专利名称：基因工程菌生物合成茶氨酸的方法
技术领域：
本发明属于应用微生物领域，涉及一种基因工程菌生物合成茶氨酸的方法。
背景技术：
茶氨酸(Theanine)是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一。 它是1950年由日本酒户弥二郎从玉露茶新梢中发现的，并命名为茶氨酸
(Theanine)。从发现到目前为止，除了在蕈、茶梅、蘑菇、油茶、红山茶等中 检测出微量存在外，在其他植物中尚未发现。茶氨酸还是茶树中含量最高的游 离氨基酸，在茶树的新梢芽叶中，70%左右的游离氨基酸是茶氨酸。近年对茶 叶保健成分的研究中，茶氨酸是一种比较引人注目的化合物，在它的许多生理 作用被发现以后，如何合成及提取茶氨酸也成了广泛关注的研究课题。
茶氨酸属于酰胺类化合物，它的化学名为N-乙基卞L-谷氨酰胺
(N陽ethyl个L曙glutamine)，分子式为HOOCCHNH2CH2CH2CONHCH2CH3，分 子量为174.2。自然界存在的茶氨酸均为L型，纯品为白色针状结晶，熔点 217-218°C (分解)。[a]D- +7.0。，极易溶于水，而不溶于无水乙醇和乙醚， 且溶解性随温度升高而增大。具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味，味觉阀值 0.06%。经6mol/L盐酸水解后生成L-谷氨酸和乙胺，茚三酮反应成紫色。
茶氨酸自发现以来，一直是被作为茶叶的主要品质成分广为研究。近年来， 茶氨酸具有的一些特殊生理功能不断地被发现，从而成为茶叶功能性成分合成 和提取、应用的又一大热点，研究表明，茶氨酸具有许多有价值的药用保健功 效
(1) 降血压作用；
(2) 增强抗肿瘤药物的疗效；
(3) 松弛神经紧张、焦虑等作用；
(4) 对脑神经细胞保护作用；
(5) 促进大脑功能作用；
(6) 改善经期综合症作用；
(7) 减肥作用；
(8) 抗疲劳作用；(9)提高免疫力，防御病毒；
茶氨酸除了具有以上药用保健功效外，在食品领域也有很好的应用价值， 目前，茶氨酸作为食品添加剂己被广泛应用，其安全性和稳定性也得到了肯定。
但由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸，成本还非常昂贵，之前采用茶树愈 伤组织、悬浮细胞培养等方法虽然能生成天然L型茶氨酸，但由于运行成本过 高，产品制率低，暂时还无法产业化。因此，有关它的合成制备研究越来越受 到重视。随着基因工程和发酵工程技术的不断完善和发展，越来越多的基因工 程产品相继问世，基因工程菌的发酵工艺是基因工程产品产业化的关键。因此， 通过构建基因工程菌生物合成茶氨酸具有广阔的前景和巨大的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因工程菌，含重组质粒pET32a-GGT，质粒 大小7563bp， GGT片段大小1743bp，分类命名为大肠埃希氏菌J^c/zen'c/z/a co/z'， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.2714,保藏日期为2008年10月16日。所述工程菌具有氨苄青霉素(Amp) 抗性，异丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达Y-谷氨酰转肽酶。
本发明的另一个目的在于提供该基因工程菌生物合成茶氨酸的方法，通过 以下技术方案实现
(1) 种子液制备
将冷冻保藏的菌种(保藏号为CGMCC No. 2714)接种于含有氨苄青 霉素(Amp)的LB培养基中，37。C培养16小时左右，使其活化，将活化后的 菌种接入盛有LB培养基中，在摇床中37"C， 180r/min振荡培养12小时左右，
获得种子液；
(2) 发酵培养
吸取0.5mL种子发酵液至盛有含有Amp的发酵培养基(最优发酵培养基 葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、 K2HP04 7.10g/L、蛋白胨10g/L、 NaCl 10g/L、 MgS(V7H20 lg/L)的三角瓶中，37°C， 180 r/min振荡培养4-6小时左 右(OD600约0.8)，然后加入0.05mmol/L—0.5mmol/L异丙基硫代-P -D-半乳 糖苷(IPTG)， 30。C一32"C诱导4小时，获得含有Y-谷氨酰转肽酶的基因工程 菌发酵液；
