专利名称：与胡萝卜素合成有关的合成酶基因、其编码蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种与胡萝卜素合成有关的合成酶基因、其编码蛋白及其应用。
背景技术：
植物类胡萝卜素主要分布于植物叶绿体和有色体膜中，包括胡萝卜素(carotene)和叶黄素(xanthophylls)两大类。植物类胡萝卜素是光吸收复合体的重要组分，并且在保护光合器官、防止光氧化损伤等方面起着重要作用。植物类胡萝卜素也是许多花和果实中的重要色素，赋予植物花、果实等器官绚丽的色彩，用以吸引昆虫、鸟类或其它动物来进行授粉和传播种子。植物类胡萝卜素还是植物激素(如ABA)、防御化合物和风味芳香物(如e-n引哚)
等许多生理活性物质生物合成的前体。此外，e-胡萝卜素和含e-环的胡萝卜素是人类及
动物体内维生素A (retinol)合成的前体，许多其它非维生素A类胡萝卜素，如叶黄体素(lutein)、玉米黄质(zetxanthin)、番茄红素(lyc叩ene)在淬灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面具有更为重要的作用。
在微生物中合成和生产类胡萝卜素已经有很长的历史和许多成功的例子，但是，从微生物中获得的类胡萝卜素往往在化学构象、生理活性等方面不同于植物和动物来源的类胡萝卜素，而且需要复杂昂贵的分离纯化过程。而利用植物合成和生产类胡萝卜素则不需要此过程，可以直接食用。
盐藻("朋s^eWs)属于单细胞真核藻类，是目前已知的最耐盐的真核生物之一，可在接近淡水(NaCl〈50mM)直到饱和盐水(NaCl〉5M)的环境中存活.此外，对强光照、环境pH值、温度等变化造成的胁迫也能够有很好的耐受。胁迫条件下，细胞内会产生大量甘油和类胡萝卜素等物质，调节细胞的生理活动来适应外界环境的变化。在4M NaCl条件下生长的盐藻，体内的甘油浓度可以达到7.8M;而在合适的诱导条件下，盐藻积累的类胡萝卜素的总量可以达到其有机干重的10%，甚至更高。因此，盐藻不仅是研究生物逆境耐受机制的模式生物，在大规模生产类胡萝卜素、脂肪酸等代谢物方面也有极大的潜力。而盐藻类胡萝卜素合成途径基因的分离、功能鉴定及表达特性研究则为利用盐藻在特定条件下大规模生产类胡萝卜素提供了理论依据。
类胡萝卜素是由类异戊二烯聚合而成的萜类化合物，其生物合成的前体是含有C5的异戊二烯焦磷酸(IPP)。 IPP在IPP异构酶(IPPI)作用下，异构化生成DMAPP，然后在栊牛儿基牴牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)催化下，DMAPP与3个IPP分子縮合而生成含C20的栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸(GGPP)。两分子的GGPP再由八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase, PSY)
催化形成第一个C40的类胡萝卜素-八氢番茄红素(phytoene)。在盐藻中，PSY基因以
及下游的PDS和LCY基因已经相继被克隆。但是，GGPP作为真正进入类胡萝卜素合成途径的第一种前体物质，其表达调控与逆境条件下盐藻胡萝卜素合成之间的关系还没有相关报道。因此，DvGGPS基因的克隆及功能研究不仅可以深入理解盐藻胡萝卜素合成途径，为利用盐藻大规模生产胡萝卜素提供理论依据，还为利用基因工程法进行原核表达和农作物品质改良提供了更多的选择。
发明内容
本发明目的之一是提供一种与胡萝卜素合成有关的合成酶基因，该基因来源于盐藻，称为
本发明目的之二是提供该基因的编码蛋白。本发明目的之三是提供该基因的克隆方法。
本发明的目的之四在于提供该基因在提高原核菌株中胡萝卜素含量中的应用。为达以上目的，本发明采用如下技术方案
一种与胡萝卜素合成有关的合成酶基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一
1) 具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；
2) 与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
一种上述的基因的编码蛋白，该蛋白具有下列氨基酸序列之一
1) 具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；
2) 通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2的蛋白具有相同的生物学功能。
