专利名称：一种胶质芽孢杆菌的快速pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法。
背景技术：
胶质芽孢杆菌(^a"7/ws附""7"^"0 ^)又称硅酸盐细菌，该菌普遍具有解钾、 固氮、解磷功能。我国从50年代开始对该菌进行大量应用研究，90年代开发成 微生物钾肥在全国大面积推广应用。目前，胶质芽孢杆菌作为重要的微生物钾 肥生产菌，广泛用于农业生产，有效促进了绿色农业的发展。近几年，胶质芽 孢杆菌在冶金、陶瓷、废水处理等热点领域的应用研究也倍受关注，如用于矿 石脱硅，有效提高矿石品质；作为添加剂，改善陶瓷性能；作为絮凝剂用于净 化废水、去除或富集重金属等。胶质芽孢杆菌制剂因安全、环保、易实现工业 化生产等优点，极具应用潜力。
目前关于胶质芽孢杆菌的菌剂已又很多种，目前多用传统的分离培养方法对 该菌进行检测和鉴定。分离培养方法主要依据胶质芽孢杆菌的菌落特征，即透 明、凸起、玻璃样和粘度等，据研究具有相似形态特征的菌种还又其它种如土 壤芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌等，因此传统检测方法明显存在检测结果不可靠、 历时时间长、过程繁琐等缺点。可见，建立一种快速简便的胶质芽孢杆菌检测 方法对相关产品的检测及研究该菌在土壤中的生态学行为将具有重要意义。 gyrB是编码促旋酶B亚单位的基因，由于该基因是单拷贝且具有一定的保守性 和变异度，近年越来越广泛应用于菌种鉴定。本发明在测定胶质芽孢杆菌多个 菌株的g)TB基因的基础上，设计特异性引物，建立了胶质芽孢杆菌的快速PCR 检测方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种胶质芽孢杆菌的快速PCR 检测方法。
一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法包括如下步骤
1) 配制菌体前处理缓冲液，其配方为10mmol/lTris《1， lmmol/lEDTA， pH 8.0;
2) 样品预处理获得菌体；
3) 将菌体用菌体前处理缓冲液洗涤和悬浮，菌体悬液在沸水中温浴3-10 min 后，经4。C、 12000-15000rpm离心10-15min，上清即为DNA样品，冰浴保存；
44) 以DNA样品为模板，特异性PCR扩增g^B基因片段；
5) PCR扩增产物检测与分析。
所述的样品预处理获得菌体步骤对于芽孢形态的微生物样品，将芽孢悬 浮于胶质芽孢杆菌的专用培养液中，28-30'C温浴10-20min使芽孢萌发成菌体， 5000-10000rpm离心3-5min收集菌体；
所述的样品预处理获得菌体步骤对于微生物菌落样品，直接挑取菌落； 对于液体菌体样品，5000-10000rpm离心3-5min收集菌体。
所述的以DNA样品为模板，特异性PCR扩增基因片段步骤
1) 特异性PCR扩增反应体系为20 |il ，包括10x缓冲液2pl， 0.3mmoH—1 的dNTP2 pl，浓度为0.1 |imoH"的上游引物1 jil，浓度为0.1 pmoH-1的下游引 物1 |il， DNA样品l-2|xl， Taq酶0.3-0.5U，去离子水11.7-12.7(il;
2) 特异性PCR扩增程序为94-95'C预变性4-5 min， 94-95""C变性30-60 s， 59-63。C复性30-60 s， 72。C延伸45-60 s，循环30-35次后，72。C延伸8-10 min。
所述的上游引物为F2: 5'-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3，；下游引物 为R5: 5 ，-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3'。
所述的PCR扩增产物检测与分析步骤
1) 取5-10)il的PCR扩增产物，在1.0-1.5 %的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色 10-15 min后，清水漂洗10-15 min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物；
2) 根据PCR扩增产物的有无及其所对应的稀释倍数，计算确定样品中的胶 质芽孢杆菌浓度。
另一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法包括如下步骤
1) 采用溶菌酶-SDS-高盐法提取土壤样品中的DNA;
2) 以DNA为模板，降落式PCR扩增g^B基因片段；
