一种羟基化类胡萝卜素的合成方法

专利名称：一种羟基化类胡萝卜素的合成方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，涉及一种能生产高活性羟基化类胡萝卜 素的类胡萝卜素水合酶及合成方法。
背景技术：
类胡萝卜素是一类天然色素的总称，属于类萜化合物，以异戊二烯残基为 单元组成，基本结构都是一个较长的共轭体系，不易溶于水，易溶于有机溶剂，
属于脂溶性色素。目前已经确定结构的类胡萝卜素达700种以上，普遍存在于 植物、真菌、藻类和细菌中，在生物体内起着不可替代的作用。随着研究的深 入，它的医疗保健作用越来越引起人们的广泛关注。类胡萝卜素不仅是植物体 内的功能性分子，在动物和人类健康中也发挥重要作用。越来越多的研究表明， 食用富含类胡萝卜素的食物可减少与老化有关的疾病如冠心病、黄斑退化疾 病、白内障以及某些癌症的发病率。
由于动物和人体无法从头合成类胡萝卜素，只能从食物中摄取。所以在植 物、微生物中通过基因工程技术生产大量的类胡萝卜色素或者形成新类型的色 素产物显得尤为重要。类胡萝卜色素合成起始于异戊二烯焦磷酸(IPP)，然后 与其同分异构体二甲丙烯基焦磷酸(DMAPP)合成牴牛儿焦磷酸(GPP)，在 CrtE的存在下GPP与一分子IPP縮合形成十五碳的化合物法呢焦磷酸(FPP); 最后FPP和单个IPP继续縮合并形成二十个碳的栊牛儿基犍牛儿基焦磷酸 GGPP。随后在八氢番茄红素合成酶CrtB及八氢番茄红素脱饱和酶作用下生成 链孢红素或番茄红素。在大部分合成Qe的微生物中，从IPP到番茄红素合成 途径中是相同的，随后的反应由于不同的物种拥着不同的修饰酶，实现不同的 末端修饰，如环化、羰基化、羟基化、糖基化等等。
耐辐射奇球菌(Ddwococcws ra&o山ram)是一种极端环境微生物，以对电离 辐射、紫外射线、干燥和氧化压力等极端条件表现极强抗性而著称。它的这种 超强抗性有一部分归功于其体内含有红色类胡萝卜素。研究表明，耐辐射奇球 菌类胡萝卜素的自由基清除能力高于人们熟知的|3-胡萝卜素等。
主要的技术文献有(Armstrong G A (1997)^打打""/及evz.ew o/Mfcra6z.o/ogy 51: 629-659; Tao L & Cheng Q (2004) Afo/G^打om&s 272: 530-7; Tian B,Xu Z， Sun Z, Lin J & Hua Y (2007)别octo 一勿a 1770: 902-11; Xu Z， Tian B, Sun Z, Lin J & Hua Y ( 2007 ) MfcraWo/ogy 153: 1642-52.)