一种克隆上述的基因的方法，该方法的具体步骤为利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对文库中cDNA的序列进行大规模测序，获得对应的EST文库。通过序列比对，分离到了一个鹏牛儿基栊牛儿基合成酶基因，命名为/^^;/^;挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了 "^^尸5"的cDNA序列；ZW^/^最长cDNA片段为15566bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA及poly (A)结构。
一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。
一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。一种上述的基因在提高原核菌株中胡萝卜素含量中的应用。
本发明的与胡萝卜素合成有关的合成酶基因/^^/^在E. coli中起到了雄牛儿基继牛儿基合成酶的功能，为胡萝卜素合成途径中的下游基因提供了胡萝卜素合成所需的前体GGPP。同时，含有本发明的Z^^^5"基因的原核菌株在利用基因工程生产胡萝卜素方面具有很高的潜力。
图1为本发明的与胡萝卜素合成有关的合成酶基因"K^7^的编码蛋白保守结构域分析图。
图2为本发明的与胡萝卜素合成有关的合成酶基因"^^尸5"在酵母突变体ANY119(湖r",/7etiW, ,sJ-5^力iW-W"中的功能互补分析图。其中A为转化子在25度条件下的生长状况图，B为转化子在37度条件下的生长状况图。
图3为本发明的与胡萝卜素合成有关的合成酶基因Z^0^5"原核表达后大肠杆菌菌体色素分析图。其中A为对含有不同原核表达载体的菌株合成的色素进行的分光光度分析图，B为对原核菌株合成的色素进行的液相色谱分析图。
图4为本发明的与胡萝卜素合成有关的合成酶基因ZVC67^在1M—3M NaCl振荡及营养缺乏处理条件下的表达模式的Real-time PCR分析图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遗传法实验指南(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory CourseManual, Adams A et al编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一/^^尸5"全长编码区的克隆与分析
利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA的序列测序，获得对应的EST文库；通过序列比对，分离到了一个栊牛儿基徙牛儿基合成酶基因，命名为ZV6^/^。挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了i^6^/^的cDNA序列。ZVW/^最长cDNA片段为15566bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA及poly(A)结构。Vector NTI软件的分析结果显示，A^6T^最长读码框编码了一个含345个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为37. 3kDa，等电点是6.44。 ChloroP 1.1 Server预测结果显示，该蛋白可能定位于叶绿体。同源性比对表明，该蛋白具有植物牴牛儿基栊牛儿基合成酶特有的保守结构域FARM(DDXXXXDXXDD)和结构域SARM (DDILD)，参见图l。
实施例二 zv^;/^在酵母突变体中的功能分析
通过PCR方法，以A^6^ 的全长cDNA为模板，扩增获得包含完整ORF的基因片段。借助引物引入法，在靶基因5'端加上&oR I酶切位点和真核翻译保守的Kozak序列。弓i物序列如下-
Sense: 5'TAGAATTCGAGGATGGGGGCCTT 3'Antisense: 5' TGACTCGAGTCAGTTCTCTCGGTAGC 3'
将克隆到的目的片段插入到酵母组成型表达载体pAJ401中，并转化酵母突变体ANY119(朋r", 6e^-力"rW-设力i^-W幼。该突变体由于缺失II型栊牛儿基栊牛儿基转移酶的e亚基BET2，所以在25'C培养条件下能够正常生长，而在37"高温培养条件下无法正常生长，。而继牛儿基栊牛儿基合成酶基因的过量表达，则可以互补这一缺陷表型。由图2A可以看出，突变体(M)、野生型(W)及含有Z t^^5"基因的酵母转化子(1-6)在25'C条件下均可正常生长。而在37'C条件下，突变体不能正常生长，参见图2B;而含有/V6^/^基因的酵母转化子，不仅恢复了正常生长，而且其生长情况明显好于野生型。该实验在验证"W6T^基因功能的同时，也暗示了其在提高生物耐热能力方面的应用价值。
实施例三"K^7/^原核表达