3) PCR产物检测与分析步骤为取5-10pl的PCR产物，在1.0-1.5 %的琼 脂糖凝胶上电泳，EB染色10-15 min后，清水漂洗10-15 min，在凝胶成像系统 上检测PCR扩增产物，根据PCR扩增产物的有无确定样品中是否有胶质芽孢杆 菌。
所述的以DNA样品为模板，降落式PCR扩增g)TB基因片段步骤-
1) PCR反应体系为20^1，包括10x缓冲液2(11， 0.3mmoH"的dNTP2pl， 浓度为0.1 pmoH"的上游引物1 )il，浓度为0.1 pmoH"的下游引物1 pl， DNA 样品l-2pl， Taq酶0.3-0.5U，去离子水ll.7-12.7pl;
2) 降落式PCR扩增程序为95'C预变性5min; 95'C变性30s、 69。C退火30 s，每次下降rC，直到60'C，每个温度循环2次，72"延伸30s; 95'C变性 30 s、 6(TC退火30s、 72。C延伸30s，循环18次；72。C延伸8min。
所述的上游弓I物为F2: 5'-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT國3，；下游弓l物 为R5: 5'-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG隱3'。
本发明与现有技术相比，检测结果准确、时间短、操作简便快捷，为胶质 芽孢杆菌的检测、鉴定及其生长动态研究提供了有效方法。
图1是液体胶质芽孢杆菌样品的gyrB基因特异性PCR扩增产物的电泳图，
M:DNA的Marker; 10—M()-s表示样品的稀释倍数； 图2是土壤微生物菌落样品的gyrB基因特异性PCR扩增产物的电泳图，
M:DNA的Marker; CrC9表示不同的菌落样品； 图3是胶质芽孢杆菌芽孢样品的g^B基因特异性PCR扩增产物的电泳图，
M:DNA的Marker; S表示胶质芽孢杆菌的芽孢样品； 图4是微生物复合肥样品的gyrB基因特异性PCR扩增产物的电泳图，
M:DNA的Marker; 10"-l(^表示微生物复合肥样品的稀释倍数； 图5是耕作层土壤样品的g^B基因特异性PCR扩增产物的电泳图，
M:DNA的Marker; SrS3表示不同的耕作层土壤样品。
具体实施方式
实施例1
本实施例是检测液体的胶质芽孢杆菌样品，采用以下步骤进行
1) 菌体获得将液体的胶质芽孢杆菌样品经10000rpm离心5min后，用菌 体前处理缓冲液洗涤2次，再用菌体前处理缓冲液悬浮菌体，充分振荡混匀， 获得菌体悬液；调整菌体悬液浓度至10、fU，mr1,并进行系列稀释；
2) 菌体裂解取各稀释菌液100nl置于1.5ml离心管中，分别在沸水中温 浴5min，经4。C、 14000 rpm离心10 min，上清即为DNA样品，冰浴保存；
3) 以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gyrB基因片段
a. PCR反应体系为，20 pl :包括10x缓冲液2(xl、 0.3mmoH"的dNTP 2 |il 、浓度为0.1 pmoH"的上游引物1 W、浓度为0.1 pmoH—1的下游引物1 pl、 Taq酶0.3U，去离子水11.7jal， DNA样品2pl;
b. PCR扩增程序为94"C预变性5 min， 94。C变性60 s， 60'C复性45 s, 72°C 延伸45s,循环30次后，72。C延伸10min;
C.上游引物和下游引物序列为上游引物F2: 5 ，-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3 ，； 下游引物R5: 5 ，-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3 ，。 4) PCR产物检测与分析取lOpl的PCR产物，在1.0 %的琼脂糖凝胶上 电泳，EB染色10min后，清水漂洗10 min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增 产物。结果在胶质芽孢杆菌10M()S的稀释液菌液中均检测到约500 bp的特异性 PCR扩增产物(见附图l)，计算得到菌体悬液相对浓度为10、fli，mr1。 实施例2
本实施例的检测样品为从土壤中分离出的微生物菌落，采用以下步骤进行:
1) 菌体获得挑取少量微生物菌落于1.5ml离心管中，用菌体前处理缓冲 液洗涤1次，再用菌体前处理缓冲液悬浮菌体后，充分振荡混匀，获得菌体悬 液；
2) 菌体裂解取以上菌体悬液100pl置于1.5ml离心管中，将各菌液分别 在沸水中温浴3min，经4。C、 12000 rpm离心15 min，上清即为DNA样品，冰 浴保存；