发明内容
本发明的目的在于提供一种耐辐射奇球菌类胡萝卜素水合酶基因tr/C,具 有SEQIDNo.l所述的核苷酸序列，该基因所编码的多肽具有SEQIDNo.2所 述的氨基酸序列，该序列不同于其他生物来源的crtC，与其他来源^/C的亲 缘关系较低。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述基因的重组表达载体及其构建 方法。通过以下步骤实现以提取的耐辐射奇球菌("""o②cc^ ra&od"ra附Rl， ATCCNo.13939，购自美国菌种保藏中心)基因组DNA为模板，用Dr91、Dr92 一对引物进行PCR扩增，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，回收和纯化片段， 通过T-A克隆，经DNA测序鉴定后亚克隆到质粒pRK404中的和^wffl 位点之间，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5cx，接种于含有四环素 抗性的琼脂平皿，挑选阳性菌落，接种于2毫升含有氨苄的LB液体培养基中 过夜，抽提质粒，得到表达载体pRKcrtC。所述PCR法中使用了两条引物 Dr91 5' AAGCTTGATGATCTCGCCCCCCCTCCTGC 3' Dr92 5' GGATCCGGTAGCCGTCCCACCACGACT 3'。 本发明的再一个目的是提供所述的重组表达载体在制备羟基化类胡萝卜
素中的应用，通过所述的重组表达载体的转化表达实现
(1) 将重组表达载体pRKcrtC以氯化^沉淀法转化到能产生链孢红素的大 肠杆菌中，接种于5毫升含有四环素和氯霉素的LB液体培养基中过夜，从而使 所述类胡萝卜素水合酶基因crtC在大肠杆菌中表达并合成1 -OH-链孢红素和
U，-(OH)2-链孢红素；
(2) 将所述重组表达载体pRKcrtC以氯化钙沉淀法转化到能产生番茄红素 的大肠杆菌中，接种于5毫升含有四环素和氯霉素的LB液体培养基中过夜，从 而使crtC在大肠杆菌中表达并合成l-OH-番茹红素和l,l，-(OH)2-番茄红素。
本发明的有益之处本发明鉴定了一种来源于耐辐射奇球菌的类胡萝卜素 水合酶基因cWC，该基因编码的蛋白可以催化在C-l，2或C-l，,2'上发生水合作 用。该CrtC蛋白序列明显不同于其他已知的CrtC蛋白，是一种新型的类胡萝 卜素水合酶。本发明选择引入异源基因可以产生链孢红素或番茄红素的大肠杆 菌作为出发菌株(含有来源于欧文氏菌的c^基因)，将来源于耐辐射奇球菌的 类胡萝卜素水合酶基因crtC构建到表达载体上，转基因上述大肠杆菌,实现l-OH-链孢红素、U，-(OH)2-链孢红素、l-OH-番茄红素和1,1，-(OH)2-番茄红素
的生物合成，因此,本发明提供了一种利用类胡萝卜素水合酶基因合成羟基化 类胡萝卜素的方法，与现有的利用类胡萝卜素羟基化酶CrtZ的合成方法不同之 处在于，CrtZ是在类胡萝卜素底物的两端环结构上加上羟基，而水合酶CrtC是
在底物碳链的c-i,2或c-r,2，双键上发生水合作用，合成含有c-i或c-r羟基
的类胡萝卜素。


图1为类胡萝卜素水合酶基因cWC的PCR凝胶电泳图。 图2为重组载体pRKcrtC的酶切鉴定图。 图3为类胡萝卜素水合酶基因crfC功能验证图。
具体实施例方式
下面结合具体实施方案对本发明做进一步的说明，这些实施例应被理解为 仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。 实施例l:
类胡萝卜素水合酶基因crtC的克隆
根据NCBI数据库中耐辐射奇球菌(De/"ococcws ra&odwrara Rl， ATCC No.13939,购自美国菌种保藏中心)cWC的序列设计引物
Dr91 5' AAGCTTGATGATCTCGCCCCCCCTCCTGC 3'
Dr92 5' GGATCCGGTAGCCGTCCCACCACGACT 3'
以提取的耐辐射奇球菌基因组DNA为模板，用上述引物和Takara公司的 LATaq酶进行PCR。 PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳(结果参见图1，图中M 为分子量标记，1为PCR产物)。用Takara公司凝胶回收试剂盒回收DNA。回 收产物在T4 DNA连接酶的作用下，与Takara公司T载体pMD18 T vector进 行连接。连接产物转化大肠杆菌并在氨苄青霉素平板上筛选阳性克隆。随机挑 取平板上的菌落，并用碱裂解法小量提取质粒，并做PCR和酶切(Hindin, Bamffl)鉴定。含有大小正确片段的质粒去测序，验证序列的正确性。