(3) 生物合成茶氨酸 将发酵培养所得基因工程菌发酵液8000r/min离心，除去上清液体，并用
无菌水洗涤后加入茶氨酸生物合成反应体系(L-谷氨酰胺0.20mol/L —0.40mol/L，盐酸乙胺1.0mol/L—3.0mol/L， pH9.0—10.0)，在180 r/min， 30°C 一34"C条件下反应4-6小时，获得茶氨酸。
茶氨酸分子结构为
<formula>formula see original document page 5</formula>
本发明通过克隆E.coli DH5a中，谷氨酰转肽酶(Y-GGT)基因，构建了具有 茶氨酸生物合成能力的基因工程菌。
本发明的优点在于该方法操作简单，效率髙，便于生产过程中的控制，茶 氨酸产量和产率高具有良好的工业化应用前景。
图1为本发明的茶氨酸生物合成基因工程菌的质粒图谱，质粒大小 7563bp， GGT片段大小1743bp。
图2为基因工程菌生物合成茶氨酸的HPLC分析(保留时间为13.4min的 色谱峰为茶氨酸)。
具体实施例方式
本发明将通过具体的实施例和附图作进一步的说明。下列实施例仅为更好 地解释本发明，而并非被下列实例所限制。 实施例1
(1) 将冷冻保藏的菌种(保藏号为CGMCC No. 2714，含有重组质粒 pET32a-GGT，质粒图谱参见图1)接种于含有Amp的LB培养基中，37"C培 养16小时左右，使其活化。将活化后的菌种接入盛有LB培养基中，在摇床中 37°C， 180r/min振荡培养12h左右，获得种子液。
(2) 吸取0.5mL种子发酵液至盛有含有Amp的发酵培养基(最优发酵培 养基葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、 K2HP04 7.10g/L、蛋白胨10g/L、 NaC110g/L、 MgS04*7H20 lg/L)的三角瓶中，37°C， 180 r/min振荡培养4h， 然后加入0.05mmol/L IPTG, 32。C诱导4小时，获得含有Y-谷氨酰转肽酶的基 因工程菌发酵液。
(3) 将发酵培养所得基因工程菌发酵液8000r/min离心，除去上清液体， 并用无菌水洗漆后加入茶氨酸生物合成反应体系(L-谷氨酰胺0.35mol/L，盐 酸乙胺2.0mol/L， pH9.5),在180 r/min, 32。C条件下反应4h，获得茶氨酸，产量为32.22g/L， L-谷氨酰胺的转化率为52.8%。 实施例2
(1) 将冷冻保藏的菌种(保藏号为CGMCC No.2714)接种于含有Amp 的LB培养基中，37'C培养16小时左右，使其活化。将活化后的菌种接入盛有 LB培养基中，在摇床中37匸，180r/min振荡培养12h左右，获得种子液。
(2) 吸取0.5mL种子发酵液至盛有含有Amp的发酵培养基(最优发酵培 养基葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、 K2HP04 7.10g/L、蛋白胨10g/L、 NaC110g/L、 MgS04'7H20 lg/L)的三角瓶中，37°C， 180 r/min振荡培养6.6h， 然后加入0.05mmol/L IPTG， 31.5。C诱导4小时，获得含有Y-谷氨酰转肽酶的 基因工程菌发酵液。
(3) 将发酵培养所得基因工程菌发酵液8000 r/min离心，除去上清液体， 并用无菌水洗涤后加入茶氨酸生物合成反应体系(L-谷氨酰胺0.35mol/L，盐 酸乙胺2.0mol/L， pH9.5)，在180 r/min， 32'C条件下反应4h，获得的茶氨酸 产量为35.18g/L， L-谷氨酰胺的转化率为57.7%。
实施例3合成茶氨酸的HPLC分析
利用菌液进行发酵后将发酵液按照以下的步骤测定发酵液中的茶氨酸含
(1) 流动相配制
流动相A: IL流动相A (60mM无水醋酸钠、lMN,N-二甲基甲酰胺，用 冰醋酸调pH6.4)，流动相B: 50%乙腈1L。
(2) 茶氨酸柱前衍生反应
① 取3.2.3中收集的上清液，用盐酸调节pH至中性。
② 取100ul调至中性的上清液放入1.5ml的Eppendorf离心管中，再依次 加入100ulNaHCO3 (0.5M， pH9.0)和lOOul DNFB (1%,己腈配制)，于60
'C避光反应1小时(注期间经常振荡，使样品与氨基酸衍生剂充分接触，混 合均匀)；
