专利名称：：一种微生物发酵制备有效霉烯胺的方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物产酸克雷伯氏菌(X/eZwW/aox少toc")CCTCCNo:M205091发酵制备有效霉烯胺的方法。(二)背景才支术本发明涉及的有效霉烯胺，英文名为valienamine,其结构式如下(Chem.Rev.2003,103:1955-1977)。HOH2COHvalienamine有效霉烯胺，又称井冈霉烯胺，其化学名(lS,2S,3S,4R)-l-氨基-5-(羟甲基)环己-5-烯-2,3，4-三元醇；分子式为C7H13N04,重要的基团有一个伯氨基(-NH2)，一个碳碳双键(CK:),一个羟甲基(-CH2OH),三个羟基(-OH)。其盐酸盐(C7HuN04'HCl)的[ag为+68.6。(lN-HCl)，五乙酸盐(CnH23N09)的熔点为95°C,|a￡3为+30.2。(CHCl3),遇茚三酮显色反应。有效霉烯胺是一种较强的糖苦酶抑制剂，同时也是很多其他糖苦酶抑制剂的核心结构，可以用于合成有效霉醇胺(valiolamine)和伏格列波沣唐(voglibose)，具有良好的应用前景。生产有效霉烯胺的方法主要有以下几种(1)以有效霉素(validamycins)[井冈霉素(Jinggangmycins)]，有效霉亚基胺[井冈霉亚基胺(validoxylamine)]及其衍生物为原料制备有效霉烯胺。有效霉素是一种高效、安全的农用抗生素，是由有效霉烯胺、有效霉胺和P-D-葡萄糖等结构组成。4①微生物裂解有效霉素制备有效霉烯胺微生物有F/"voZ^cfen'wm■s"acc/z"rcp/./ww、尸sew(iomowas(iem.fri/FcaMS等,见表l。以、有戋文審素4,为底物，通过发酵、细胞催化等技术，分解有效霉素得到有效霉烯胺，是目前工业化生产有效霉烯胺的方法之一。表l:降解有效霉素专利菌种汇总菌种专利平2-26957(1982)、平2-2598F/"vo^Ce〃'謂sacc/z"ra/7M應IFO13984平2-26957、平2-2598平2-26957平2-26957Q;鄉/ag"Aep"rtnaIFO12017平2-26957C^啤/agafe/an>7"ATCC13125平2-26957/^ar/w"IFO14087平2-26957尸/avoZac&n'w/wsacc^arc^/n'/w/wn,sp.平2-2598^7avo/ac/en'w附s^cc/^rop/i/wmFERM-P平2-2598F/avo6ac^m'簡sacc/zarop/n7鹏NO.5707平2-2598IFO12664(ATCC4718)平6-69380々ratom'簡ia血toc妙IFO13258(ATCC13332)平6-69380爿graZ""enwmi^&^""erIFO13259(ATCC13333)平6-69380^gro6ac&rZwwJflAo6ac^rIFO13532(ATCC19358)平6-69380々ra6""en'讓ia金6a"erIFO13533(ATCC25235)平6-69380^4gro6ac/^n'wm/t/w^/^c/e/wIFO3058平6-69380Z^n9p/n7asubsp,awaen^wesIFO13282平6-69380Jera卿way/y^哪/zz7"subsp./^rapM"IFO13286平6-69380^4，歸was/^npMasubsp,pn9加/,'caIF013287平6-693805爿erawowoy;Mnc加asubsp.c謂'ceIFO13288平6-69380^m腳"oysa/附ow/"V/asubsp.w/附ow/c/c/aIFO12659平6-693805fe朋的p/iomoMosma/frop/u7/aCCTCCNo.M204024ZL200410017516.3尸Mwc/蘭owwywomsre"ceCCTCCNo.M205098ZL200510061363.7爿歸ge腦/。織//CCTCCNo.M205095ZL200510061364.1②NBS(N-Bromosuccinimide)试剂裂解法制备，利用NBS试剂，可以断裂有效霉亚基胺或其衍生物中的C-N键，得到有效霉烯胺，另外还会生成一些环己酮类物质，裂解液成分较为复杂，可通过离子交换等方法分离得到有效霉烯胺，但目前没有工业化生产的报道。