易变链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，具体设及一种来自于易变链霉菌的 海藻糖合成酶基因，该基因表达的海藻糖合成酶可W显著提高宿主的耐盐能力。
【背景技术】
[0002] 海藻糖在基因工程方面的研究已经获得了一些成就：一是利用海藻糖基因构建特 种作物提高了作物的抗逆性能力，二是利用工程微生物的构建和酶工程的合理运用，改进 原有的海藻糖的生产方式，提升效率，降低成本。目前很多研究者已经成功将海藻糖基因导 入经济作物，使植物作为海藻糖的生物反应器，并大量积累海藻糖。但是现有对于产海藻糖 合酶的基因工程菌的研究很少。近年来通过基因工程技术克隆和表达海藻糖合成相关的酶 已成为许多科学家研究的方向，而通过基因工程菌生产海藻糖合成相关的酶，并W此作为 酶法生产海藻糖的催化物，是生产海藻糖的相对高效的方法。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题有Ξ:-是提供一种携带海藻糖合成酶基因的新的放 线菌菌株，具体而言是易变链霉菌Streptomycesmut油ilisTRM45540;二是提供该菌株中 海藻糖合成酶基因的核巧酸序列及氨基酸序列；Ξ是异源表达海藻糖合成酶基因，包括纯 化该蛋白，并检测海藻糖合成酶的酶学特征；四是通过构建基因工程菌，验证海藻糖合成酶 基因能够显著提高宿主菌的耐盐能力及工业应用。
[0004] 本发明提供的技术方案：1.易变链霉菌（Str巧tomycesmut油ilis)TRM45540,该 菌株的保藏编号为CCTCCN0:M2015657。2.易变链霉菌TRM45540海藻糖合成酶基因，其 核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。3.如2所述的易变链霉菌TRM45540海藻糖合成酶基 因所编码的海藻糖合成酶，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。4.如1所述的易变链霉菌 TRM45540在工业中的应用。 阳0化]有益效果：1、克隆获得易变链霉菌中的海藻糖合成酶基因 (1)生长培养基 ISP4 培养基：可溶性淀粉 10.Og·L1，（NH4)2S04 2.Og·L1，Μ拆〇41.Og·L1，K2HPO4 1.0g.Li，CaC〇3 2.Og.Li，化Cl5g.Li，FeS〇4.7H2〇 0. 001g.Li，MnCl2.7H2〇 0.OOlg.Li。 28°C培养 7d。
[0006] 似活化 YEME培养基：玉米粉16.Og·L1，蛋白腺5.Og·L1，葡萄糖20g·L1，化Cl20g·L1，CaC〇3 1.Og.Li，FeS〇4.7&0 0.OOlg.L1。最佳发酵条件为：转速 180巧m，初始抑 7. 2-7. 4， 接种量8 %，装液量80血/250血，发酵溫度28 °C。
[0007] 做操作流程 将放线菌（易变链霉菌Streptomycesmut油ilisTRM45540)菌株接种到生长培养基 中28°C培养箱内培养7d待生长出丰富的新鲜菌丝体。收集菌丝于20%甘油混匀制成菌悬 液，放-20°C保存；按照1 %的接种量将菌悬液接种到装有YEME(终浓度0. 5%甘油）培养 基的Ξ角瓶中，28°C摇床培养36-4化得到新鲜菌液，抽提菌株的总DNA，经PCR扩增获得海 藻糖合成酶基因的片段，通过TA克隆得到携带有该基因的克隆子pl8T-TreA，并送克隆子 测序明确该基因的序列。
[0008] 2、异源表达海藻糖合成酶 (1) 将克隆子pl8T-TreApl8T-TreA的载体替换成祀T28a 抽提克隆子pl8T-TreA和祀T28a的质粒DNA，选用BamHI和Hindlll两种酶对ρ18Τ-化eA和祀T28a的质粒DNA在37°C水浴酶切地。通过琼脂糖凝胶电泳，回收相应的 片段。pl8T-TreA回收1143bp的片段，pET28a回收5. 3化的片段。将回收的两个片段在 T4DNA连接酶的作用下连接，转化化21，获得祀T28a-TreA克隆子 (2) 表达纯化TreA蛋白 接种祀T28a-TreA克隆子于LB培养基中活化，然后1/100转接于新的LB培养基中培 养至对数生长期，添加IPTG进行诱导，继续培养地，收集菌体，使用His标签-Ni柱纯化 TreA蛋白，通过SDS-PAGE检测TreA蛋白的表达。
[0009] 做酶活测定 利用高效液相色谱仪（HPLC)来分析海藻糖合成酶转化麦芽糖后的产物分析，分析条 件为色谱柱为：AlltimaAmino100A加柱（4. 6mmX250mm);检测器：Alltech2000ES型蒸 发光散射检测器；流动相：70%乙腊/30%肥0 ;流速：lmL/min;柱溫：35°C。分析酶活的最 适抑值（4、5、6、7、8)、最适溫度（4°(：、10°(：、28°(：、37°(：、45°(：、60°(：)、金属离子狂112\〔曰2\ Mg2\Mn2+和Co2+)对酶活的影响。
