇〇63](8)分离干燥获得海藻糖纯品。
[0064]纯水体系下海藻糖合成催化方式同上，将磷酸盐缓冲液换成纯水，重复步骤(4)到步骤(8)操作。
[0065]经过测算，结果显示利用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，在磷酸盐缓冲体系下细胞对麦芽糖的的转化率为62.3%，在纯水体系下细胞对麦芽糖的的转化率为0.3%。
[0066]通过此对比试验发现，应用自诱导培养基培养获得的细胞在磷酸盐缓冲体系下可进行全细胞催化合成海藻糖，但在纯水体系下却不能。
[0067]实施例5本实施例说明应用自诱导培养基培养获得细胞，细胞破碎后形成酶液，酶液在磷酸盐缓冲液体系下和纯水体系下进行催化合成海藻糖的具体合成步骤以及合成效果。[〇〇68]取实施例1中所获得BL21_trel菌株用于海藻糖合成催化。
[0069]实施步骤:在实例4中第(6)步，细胞洗涤并重悬好之后，用超声破碎仪破碎获得酶液，其余步骤与实例4保持一致。
[0070]经过测算，应用自诱导培养基培养获得细胞，细胞破碎后，在磷酸盐缓冲液体系下进行催化合成海藻糖，麦芽糖的转化率为56.8%，在纯水体系下，麦芽糖的转化率为54.6%。
[0071]通过此对比试验发现，应用自诱导培养基培养获得细胞，细胞破碎后形成酶液，酶液在磷酸盐缓冲液体系下和纯水体系下均可以催化麦芽糖合成海藻糖。而且，对比实例4和实例5发现，利用自诱导培养基和全细胞催化的方法催化合成海藻糖，不仅简化了对细胞的外源操作，还提高了催化效果，大大降低了成本，有广阔的应用前景。[〇〇72]实施例6本实施例说明应用自诱导培养基培养获得细胞，细胞分别在Tris-HCl缓冲液、K2HP〇4-KH2P〇4缓冲溶液、0.04 mol/L NaCl溶液体系下全细胞催化合成海藻糖的具体合成步骤以及合成效果。[〇〇73]取实施例1中所获得BL21_trel菌株用于海藻糖合成催化。
[0074]实施步骤:实施步骤与实施例4第(1)步到第(8)步一致，将其中的磷酸盐缓冲液分另IJ用等体积的Tris-HCl缓冲液、K2HP〇4_ KH2P〇4缓冲溶液、0.04 mol/L NaCl溶液替代。
[0075]其中:0.04 mol/L Tris-HCl缓冲液的配制:在800 ml水中溶解4.844 g Tris碱， 加入浓HCL调节pH值至7.4,最后加水定容至1 L。
[0076]0.04 mol/L NaCl溶液:在800 ml水中溶解2.34 g NaCl，加水定容至 1L。
[0077]0.04 mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液:A液(0.04 mol/L K2HP〇4):称取K2HP〇4.3H20 9.13 g，蒸馏水溶解，定容至1 L』液(0.04 mol/L KH2P〇4):称取KH2P〇4 5.44 g，蒸馏水溶解，定容至1 Lj液与B液混合，调PH至7.4,获取0.04 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。[〇〇78]经过测算，应用自诱导培养基培养获得细胞，细胞分别在Tris-HCl缓冲液、K2HP〇4-KH2P〇4缓冲溶液、0.04 mol/L NaCl溶液体系下全细胞催化合成海藻糖，麦芽糖的转化率分别为 24.3%、46.2%、0.7%。
【主权项】
1.一种应用自诱导培养基和全细胞催化合成海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步 骤:(1)将包含海藻糖合成酶基因的大肠杆菌基因工程菌接种至自诱导培养基中诱导产 酶，获取发酵液；(2)从步骤(1)中的发酵液中提取大肠杆菌基因工程菌湿菌体，用磷酸盐缓冲液重悬， 获取反应液；(3)用磷酸盐缓冲液配制麦芽糖溶液，与步骤(2)中的反应液进行催化反应，后分离干 燥获得海藻糖晶体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述大肠杆菌基因工程菌 中包含的海藻糖合成酶基因来源于灰产色链霉菌野ces griseocAroff1gaoeSo3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在将大肠杆菌基因工程菌 接种至诱导培养基前，还包括活化步骤，具体为:(1)采用划线法于加氨苄的固体LB培养基上培养大肠杆菌基因工程菌，获得大肠杆菌 单菌落;挑取单菌落接种于加氨苄的LB液体培养基活化菌种，活化培养条件为37 °C，200 rpm，培养时间8-12 h;(2)取所述活化的菌种按接种量1.5% (V/V)接种到加氨苄的LB培养基继续活化，活化 培养条件为37°C，200 rpm，培养时间8-12 h。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加氨苄的固体LB培养基配方为:蛋白 胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化纳10 g/L，氨节抗生素0.1 g/L，琼脂20 g/L;所述加氨苄的液体LB培养基配方为:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，氨苄 抗生素0.1 g/L。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，取步骤(2)中活化的菌种按体积比1.5% (V/V)的接种量将菌种接种到自诱导培养基发酵罐中，诱导产酶15-17 h，培养条件为37°C， 200 rpm，获得发酵液。6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述自诱导培养基配方为:甘油5 g/L、 Na2HP〇4 6g/L、K2HP〇4 3g/L、NH4Cl lg/L、NaCl 0.5g/L、MgS〇4.7H20 0.5g/L、大豆蛋白胨 l〇g/L，氨节抗生素0.1 g/L。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液配制方法为:A液:称取 NaH2P〇4,2H20 6.24g，蒸馏水溶解，定容至1 L，获取0.04 mol/L NaH2P〇4;B液:称取Na2HP〇4.12H20 14.32 g，蒸馏水溶解，定容至1 L，获取0.04 mol/L Na2HP〇4;A液与B液混合，调节PH 至7.4,获取0.04 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为:将步骤(1)所得的发 酵液通过离心分离获得大肠杆菌基因工程菌湿菌体，离心条件为4°C，6000 rpm，离心时间 为10 min;取湿菌体用与发酵液等体积的磷酸盐缓冲液洗涤2次后，用1/2体积磷酸盐缓冲 液重悬，获得用于催化的反应液。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用磷酸盐缓冲液配制质量 浓度为25%-30%麦芽糖溶液，按步骤(2)所述的反应液:麦芽糖溶液=1:3-5的体积比进行催 化反应，反应条件为20-25°C，搅拌转速为100-200 rpm，16-20 h。
【文档编号】C12P19/12GK105950687SQ201610535699
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月9日
【发明人】江凌, 晏星辰, 黄和, 宋小刚, 李阳, 宋哲, 唐苏苏
【申请人】南京工业大学