实施例2:
类胡萝卜素水合酶基因c^C重组表达载体的构建
cWC重组表达载体的构建按常规方法进行。上述含有cWC基因的T载体 经过历》dll和^w2ffl双酶切出的目的片断，在T4连接酶作用下，与上述两 种酶切的表达载体pRK404进行连接，连接产物转化大肠杆菌并在含有四环素 抗性平板上筛选阳性克隆。随机挑取平板上的菌落，并用碱裂解法小量提取质粒，并做PCR和酶切(i7/"dn， 5"附HI)鉴定(参见图2，图中M为为分子 量标记，l为酶切产物)。经过验证，含有cWC基因的重组表达载体pRKcrtC构 建完成，并成功转化到大肠杆菌中形成含有重组表达载体pRKcrtC的重组大肠 杆菌。
实施例3:
类胡萝卜素水合酶c^C在宿主生物中的表达和产物检验
3.1在能够产生链孢红素的大肠杆菌菌株中表达cwC并分析类胡萝卜素产
物
含有质粒pACCRTEBlRe的大肠杆菌能形成链孢红素。将成功构建的重组 表达载体pRKcrtC转化进入包含上述质粒的大肠杆菌，并在含有氯霉素和四环 素的板上筛选阳性克隆。随机挑取平板上的菌落，并用碱裂解法小量提取质 粒，并做PCR鉴定。经过验证正确的克隆，转接到100ml的锥形培养瓶中， 30。C发酵培养36小时。其中当OD值达到0.5时，加入诱导剂IPTG使其终浓 度为0.5mM。发酵液经过离心后，沉淀的菌体用预冷的丙酮和甲醇(V/V,7:2) 提取类胡萝卜色素。提取的色素产物进行HPLC分析,液相条件如下流动相， 甲醇/乙腈/异丙醇(5: 4: 1);流速，1 ml/min; C18柱。分析结果显示，重组 载体pRKcrtC能在大肠杆菌中表达，在产生链孢红素的大肠杆菌中，crtC基因 能催化链孢红素产生l-OH-链孢红素、1，1，-(OH)2-链孢红素，结果参见图3A， 其中A为转化含有链孢红素的大肠杆菌后提取色素产物的HPLC图(470nm)， 产物1为l,l，- (OH) 2-链孢红素，2为l-OH-链孢红素，3为链孢红素。
3.2在能够产生番茄红素的大肠杆菌菌株中表达^tC并分析类胡萝卜素产
物
含有质粒pACCRTEBlEe的大肠杆菌能形成番茄红素。将成功构建的重组 表达载体pRKcrtC转化进入包含上述质粒的大肠杆菌，并在含有氯霉素和四环 素的平板上筛选阳性克隆。随机挑取平板上的菌落，并用碱裂解法小量提取质 粒，并做PCR鉴定。经过验证正确的克隆，转接到100ml的锥形培养瓶中， 30。C发酵培养36小时。其中当OD值达到0.5时，加入诱导剂IPTG使其终浓 度为0.5mM。发酵液经过离心后，沉淀的菌体用预冷的丙酮和甲醇(V/V，7:2) 提取类胡萝卜色素。提取的色素产物进行HPLC分析，液相条件如下流动相， 甲醇/乙腈/异丙醇(5: 4: 1);流速，1 ml/min; C18柱。分析结果显示，重组 载体pRKcrtC能在大肠杆菌中表达，在产生番茄红素的大肠杆菌中，crtC基因 能催化番茄红素产生l-OH-番茄红素、1，r-(OH)2-番茄红素，结果参见图3B，其中B为转化含有番茄红素的大肠杆菌后提取色素产物的HPLC图(470nm)， 产物4为1，1，- (OH) 2-番茄红素，5为l-OH-番茄红素，6为番茄红素。本发明涉及的序列
<110>浙江大学
〈120> —种羟基化类胡萝卜素的合成方法 <160> 4 <210> 1 〈211〉 939 <212> DNA
〈213〉耐辐射奇球菌(Zfei"。c。cc〃s rao^Wora"51 Rl) 〈400〉 1
cccccctcct gcgctggggg ctggccgccg
ttgatctcgc ctgggggcgc ctgccgctct accctgcggc gcgctctccg gggctgctca ggctggggcc ctgctcggca cccaccgtgc gggctgcaac gtgggcctcg ctgtgggccg gcctggggca g鄉gcttst gggctggtgc ggagcgctgc
tgctggcgct ccggggtgtt ggcgctggca tggccctcaa gcaccggggc aggccgcgca gccggacggg tcacggtgcc tcgcgggcgg aaccgctgat gggcgccggt tgaagcgtct cgccgtcctt tggtggggcg tcgcgcgcgg