[0010] 3、通过构建基因工程菌，海藻糖合成酶基因能够显著提高宿主菌的耐盐能力W PUC19/D册α和祀T28a/BL21作为阴性对照，WTRM45540野生菌株作为阳性对照，将重组菌 株和对照菌株分别接种于0 %、1 %、3 %、5 %的平板上，检测菌株的耐盐性。 阳0川 菌种保藏说明：菌种名称：易变链霉菌TRM45540 ;拉下学名：Streptomyces mut油ilis;保藏编号：CCTCCNO:M2015657 ;保藏机构：中国典型培养物保藏中屯、；地址： 中国武汉武汉大学，邮编：430072,电话：(027)68754052,传真：(027)68754833,E-mail: cctccOwhu.edu.cn;保藏日期：2015 年 11 月 2 日。
【附图说明】 下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0013] 图1易变链霉菌TRM45540海藻糖合成酶基因的克隆； 图2易变链霉菌TRM45540的海藻糖合成酶基因的异源表达； 图3 :易变链霉菌TRM45540的海藻糖合成酶最佳底物浓度； 图4易变链霉菌TRM45540的海藻糖合成酶转化麦芽糖的产物分析； 图5抑对酶活影响的曲线图； 图6溫度对酶活影响的曲线图； 图7金属离子对酶活影响的曲线图； 图8携带海藻糖合酶基因的重组菌的耐盐能力分析。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 审IJ，仅仅作示例说明。
[0015] 实施例1、易变链霉菌TRM45540海藻糖合成酶基因的克隆 1、 易变链霉菌TRM45540的来源与分离培养 从新疆楼兰古城（海拔1400m，东径89。22' 22"，北缔40。29' 55" )0-30畑1±壤 样品中，采用涂布平板法，用含5%、10%、15%、20 %和25%氯化钢的8种培养基，28 °C恒溫 培养，共分离出7个属的放线菌35株，通过平板对時法初筛和管碟法复筛，最终分离和筛选 出了抑菌效果好且具有一定耐盐能力的生防菌TRM45540,通过分子鉴定及形态学观察命名 为易变链霉菌（Str巧tomycesmut油ilis)。 分离培养基为无机盐淀粉琼脂（ISP4)培养基：淀粉lOg·L1，（NH4)2S04 4g·L1，Μ拆〇42g·L1，Κ2ΗΡΟ42g·L1，CaC〇3Ig·L1，NaCl40g·L1，琼月旨 18g·L1，pH7. 2-7. 4。 2、 提取菌株TRM45540的总DM 接种TRM45540菌株于ISP4培养基巧％ ^C1浓度）中于28°C培养7d，待菌株生长出 丰富的抱子后将抱子转接于YEME培养基巧％ ^Cl浓度）中生长36-4化后，收集菌体提取 菌株的总DNA; ISP4培养基配方：淀粉：10g · L 1，（NH4)2S〇4:4g · L 1，Μ拆〇4:2g · L 1，K2HP〇4:2g · L 1，CaC〇3 Ig · L1，化Cl40g · L1，琼脂：18g · L1，pH 7. 2-7. 4 ; YEME培养基配方：薦糖：340g·Li，葡萄糖：10g·Li，麦芽膏：3g·Li，细菌蛋白腺： 5g·L1，酵母膏：3g·L1，加蒸馈水至IL，115°C灭菌20min; 提取链霉菌TRM45540总DNA的方法：收集菌体放入无菌EP管中，加入480μL的 1XTE，加入20μΙ的溶菌酶巧0mg，mLi)。放入37°C摇床中，200r/min振荡过夜。每管加入 50μΙ20%的SDS，加入5μΙ20mg.血1的蛋白酶K，放入60°C水浴锅中溫育1~2h。加入 550μL的酪：氯仿：异戊醇（25:24:1)，120001·.min1离屯、lOmin，取上清移入另一离屯、管 中，反复抽提2~3次。取上清，加入800μL的无水乙醇，加入80μL的乙酸钢（3mol'Ll)， 放入4°C冰箱中沉淀DNA约比。12000r.min1离屯、lOmin，弃上清。加入300μL的70%乙 醇清洗离屯、产物1~2次，12000Γ·min1离屯、5min，弃上清，将乙醇挥发完全。加入50μL 无菌超纯水充分底部的DNA，电泳检测DM提取质量，放入-20°C冰箱中保存备用； 克隆海藻糖合成酶基因：WTRM45540菌株的总DNA为模板，WTreAF:CGC GGATCCGTGCGCAAGACCTTGATC，TreAR:CCCAAGCTTTCACAGCAGCGCCTTCAG为引物进行PCR扩增。 扩增程序为：94°C:5min;94°C:30s，52°C:30s，72°C:1.SminCM巧cles) ;72°C:10min，反应 完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测； 通过TA克隆得到携带有该基因的克隆子pl