(2)以阿卡波糖和/或其衍生物为原料制备有效霉烯胺阿卡波糖用于治疗糖尿病的一种药物，从阿卡波糖的结构可以看出，阿卡波糖主要由麦芽糖和有效霉烯胺组成。韩国HURYUL，etal.申请的专利WO2004108657和WO2004000782报道了用三氟乙酸(TFA)或固体酸水解阿卡波糖或其衍生物制备有效霉烯胺。也可以用^L生物裂解阿卡波糖或其衍生物制备有效霉烯胺。(3)化学合成法制备，自从1972年分离得到有效霉烯胺以来，出现了许多化学合成有效霉烯胺的方法，但是通过化学合成的大部分是外消旋体，并且收率较低，是目前工业生产有效霉烯胺的方法之一。(4)从吸7jC链審菌(5^eptow少c"/^grojcop/ci^)发酵液中提耳又，吸水链霉菌在发酵合成有效霉素的过程中，会生成少量的前体物质有效霉烯胺。因此，通过离子交换的方法可以从有效霉素的发酵液中提取分离得到有效霉烯胺。但是发酵液中有效霉烯胺的浓度很低，提取难度较大，无工业生产的报道。
发明内容本发明涉及一种利用新的菌种——克雷伯氏菌属(A7efc/e//a)的产6酸克雷伯氏菌(K/^wW/flCCTCCNo:M205091发酵生产有步文霉烯胺的方法。与已有文献报道的裂解井冈霉素生产有效霉烯胺菌种均不同。本发明采用的技术方案是产酸克雷伯氏菌(尺/eZw/e〃aCCTCCNo:M205091樣i生物发酵制备有效霉烯胺的方法，所述方法包括将CCTCCNo:M205091接种至添加有有效霉素的适用于产酸克雷伯氏菌的发酵培养基中，于2537"C下进行发酵培养72192小时，发酵液经分离纯化得到所述有效霉烯胺；所述有效霉素在发酵培养基中的起始浓度为550g/L。所述的微生物菌抹属于克雷伯氏菌属(K/eZwW/a)的产酸克雷伯氏菌(K/e6wW/ao矽toca)，己于2005年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M205091，已在在先申请CN200510060638.5进4亍了详细描述。发酵培养基为常规适用于产酸克雷伯氏菌的发酵培养基添加有效霉素得到。所述培养基除了含有效霉素外，还可以含有一些可以被上述菌抹利用的营养物质。可以少量添力。的碳源有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油等；可以作为氮源的有肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、氨盐(硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸胺等)等；无机盐类有Na、K、Ca、Mg等金属盐类、磷酸盐或醋酸盐等。培养基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源和无机盐等。液体培养、固体培养均可，但是大量工业化生产时，液体培养基较为合适。可采用培养方式有静置培养、摇动培养或通风搅拌培养等，大量生产有效霉烯胺时宜采用深层通风搅拌培养。发酵培养基中主要成分为有效霉素，其它组分为可以被本发明的新的微生物利用的碳源、氮源、无机盐等，本发明中所用发酵培养基组成如下有效霉素550g/L，葡萄糖l20g/L,蛋白胨l10g/L，酵母粉110g/L,MgSO40.1lg/L,溶剂为水，pH6.08.0。所述分离纯化可按本领域常规方法操作，本发明中所述方法如下发酵培养结束后，发酵液去除菌体，得到清液用大孔弱酸性阳离子交换树脂进行离子交换，以氨水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液用强磁^性层析树脂进行层析，以水为洗脱剂，收集只含有有效霉烯胺的部分，冷冻干燥，得到所述有效霉烯胺。本发明用产酸克雷伯氏菌(XfeZwW/aox_ytora)CCTCCNo.M205091分解培养基中的底物有效霉素生产有效霉烯胺，其方法有(1)利用该微生物发酵分解底物有效霉素制备有效霉烯胺菌种CCTCCNo.M205091经过活化，接入上述灭菌的种子培养基培养制成种子液，将种子液接入到上述配制灭菌的发酵培养基中培养发酵。种子培养的控制条件如下培养温度25。C37。C,培养时间24h48h,pH值接近中性为好，在通风搅拌或振荡条件下进行为佳；发酵培养的控制条件温度25。