为了验证/M^/^基因是否在盐藻胡萝卜素合成途径中起作用，我们将该基因与嗜夏孢欧文氏菌胡萝卜素合成基因簇CrtYIB组合，通过对大肠杆菌转化子合成的色素进行吸光度检测，来判断该基因是否能够与嗜夏孢欧文氏菌来源的下游基因共同作用，合成0-胡萝卜素。
首先，以ZM^尸5"cDNA序列以及嗜夏孢欧文氏菌基因组为模板，通过特异引物扩增目的基因片段DvGGPS， CrtE， CrtYIB，并引入特定酶切位点。其中，CrtE是嗜夏孢欧文氏菌栊牛儿基牴牛儿基合成酶基因，该基因与下游基因簇CrtYIB共同作用，在该菌中合成e-胡萝卜素。相关引物序列如下(下划线标注部分为引入的限制性内切酶位点)CrtYIB sense:
5' ATAGGTACCATGCAACCGCATTATGAT 3'CrtYIB antisense:
5' ATACTCGAG AAGACATGGCGCTAGAGC 3'CrtE sense:
65' TATGCTAGCATGACGGTCTGCGCAAA 3'CrtE antisense:
5' TGACTCGAGTTAACTGACGGCAGCGAG 3'DvGGPS sense:
5' TCAGCTAGCATGTGGGCCTTGAAGAG 3'DvGGPS antisense:
5' TGACTCGAGTCAGTTCTCTCGGTAGC 3'
利用原核表达载体pET30a和pRSETA，分别构建本实验所需的目的原核表达载体pET30a-CrtYIB， pRSETA-CrtE, pRSETA-DvGGPS。pET30a-CrtYIB， pRSETA空载体共转化E. coli作为负对照；pET30a-CrtYIB, pRSETA-CrtE共转化E. coli作为正对照；pET30a-CrtYIB，pRSETA-DvGGPS共转化E. Coli，用于验证"W67^基因的功能。
IPTG诱导目的基因表达之后，含有A^^S基因的转化子菌体及正对照均表现出明显的橙黄色。利用丙酮对3种转化子菌体进行色素抽提，并对抽提液进行吸光度分析。结果如图3A所示，负对照没有表现出明显的紫外吸收光谱，表明仅有CrtYIB这三个胡萝卜素合成途径的下游基因无法使大肠杆菌具备合成胡萝卜素的能力；而含有"K^ /^基因的转化子合成的色素的紫外吸收光谱与正对照一致，均表现出日-胡萝卜素特异的三指形吸收峰425ran、450nm、 475nm，且最大吸收峰为450nm处。
以己垸为溶剂，以甲醇二氯甲垸=9: i为流动相，对e-胡萝卜素标准品和上述抽提的
色素进行HPLC分析。结果如图3B所示，含有/V^7/^基因的转化子菌体合成的色素与e-胡萝卜素标准品均在28分钟处有明显的吸收峰。
上述两个实验结果表明，"W67^基因在E.coli中起到了妮牛儿基妮牛儿基合成酶的功能，为胡萝卜素合成途径中的下游基因提供了胡萝卜素合成所需的前体GGPP。同时，该实验还暗示了含有ZV^^5基因的原核菌株在利用基因工程生产胡萝卜素方面的潜力。
实施例四通过Realtime-PCR方法分析盐藻ZVW/^基因在高盐及营养缺乏处理条件下的表达模式
为了进一步研究在盐藻胡萝卜素合成发生变化时，/^^/^基因在RNA水平的表达模式，我们对处于对数期的盐藻进行了 1MNaCl， +Nutrients—3MNaCl， -Nutrients的高盐振荡以及营养缺乏处理。根据已发表文献研究结果，在该处理条件下，盐藻合成的胡萝卜素含量受到明显的诱导。我们分别在0hr， lhr， 3hr， ， 12hr， 24hr， 48hr， 72hr对处理材料进行取样，并提取盐藻细胞总RNA。上述RNA样品经DNase I消化后，在反转录酶的作用下反转成cDNA，稀释10倍后作为各个实验条件的real-time PCR的模板。real-time PCR引物设计
(1) DvGGPS R+: 5' -TCAGCTAGCATGTGGGCCTTGAAGAG-3'
(2) DvGGPS R- 5' -TGACTCGAGTCAGTTCTCTCGGTAGC-3，
(3) DvACTIN R+: 5' -GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC-3'
(4) DvACTIN R- 5， -CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA-3，
ZM^/^和"WCn^的文库质粒经纯化和定量后，按照10倍梯度稀释作为定量PCR的标准曲线，"K/JCr/yV的转录量作为内参。基因"v^7/^的转录变化数据以其在模板中的拷贝数与"W6T力V的拷贝数的比值来作图展示。
由实验结果图4可以看出，"./r7VA在受到高盐振荡及营养胁迫时，"Kft^ 基因的表达短期内会受到抑制，推测可能是为了保证有足够多的前体物质进入甘油合成途径，以应对高盐振荡。12hr之后该基因的表达又逐渐受到诱导，推测可能是为了提供更多的GGPP前体，进一步保证胡萝卜素合成的增加。<110> 上海大学