3) 以DNA样品为模板，特异性PCR扩增g^B基因片段
a. PCR反应体系为20^1 :包括10x缓冲液2^1、 0.3mmoH'1的dNTP 2 ^ 、浓度为0.1 pmoH"上游引物1 ^、浓度为0.1 iamoH"下游引物1 pl、 Taq酶 0.5U,去离子水12.7^1， DNA样品lpl;
b. PCR扩增程序为95'C预变性4min， 95t:变性30s， 6rC复性60s， 72°C 延伸60 s,循环30次后，72。C延伸10 min;
c. 上游引物和下游引物序列为
上游引物F2: 5'-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT國3，； 下游弓l物R5: 5'-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3，。
4) PCR产物检测与分析取lOpl的PCR产物，在1.0 %的琼脂糖凝胶上 电泳，EB染色10min后，清水漂洗10 min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增 产物。结果在所检测的9个微生物菌落样品中，有3个样品产生约500bp特异 性PCR扩增产物(见附图2)，表明这3个样品为胶质芽孢杆菌。
实施例3
本实施例的检测样品为胶质芽孢杆菌的芽孢，采用以下步骤进行 1)芽孢萌发取胶质芽孢杆菌的芽孢悬浮于胶质芽孢杆菌专用培养液中， 3(TC温浴10min，使芽孢萌发成菌体；
胶质芽孢杆菌专用培养液的配方为蔗糖0.5%， 0.1%K2HPO4， 0.02%
7MgS04.7H20， pH7.5。
2) 菌体制备将萌发后的菌体，用菌体前处理缓冲液洗涤二次后，用菌体 前处理缓冲液悬浮，充分振荡混匀，获得菌体悬液；
3) 菌体裂解取以上菌体悬液200 pi置于1.5ml离心管中，在沸水中温浴 8min，于4。C、 15000rpm离心10 min，上清即为DNA样品，冰浴保存；
4) 以DNA样品为模板，特异性PCR扩增g^B基因片段
a. PCR反应体系为20^1 :包括10x缓冲液2pl、 0.3mmoH'1的dNTP 2 W 、浓度为0.1 [xmoH"上游引物1 ^d、浓度为0.1 pmoH"下游引物1 pl、 Taq酶 0.3U，去离子水12.2 pi, DNA样品1.5
b. PCR扩增程序为94"C预变性5 min， 94"变性45 s， 62'C复性45 s， 72°C 延伸50s，循环30次后，72。C延伸10min;
c. 上游引物和下游引物序列为
上游引物F2: 5'-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT画3，； 下游引物R5: 5 ，腸ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3 ，。
5) PCR产物检测与分析取10pl的PCR产物，在1.0 %的琼脂糖凝胶上 电泳，EB染色10min后，清水漂洗10 min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增 产物。结果在胶质芽孢杆菌的芽孢样品中检测到约500bp的特异性PCR扩增产 物(见附图3)。
本实施例的检测样品为含有胶质芽孢杆菌的微生物复合肥，采用以下步骤 进行
1) 芽孢萌发取微生物菌剂5ml，经5000 rpm离心3 min，将芽孢悬浮于 胶质芽孢杆菌专用培养液中，28"C温浴20min，使芽孢萌发成菌体；
2) 菌体制备将萌发后的菌体，用菌体前处理缓冲液洗涤二次后，用菌体 前处理缓冲液悬浮，充分振荡混匀，获得菌体悬液，并进行系列稀释；
3) 菌体裂解取以上萌发后的菌体稀释液200pl置于1.5ml离心管中，在 沸水中温浴10min,于4。C、 14000rpm离心12 min，上清即为DNA样品，冰浴 保存；
4) 以DNA样品为模板，特异性PCR扩增g^B基因片段 a.PCR反应体系为20|il :包括10x缓冲液2^、0.3mmoH'的dNTP2pl 、
浓度为O.l )imoW"上游引物l pl、浓度为0.1 pmoH"下游引物l pl、Taq酶0.3U, 去离子水11.7|il， DNA样品2 )J;
8b. PCR扩增程序为95'C预变性5 min， 95。C变性50 s， 62。C复性45 s， 72°C 延伸60s，循环30次后，72"C延伸10min;
C.上游引物和下游引物序列为