C37。C，发酵时间为72h192h,pH值接近中性为好，在通风搅拌或振荡条件下进行为佳。有效霉烯胺为易溶于水的碱性物质，因而可以采用水溶性碱性物质的分离、精制方法，例如离子交换树脂、活性炭、多孔高聚物，葡聚糖凝胶、离子交换剂等进行吸附后解吸、层析等。分离过程如下将含有有效霉烯胺的发酵液或细胞催化反应液离心或过滤除去菌体,再将上清液或滤液用大孔弱酸阳离子交换树脂进行离子交换，用氨水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液用强石威性层析杉于脂进行层析，用水作为洗脱剂，收集只含有有效霉烯胺的部分，冷冻干燥，得到成品。产物有效霉烯胺采用HPLC检测方法进行检测[Journalof8ChromatographyB,824(2005)41-347]。先配制书t生化反应液在N,N-(N,N-二曱基曱酰胺)(DMF)的溶液中加入1.0%的对硝基氟苯和1.5%的三乙胺；流动相的配制乙腈200ml,加入纯净水配成1000ml,然后超声脱气。取发酵液1.0ml，将水分蒸干,加入衍生化反应液2.0ml,加入流动相8.0ml稀释，超声5min,100。C沸水中反应30min，即为待测样品。然后进行液相分析，色谱柱HypersilODS25u(250x4.6cm),流速1.0ml/min，检测波长为398nm,进样量20jiL。具体的，所述方法如下(1)CCTCCNo:M205091接种至种子培养基，2537°C、通风搅拌或震荡下培养2448小时，得到种子液；所述种子培养基组成如下葡萄糖1040g/L,蛋白胨520g/L,酵母膏110g/L，MgSO40.1~lg/L,溶剂为水，pH6.08.0;(2)将种子液以体积比5~10%接种量接种至发酵培养基，30~37°C、通风搅拌或震荡下培养100150小时，得到发酵液；所述发酵培养基组成如下有效霉素550g/L,葡萄糖l20g/L，蛋白胨1~10g/L,酵母粉l10g/L,MgS040.11g/L,溶剂为水，pH6.08.0;(3)发酵液离心或过滤去除菌体，取上清液或滤液用大孔弱酸性阳离子交换树脂进行离子交换，以氨水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液用强碱性层析树脂进行层析，以水为洗脱剂，收集只含有有效霉烯胺的部分，冷冻干燥，得到所述有效霉烯胺。优选的，所述步骤(1)中种子培养基组成如下葡萄糖10-15g/L,蛋白胨1020g/L,酵母膏510g/L,MgSO40.31g/L，溶剂为水，pH7.58.0。优选的，所述步骤(2)中发酵培养基组成如下有效霉素1520g/L，9葡萄糖510g/L,蛋白胨l5g/L,酵母粉25g/L,MgSO40.3lg/L，溶剂为水，pH7.5~8.0。本发明的有益效果主要体现在利用本发明方法，得到发酵液中有效霉烯胺浓度较高，后续提取简单方便，便于工业化生产。(四)附图"i兌明图1为发酵培养时间对发酵结果的影响。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:分别配制种子培养基A、B、C、D,其培养基组成如下A、葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L,酵母膏10g/L,MgS040.1g/L,自来水配制，pH7.0。B、葡萄糖10g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏lg/L,MgS04lg/L,自来水配制，pH8.0。C、葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，MgSO40.3g/L，自来水配制，pH7.5。D、葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L,酵母膏15g/L,MgS045g/L,自来水配制，pH6.0。配制发酵培养基，其培养基组成如下有效霉素15g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L,MgSO40.3g/L,用自来水配制，pH7.5。分别将以上配制好的A、B、C、D种子培养基以100mL每份倒入250mL三角瓶，灭菌。