〈120>与胡萝卜素合成有关的合成酶基因、其编码蛋白及其应用
〈160〉 2
〈210〉 1
<211〉 1556
〈212> 腿
〈213〉 盐藻(/ i/朋7ie"a Wr/cZ/s)
〈400〉 1
CAGTGGTATTGTAATAGTTGTGGCGTGGCAGGGGAGCAGTAAGAGCGAAAGAGAAAGAGT60
GATGGCGTCCAGTGTCCAGGACGCAGCATAGCTCAGTGTTCAGCACACTCTCTCCCAGCC120
TCCCACGCACCTAGCAGCAGGCAGAGGAGCCACGCACATTGAGGATGTGGGCCTTGAAGA180
GAGGAGCCACCTGCTGCCCTTCACAAAGGCCGACGCCGAGTTGCTCAAGGCCCGCAGCCG240
CCTGGCGCGTTAGCCGCTCGTCTTGCAGGACCCTAGCAATAGCCACAGCTGATGGGGCTG300
CCAAGCAATCCACTGCCTCCTTCGATTTCAAGGGCTACATGAAGCAGCGGGCAGTGATGG360
TGAACGAGGCTCTGGACAAAGCCTTGCCACGGCGCCACCCAGAAGTCCTCCTTGATTCTA420
TGAGGTACTCATTATTAGCTGGAGGGAAGCGCGTTCGGCCAGCACTGACCCTTGCAGCGT■
GTGAGATGGTTGGAGGGAGCATTGAGACTGCCATGCCCACAGCTTGTGCCATGGAAGTGG540
TACATACAATGAGCTTGATCCACGATGACTTGCCATCAATGGACAACGATGACTTCCGGA600
GAGGGAATCCGACCAACCATAAAGTGTACGGAGAGGACATGGCCATCCTGGCGGGTGATG660
CCCTGCTCTCCTTTGCCTTTGAGCACGTGGCACGGGCCACCAAGGGCACCTCGCCAGAGC720
GAGTGCTCCGTGTCATCCTGGAGCTTGGGCGTGCTGTCGGTGCGGATGGGTTGACAGGCG780
GACAGGTGGTGGACATTAAAAGCGAGAATGAAGAGGTGGGCTTGGAGGTCCTGCAGTTCA840
TCCACGAGCACAAGACGGCTGCCCTGCTGGAAGCATCAGTCGTTTGTGGCGCTCTAGTGG900
GTGGCGCAGATGATGTCACTGTGGAGAAGCTGCGCAAGTACGCACGCAACATTGGGCTTG960
CTTTCCAGGTGGTGGATGACATCTTGGACTGCACCCAGACAACTGAGATGCTAGGCAAGA1020
CGGCTGGGAAGGACTTGGATGTGAATAAAACTACGTACCCCAAGCTGCTTGGCCTGGAAA1080
AGAGCAAGCAGACTGCTGAGGACCTGATCAGTGAAGCCATTCAGCAGCTGGATGGATTTG1140CGCCTGAGAAGCGGGTCCCACTGGTGGCCTTGGCCAAGTACATCGGCTACCGAGAGAACT1200
GAGCCTTCACAGATGGCATGTTGCCATCGTCTCTAGGAAGGGGGTTGTGCCTGCTGAACT1260
AAATCTGGTTCTGAACCAGTTCTCTGACCTGCCACTCATGTTGACCATGCCCTCTGCCAG1320
GGCTGTGCGCATTCTCAGCTCATGTCTGCCAGGTCCTTGAGGCCACGTCGAGCCATGACT1380
TGGTGATTAGCCTTGGAGCTGTGTCTCAAACTTTGAGTCAAAGGCAGAGATGCCAGGTGC1440
ATTCCTTCCTGTGTACTGTGCCCTTTTCTTTTTCCCCGTTTGCCTCTTTGCTCGTGAATT1500
CCCCTTGTCAAACAATGCATTAATTTTGCCAGCAAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA1556
<210> 2
〈211> 345
<212> PRT
〈213〉 盐藻("W7S"eWa
〈400〉 2
MetTrpAlaLeuLysArgGlyAlaThrCysCysProSerGinArgPro16
ThrProSerCysSerArgProAlaAlaAlaTrpArgValSerArgSer32
SerCysi\rgThrLeuAlalieAlaThrAlaAspGlyAlaAlaLysGin48
SerThrAlaSerPheAspPheLysGlyTyrMetLysGinArgAlaVal64