ggccgagcag tgcgctggcg acggctgctc gattccggtg gctgttcgtc gctcgccgcc ggttcctttt gcttatcgtg gcgcccctgg gacggcgcag gcagaacttt ggcgccgggg ctcgctcgcc gctggcggaa ggtgcggcgt
tccgcaggct ggggacgcgc gctgagacgc ccgctgtggc gccggactga ctcgcctgcc gggcagteict ccgctgggct ctggcggggc aactactggc ctcggctggt ctttttgatg tacttcaccg gcgggggtcei gccagttga
ctggcctcgg gggctctgat tggggtcagc cgccgtggtt cgcaggggtt gctacgccgc tcgccgggct cctacgccac ggttcgcctt tgctcatcac
gCtgg3gCg3
gggcggtggg ccaaag3g旭 aggctttttt cactcgccgt
cctcgccttt 60 tgcgctgggg 120 gttcggggcc 180 ggggtggctc 240 tgcgctgctg 300 gcagcgggcg 360 gggcgtggaa 420 cgcccccgcg 480 taccctcgcc 540 gtgctgggac 600 cccccacccg 660 cacggcgatt 720 gcagaaggct 780 tctgccgggc 840 gatggggctg 900 939
<210〉 2 <211〉 312 〈212〉 PRT
<213>耐辐身寸奇球菌(Zte/"ococcus Tao^Wwra/w Rl) 〈400〉 2
Met lie Ser Pro Pro Leu Leu Arg Trp Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Gly Leu Ala Phe Leu Gly Ala Leu Leu 15 10 15 20 25
Ala Leu Ala Glu Gin Ser Ala Gly Tip Ala Leu lie Ala Leu Gly Leu Pro Leu Ser Gly Val Phe Ala Leu Ala
30 35 40 45 50
Gly Asp Ala Leu Gly Ser Ala Phe Gly Ala Thr Leu Arg Arg Arg Trp Gin Arg Leu Leu Ala Glu Thr Pro Pro
55 60 65 70 75
Trp Leu Gly Trp Leu Ala Leu Ser Val Ala Leu Lys He Pro Val Pro Leu Trp Pro Gin Gly Phe Ala Leu Leu
80 85 90 95 100
Gly Leu Leu Ser Thr Gly Ala Leu Phe Val Ala Gly Leu Ser Tyr Ala Ala Gin Arg Ala Gly Trp Gly Gin Ala
105 110 115 120 125
Ala Gin Leu Ala Ala Leu Ala Cys Leu Ala Gly Leu Gly Val Glu Leu Leu Gly Ser Arg Thr Gly Val Pro Phe
130 135 140 145 150Gly Gin Tyr Ser Tyr Ala Thr Ala Pro Ala Pro Thr Val Leu Thr Val Pro Leu He Val Pro Leu Gly Trp Phe
155 160 165 170 175
Ala Phe Thr Leu Ala Gly Leu Gin Leu Ala Gly Gly Arg Pro Trp Leu Ala Gly Leu Leu He Thr Cys Trp Asp
180 185 190 195 200
Val Gly Leu Glu Pro Leu Met Thr Ala Gin Asn Tyr Trp Arg Trp Ser Asp Pro His Pro Leu Trp Ala Gly Ala
205 210 215 220 225
Pro Val Gin Asn Phe Leu Gly Trp Trp Ala Val Gly Thr Ala lie Ala Trp Gly Met Lys Arg Leu Ala Pro Gly 230 235 240 245 250