冷却室温后分别接菌种产酸克雷伯氏菌(尺/^wW/ao"toca)CCTCCNo.M205091到A、B、C、D种子培养基中进行培养。10培养温度30°C,摇床转速200rpm,培养时间36h,得到A、B、C、D种子液。将以上配制好的发酵培养基以lOOmL每份倒入250mL三角瓶，灭菌，冷却室温。分别接入以上制得的种子液10mL。在30。C和摇床转速200rpm的条件下发酵120h,取样用HPLC分析发酵液中有效霉烯胺的含量，得到的结果如表l。表l:不同种子培养基的发酵情况<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>收集上述发酵液，离心分离除去菌体，上清液上柱(Dl13树脂，NH/),进行离子交换，用蒸馏水洗涤后，再用0.5mol/L的氨水洗脱，减压浓缩，再将浓缩液上柱层析(Dowex1x2,OIT)，用蒸馏水洗脱，用HPLC方法进行分析，分段收集洗脱液，收集只含有有效霉烯胺的部分，然后进行真空冷冻干燥。得到有效霉烯胺固体。实施例2:配制种子培养，其培养基组成如下葡萄糖15g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，MgSO40.3g/L,自来水配制，pH7.0。分别配制发酵培养基a、b、c、d,其培养基组成如下A:有效霉素5g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉10g/L，MgS04O.lg/L,自来水配制，pH7.0。B:有效霉素20g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L,酵母粉5g/L,MgS041g/L,自来水配制，pH8.0。C:有效霉素50g/L,葡萄糖1g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉1g/L,MgS040.1g/L,自来水配制，pH6.0。D:有效霉素15g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉2g/L,MgS040.3g/L%，用自来水配制，pH7.5。将以上配制好的种子培养基以lOOmL每份倒入250mL三角瓶，灭菌。冷却室温后分别接菌种产酸克雷伯氏菌(K/eZwW/ao;^toca)CCTCCNo.M205091到种子培养基中进行培养。培养温度30°C,摇床转速200卬m,培养时间36h,得到种子液。分别将以上配制好的a、b、c、d发酵培养基以100mL每份倒入250mL三角瓶，灭菌，冷却室温，得到a、b、c、d发酵培养基；分别接入以上制得的种子液8mL。在3CTC和摇床转速200rpm的条件下发酵120h,取样用HPLC分析发酵液中有效霉烯胺的含量，得到的结果如表2。表2:不同发酵培养基的发酵情况发酵培养基8bcd发酵液中有效霉烯胺的含量(吗/ml)9811452301230实施例3:温度对发酵结果的影响配制种子培养基，其培养基组成如下葡萄糖15g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,MgSO40.3g/L,自来水配制，pH7.5。配制发酵培养基,其培养基组成如下有效霉素15g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨5g/L,酵母4分2g/L，MgSO40.3g/L，用自来水配制，pH7.5。分别将以上配制好的种子培养基以100mL每份倒入250mL三角瓶，灭菌。冷却室温后分别菌种产酸克雷伯氏菌(《/efo/e/fe)CCTCCNo.M205091到种子培养基中进行培养。培养温度30°C,摇床转速200rpm,培养时间36h,得到种子液。12将以上配制好的发酵培养基以lOOmL每份倒入250mL三角瓶，灭菌，冷却室温。接入以上制得的种子液10mL。在不同温度条件下进行发酵(25。C、30°C、37°C)、摇床转速200rpm，发酵时间120h,取样用HPLC分析发酵液中有效霉烯胺的含量，得到的结果如表l表3:不同温度条件下的发酵情况温度253037发酵液中有效霉烯胺的含量(昭/ml)3501230864实施例4:配制种子培养基，其培养基组成如下葡萄糖15g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,MgSO40.3g/L,自来水配制，pH7.5。