上游弓I物F2: 5 ，-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT画3 ，； 下游引物R5: 5，-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3，。 5) PCR产物检测与分析取lOpl的PCR产物，在1.0 %的琼脂糖凝胶上 电泳，EB染色12min后，清水漂洗12 min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增 产物。结果在10M()S的稀释菌液中均检测到约500bp的特异性PCR扩增产物(附 图4)，计算得出微生物复合肥样品中胶质芽孢杆菌的相对浓度为10Scfb，mr1。 实施例5
本实施例的检测样品为耕作层土壤，采用以下步骤进行
1) 土壤样品预处理:称取300mg 土壤样品，加1.8ml缓冲液旋涡振荡10min， 4°C、 12000rpm离心5min，去上清；
缓冲液配方50mMTris, 20mMEDTA， 100mMNaCl， 0.01g/ml PVPP， pH10。
2) DNA提取在预处理过的土壤样品中加入0.05g石英砂和300^1 DNA提 取缓冲液旋涡振荡10min，加入10fil 100mg'mr1溶菌酶，混匀，37'C温浴30min; 加300^1 SDS缓冲液，混匀，65。C温浴30min， 4°C、 8000rpm离心15min，收集 中间液相层，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，温和混匀3min; 4°C、 15000rpm 离心15min，收集上清，加入O.l倍体积的3MNaAC(pH5.2)，温和混匀后，加 入0.6倍体积的异丙醇，-20°。沉淀lh; 4°C、 15000rpm离心15min，弃上清; 用70%乙醇洗涤一次，真空干燥3min后，加30^1 TE溶解即为DNA样品。
DNA提取缓冲液配方lOOmMTris， 100mMEDTA， 200mMNaCl， 1%PVP， 2%CTAB， pH8.0;
SDS缓冲液配方lOOmMTris, 200mMNaCl， 3%SDS， pH9.0。
3) 以DNA样品为模板，降落式PCR扩增g^B基因片段步骤. a. PCR反应体系为 20^1 :包括10x缓冲液2^1、 0.3mmoH"的dNTP 2
W 、浓度为0.1 jimoH"上游引物1 ^d、浓度为0.1 pmol.r1下游引物1 pl、 Taq酶 0.3U，去离子水11.7^1， DNA样品2pl;
b.降落式PCR扩增程序为95。C预变性5 min; 95。C变性30 s、 69。C退火 30 s，每次下降rC，直到60。C，每个温度循环2次，72。C延伸30s; 95'C变性 30 s、 6(TC退火30s、 72。C延伸30s，循环18次；72。C延伸8min。
9C.上游引物和下游引物序列为
上游弓I物F2: 5，國ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3，；下游引物R5: 5，-ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3，。4) PCR产物检测与分析取1(^1的PCR产物，在1.0 %的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色15min后，清水漂洗15 min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物。结果在3个土壤样品中均检测到约500bp的特异性PCR扩增产物(见附图5)。
权利要求
1.一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤1)配制菌体前处理缓冲液，其配方为10mmol/l Tris·Cl，1mmol/l EDTA，pH 8.0；2)样品预处理获得菌体；3)将菌体用菌体前处理缓冲液洗涤和悬浮，菌体悬液在沸水中温浴3-10min后，经4℃、12000-15000rpm离心10-15min，上清即为DNA样品，冰浴保存；4)以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gyrB基因片段；5)PCR扩增产物检测与分析。
2. 根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的样品预处理获得菌体步骤对于芽孢形态的微生物样品，将芽孢悬 浮于胶质芽孢杆菌的专用培养液中，28-3(TC温浴10-20min使芽孢萌发成菌体， 5000-10000rpm离心3-5min收集菌体。
3. 根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的样品预处理获得菌体步骤对于微生物菌落样品，直接挑取菌落； 对于液体菌体样品，5000-10000rpm离心3-5min收集菌体。