MetValAsnGluAlaleuAspLysAlaLeuProArgArgHisProGlu80
ValLeuLeuAspSerMetArgTyrSerLeuLeuAlaGlyGlyLysArg96
ValArgProAlaLeuThrLeuAlaAlaCysGluMetValGlyGlySer112
lieGluThrAlaMetProThrAlaCysAlaMetGluValValHisThr128
MetSerLeulieHisAspAspLeuProSerMetAspAsnAspAspPhe144
ArgArgGlyAsnProThrAsnHisLysValTyrGlyGluAspMetAla160
lieLeuAlaGlyAspAlaLeuLeuSerPheAlaPheGluHisValAla176
ArgAlaThrLysGlyThrSerProGluArgValLeuArgVallieLeu192
GluLeuGlyArgAlaValGlyAlaAspGlyLeuThrGlyGlyGinVal208
ValAsplieLysSerGluAsnGluGluValGlyLeuGluValLeuGin224
PhelieHisGluHisLysThrAlaAlaLeuLeuGluAlaSerValVal240
CysGlyAlaLeuValGlyGlyAlaAspAspValThrValGluLysLeu256
ArgLysTyrAlaArgAsnlieGlyLeuAlaPheGinValValAspAsp272lie LeuAsp CysThrGinThrThrGlu MetLeu GlyLys ThrAla Gly288
Lys AspLeu AspValAsnLysThrThr TyrPro lysLeu LeuGly Leu304
Glu LysSer LysGinThrAlaGluAsp Leulie SerGlu Alalie Gin320
Gin LeuAsp GlyPheAlaProGluLys ArgVal ProLeu ValAla Leu336
Ala LysTyrl leGlyTyrArgGluAsn34权利要求
1.一种与胡萝卜素合成有关的合成酶基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
2. —种根据权利要求l所述的基因的编码蛋白，该蛋白具有下列氨基酸序列之一1) 具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；2) 通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添 加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2的蛋白具有相同的生物 学功能。
3. —种克隆根据权利要求1所述的基因的方法，该方法的具体步骤为利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA的序列测序， 获得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个栊牛儿基栊牛儿基合成酶基因，命 名为Z^^/S挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了 Z W^尸5"的cDNA序列；ZVW/^最 长cDNA片段为15566bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA及poly (A)结构。
4. 一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。
5. —种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。
6. —种根据权利要求1所述的基因在提高原核菌株中胡萝卜素含量中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种与胡萝卜素合成有关的合成酶基因、其编码蛋白及其应用。本发明的与胡萝卜素合成有关的合成酶基因DvGGPS在E.coli中起到了牻牛儿基牻牛儿基合成酶的功能，为胡萝卜素合成途径中的下游基因提供了胡萝卜素合成所需的前体GGPP。同时，含有本发明的DvGGPS基因的原核菌株在利用基因工程生产胡萝卜素方面具有很高的潜力。
文档编号C12N15/63GK101671683SQ20091019659
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月27日 优先权日2009年9月27日
发明者孟祥宗, 婷 宋, 宋任涛, 冲 常, 林钰靓, 许政暟 申请人:上海大学