配制发酵培养基，其培养基组成如下有效霉素15g/L，葡萄糖5g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉2g/L,MgSO40.3g/L，用自来水配制，pH7.5。分别将以上配制好的种子培养基以100mL每份倒入250mL,灭菌。冷却室温后分别接菌种产酸克雷伯氏菌(《MwW/aox_ytoca)CCTCCNo.M205091到种子培养基中进行培养。培养温度30°C，摇床转速200rpm,培养时间36h，得到种子液。将以上配制好的发酵培养基以lOOmL每份倒入250mL三角瓶，灭菌，冷却室温。接入以上制得的种子液10mL进行发酵。发酵温度30°C,摇床转速200rpm。在不同的发酵时间取样，用HPLC分析发酵液中有效霉烯胺的含量，得到的结果见图1。由图1可知，发酵时间以100150h为宜，最佳为120~125h。1权利要求1.产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)CCTCCNoM205091微生物发酵制备有效霉烯胺的方法，所述方法包括将CCTCCNoM205091接种至添加有有效霉素的适用于产酸克雷伯氏菌的发酵培养基中，于25～37℃下进行发酵培养72～192小时，发酵液经分离纯化得到所述有效霉烯胺；所述有效霉素在发酵培养基中的起始浓度为5～50g/L。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成如下有效霉素550g/L,葡萄糖l20g/L，蛋白胨l10g/L,酵母粉l10g/L,MgSO40.1~lg/L,溶剂为水，pH6.0~8.0。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)CCTCCNo:M205091接种至种子培养基，25~37°C、通风搅拌或震荡下培养2448小时，得到种子液；所述种子培养基组成如下葡萄糖1040g/L，蛋白胨520g/L，酵母膏l~10g/L,MgSO40.1lg/L，溶剂为水，pH6.08.0;(2)将种子液以体积比5~10%接种量接种至发酵培养基，30~37°C、通风搅拌或震荡下培养100150小时，得到发酵液；所述发酵培养基组成如下有效霉素5~50g/L,葡萄糖l20g/L,蛋白胨110g/L,酵母粉l10g/L，MgSO40.1lg/L,溶剂为水，pH6.08.0;(3)发酵液离心或过滤去除菌体，取上清液或滤液用大孔弱酸性阳离子交换树脂进行离子交换，以氨水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，浓缩液用强^f咸性层析树脂进行层析，以水为洗脱剂，收集只含有有效霉烯胺的部分，冷冻干燥，得到所述有效霉烯胺。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(l)中种子培养基组成如下葡萄糖1015g/L,蛋白胨10~20g/L，酵母膏510g/L,MgS040.3lg/L,溶剂为水，pH7.5~8.0。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中发酵培养基组成如下有效霉素1520g/L，葡萄糖510g/L，蛋白胨l5g/L,酵母4分25g/L,MgSO40.3lg/L,溶剂为水，pH7.5~8.0。全文摘要本发明提供了一种利用克雷伯氏菌属(Klebsiella)的产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)CCTCCNoM205091发酵生产有效霉烯胺的方法。所述方法包括将CCTCCNoM205091接种至添加有有效霉素的适用于产酸克雷伯氏菌的发酵培养基中，于25～37℃下进行发酵培养72～192小时，发酵液经分离纯化得到所述有效霉烯胺；所述有效霉素在发酵培养基中的起始浓度为5～50g/L。文档编号C12P13/00GK101492702SQ200810162418公开日2009年7月29日申请日期2008年11月24日优先权日2008年11月24日发明者沈寅初,王远山,薛亚平,郑裕国,陈小龙申请人:浙江工业大学