③ 反应结束后，向反应液中加入700ulKH2PO4(0.01M， pH7.1)，旋涡混 匀，用0.45pm滤膜过滤，待HPLC分析。
(3) 色谱条件
色谱柱HPLC氨基酸专用分析柱(200X4.6mm， 10pm)。柱温30°C;检测波长360nm， 2.000AUFS;上样量10ul;流速lml/min。
流动相梯度流动相A: 0—5min85%-60%， 5-10min 60%-50%， 10 — 17min 50-40%， 17-25min40-0%， 25-30min0%， 30-32min 0%-85%。
流动相B: 0—5min 15%陽40%, 5画10min 40%-50%， 10 —17min 50-60%， 17-25min 60-100%， 25画30min 100%， 30-32min 100%画15%。
经过最终测定获得的发酵液的茶氨酸图谱峰面积(参见图2)与标准样品 比较，最终确定茶氨酸浓度。
权利要求
1. 一种基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌含重组质粒pET32a-GGT，质粒大小7563bp，GGT片段大小1743bp，命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，其在中国微生物菌种保藏中心保藏号为CGMCC No.2714，保藏日期为2008年10月16日，具有氨苄青霉素抗性，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达γ-谷氨酰转肽酶。
2. 根据权利要求1所述的一种基因工程菌生物合成茶氨酸的方法，通过 以下技术方案实现(1) 种子液制备将权利要求1所述的冷冻保藏的菌种接种于含有氨苄青霉素的LB培养基 中，37t:培养16小时，使其活化，将活化后的菌种接入盛有LB培养基中，在 摇床中37'C， 180r/min振荡培养12小时左右，获得种子液；(2) 发酵培养吸取0.5mL种子发酵液至盛有含有氨苄青霉素的发酵培养基的三角瓶中， 37°C， 180r/min振荡培养4-6小时，然后加入0.05mmol/L—0.5mmol/L异丙基 硫代-e-D-半乳糖苷，3(TC—32。C诱导4小时，获得含有Y-谷氨酰转肽酶的基 因工程菌发酵液；(3) 生物合成茶氨酸 将发酵培养所得基因工程菌发酵液8000r/min离心，除去上清液体，并用无菌水洗涤后加入茶氨酸生物合成反应体系，在180r/min， 30'C—34'C条件下 反应4-6小时，获得茶氨酸。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)的第2)步 中发酵培养基组成为葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、 K2HP04 7.10g/L、 蛋白胨10g/L、 NaC110g/L、 MgS04'7H20 lg/L。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中反应体系 组成为L-谷氨酰胺0.20mol/L—0.40mol/L，盐酸乙胺l.Omol/L—3.0mol/L，pH9.0 一IO.O。
全文摘要
本发明一种基因工程菌，含重组质粒pET32a-GGT，质粒大小7563bp，GGT片段大小1743bp，命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏号为CGMCC No.2714，具有氨苄青霉素抗性，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达γ-谷氨酰转肽酶。本发明通过克隆E.coli DH5α中γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)基因，构建了具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌。本发明的方法操作简单，效率高，便于生产过程中的控制，茶氨酸产量和产率高具有良好的工业化应用前景。
文档编号C12N1/21GK101445788SQ200810162599
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者健 周, 浩 成, 智 林, 王丽鸳, 王贤波, 陆文渊 申请人:中国农业科学院茶叶研究所