Leu Phe Asp Ala Lys Glu Lys Gin Lys Ala Glu Gly Leu Ser Pro Ser Phe Ser Leu Ala Tyr Phe Thr Glu Ala
255 260 265 270 275
Phe Phe Leu Pro Gly Gly Leu Val Leu Val Gly Arg Leu Ala Glu Ala Gly Val Thr Leu Ala Val Met Gly Leu
280 285 290 295 300
Gly Ala Leu Leu Ala Arg Gly Val Arg Arg Ala Ser 305 310
〈210〉 3 <211〉 29 〈212〉腿 〈213〉人工序列 <220〉
〈223〉用于克隆crtC基因的引物Dr91 <400〉 3
MGCTTGATGATCTCGCCCCCCCTCCTGC 29
<210> 4 <211> 27 <212〉 DNA <213〉人工序列 〈220〉
〈223〉用于克隆crtC基因的引物Dr92 <400〉 4
GGATCCGGTAGCCGTCCCACCACGACT 2权利要求
1. 一种来自耐辐射奇球菌的类胡萝卜素水合酶基因crtC，其特征在于具有SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，该基因所编码的多肽具有SEQ ID No.2所述的氨基酸序列，所述序列与其他来源crtC的亲缘关系较低。
2. 根据权利要求1所述基因的重组表达载体pRKcrtC的构建方法，其特 征在于通过以下步骤实现以提取的耐辐射奇球菌基因组DNA为模板，用 Dr91、 Dr92—对引物进行PCR扩增，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，回收和 纯化片段，通过T-A克隆，经DNA测序鉴定后亚克隆到质粒pRK404中的 /f/"^in和Samffl位点之间，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5a， 接种于含有四环素抗性的琼脂平皿，挑选阳性菌落，接种于2毫升含有氨苄的 LB液体培养基中过夜，抽提质粒，得到表达载体pRKcrtC。
3. 根据权利要求2所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于所述PCR法中使用了两条引物-Dr91 5' AAGCTTGATGATCTCGCCCCCCCTCCTGC 3' Dr92 5' GGATCCGGTAGCCGTCCCACCACGACT 3'。
4. 根据权利要求2所述的重组表达载体在制备羟基化类胡萝卜素中的应用。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体的应用，其特征在于通过以下步骤 实现的(1) 将重组表达载体pRKcrtC以氯化钙沉淀法转化到能产生链孢红素的大 肠杆菌中，接种于5毫升含有四环素和氯霉素的LB液体培养基中过夜，从而使 所述类胡萝卜素水合酶基因crtC在大肠杆菌中表达并合成l-OH-链孢红素和 U，-(0H)2-链孢红素；(2) 将所述重组表达载体pRKcrtC以氯化钙沉淀法转化到能产生番茄红素 的大肠杆菌中，接种于5毫升含有四环素和氯霉素的LB液体培养基中过夜，从 而使crtC在大肠杆菌中表达并合成l-OH-番茄红素和l,r-(OH)2-番茄红素。
全文摘要
本发明提供一种耐辐射奇球菌类胡萝卜素水合酶基因crtC，具有SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列，该基因所编码的多肽具有SEQ ID No.2所述的氨基酸序列，该序列不同于其他生物来源的crtC，与其他来源crtC的亲缘关系较低。通过构建转化载体和转基因大肠杆菌，在含有链孢红素或番茄红素的大肠杆菌中表达crtC基因，能产生羟基化类胡萝卜素产物。本发明的类胡萝卜素水合酶基因crtC为通过基因工程技术生产高抗氧化活性的羟基化类胡萝卜素产物奠定基础。
文档编号C12N15/52GK101451142SQ200810162819
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者华跃进, 孙宗涛, 沈绍传, 兵 田 申请人:浙江大学