4. 根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gvrB基因片段步骤1) 特异性PCR扩增反应体系为20|il，包括10x缓冲液2^1， 0.3mmoH'1 的dNTP2 pi,浓度为0.1 pmoH"的上游引物1 pl，浓度为0.1 pmoR1的下游引 物lpl， DNA样品l-2pl， Taq酶0.3-0.5U，去离子水ll.7-12.7pl;2) 特异性PCR扩增程序为94-95"C预变性4-5 min， 94-95°(3变性30-60 s， 59-63。C复性30-60 s， 72。C延伸45-60 s，循环30-35次后，72。C延伸8-10 min。
5. 根据权利要求4所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的上游引物为F2: 5'-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3';下游引物 为R5: 5'國ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG画3,。
6. 根据权利要求1所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的PCR扩增产物检测与分析步骤1) 取5-10pl的PCR扩增产物，在1.0-1.5 %的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色 10-15 min后，清水漂洗10-15 min，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物；2) 根据PCR扩增产物的有无及其所对应的稀释倍数，计算确定样品中胶质 芽孢杆菌的相对浓度。
7. —种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤1) 采用溶菌酶-SDS-高盐法提取土壤样品中的DNA;2) 以DNA样品为模板，降落式PCR扩增g^B基因片段；3) PCR产物检测与分析步骤为取5-10pl的PCR产物，在1.0-1.5 %的琼 脂糖凝胶上电泳，EB染色10-15 min后，清水漂洗10-15 min，在凝胶成像系统 上检测PCR扩增产物，根据PCR扩增产物的有无确定样品中是否有胶质芽孢杆 菌。
8. 根据权利要求7所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的以DNA样品为模板，降落式PCR扩增gyrB基因片段步骤1) PCR反应体系为20 pl，包括10x缓冲液2 pl， 0.3mmoH"的dNTP2 pl， 浓度为O.l jimoH-1的上游引物1 pl，浓度为O.l pmoH"的下游引物1 )il， DNA 样品l-2pl， Taq酶0.3-0.5U，去离子水11.7-12.7^1;2) 降落式PCR扩增程序为95。C预变性5min; 95。C变性30s、 69。C退火 30s，每次下降rC，直到6(TC，每个温度循环2次，72。C延伸30s; 95。C变性 30 s、 6(TC退火30s、 72。C延伸30s，循环18次；72。C延伸8min。
9. 根据权利要求8所述的一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法，其特征 在于所述的上游引物为F2: 5'-ACGGATATCTCCCAGACGTTCAT-3';下游引物 为R5: 5'画ACGGGCACGCTGCGCCTGTACG-3'。
全文摘要
本发明公开了一种胶质芽孢杆菌的快速PCR检测方法。包括如下步骤1)配制菌体前处理缓冲液，其配方为10mmol/l Tris·Cl，1mmol/l EDTA，pH 8.0；2)样品预处理获得菌体；3)将菌体用菌体前处理缓冲液洗涤和悬浮，充分振荡混匀后，在沸水中温浴3-10min，经4℃、12000-15000rpm离心10-15min，上清即为DNA样品，冰浴保存；4)以DNA样品为模板，特异性PCR扩增gyrB基因片段；5)PCR扩增产物检测与分析。本发明应用特异性PCR检测方法快速检测和鉴定胶质芽孢杆菌。
文档编号C12Q1/68GK101492731SQ20081016258
公开日2009年7月29日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者吴金光, 方琼楼, 胡秀芳, 陈集双 申请人:浙江理工大学