专利名称：一种蛹虫草菌种的快速检测方法
技术领域：
本发明属虫草检测领域，特别是涉及一种蛹虫草菌种的快速检测方法。
背景技术：
冬虫夏草与人参、鹿茸堪称三大保健补品，尤其是冬虫夏草已经成为各种名贵中成药的重要成分。但野生冬虫夏草很少，我国在80年代已成功的研究出人工栽培蛹虫草 (又叫北虫草)技术。研究证明蛹虫草的营养与保健成分及含量优于冬虫夏草，目前用蛹虫草代替冬虫夏草已经成为事实，大力发展蛹虫草栽培有很大的经济效益。国内外市场对虫草及其深加工产品的旺盛需求，则为虫草的人工栽培提供了良好的市场机遇。和其他食用菌一样，只有人工栽培才能满足市场的需求。随着蛹虫草人工培育技术的逐渐成熟，产业化规模正在不断扩大。但是有许多问题，比如菌种退化，栽培过程不出菇等问题都在阻碍蛹虫草人工培育技术的发展，由于真菌繁殖的特殊性，一个试管菌种往往会放大成千上万瓶， 一个试管的菌种退化在实际生产中将造成巨大的损失。因此需在试管菌种生产阶段实行检测，以掌握正常出菇的情况。目前，对于蛹虫草菌种的DNA序列的测定及分析已有许多文献报道(见图1)；而关于快速检测蛹虫草菌种的以判断其是否能正常出菇的方法尚未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种蛹虫草菌种的快速检测方法，该检测方法具有检测时间短，准确性高，提高效率，减少损失等优点。本发明的一种蛹虫草菌种的快速检测方法，包括下列步骤(1)菌株或子实体基因组DNA的提取将子实体及菌丝，放入-20°C冰箱冻存，用CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至 50ng/yL, _20°C冰箱贮藏备用；(2)蛹虫草菌种或其子实体特异DNA片段的获得对应457bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为2F 5' CCGTCATCTGCAAGAGGAGACAAT3‘；2R 5' GCTTCCAATACGTTCCATGAAC CCT3‘；对应1031bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为3F 5' TTCCTTCGCTTCCCTGAGTTCTGT3‘；3R 5' GGCAGACATCGTACC TGGTCAAAT3‘；对应819bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为IF 5' TCAACAATCCTCCATTTCCTCCAGC3‘；IR 5' CTACATGATTGACTCCGGGCTCATTG3‘；应用以上引物分别对蛹虫草菌种或其子实体DNA进行扩增；其扩增得到的DNA片段的序列分别是
2F/2R弓丨物对所扩增的DNA序列为5-CCGTCATCTGCAAGAGGAGACAATATTGCAGATCGCCGCAAAGTGCTTCGAAGACAAAGAAAAGGAG AACAATTCGACAAAATACTCCAAGCCTCAATCGACCCTTCATTTCACGGAGCCGCAACGAGCCTTGCCACAGAAGAG AAGCAACAGCAAGCAGGCCGGAGACCGCGCAAAACGACCATTGAATGCTTTCATCGCATTCAGAAGTGAGTGCAGAA TATTAATTTCCCTCGAGAACAAATCTAACTCCAATGATTAAAAGGCTACTACGTGAAACTATTTCCAGAGTCGCAAC AAAAGGCGGCGTCCGGCTTCCTCACGACACTCTGGAATAAAGACCCGTTCAGAAATCGCTGGGCAATGATCGCGAAG GTATATACTTTCATTCGCGATGAGATGGGAAAGAAGAGGGCTCCCCTCTCCTCATTTCTGATGGCTGCTTGTCCGGC AATGGACATTTTACCTCCTGATGAGTACCTTCAGGTTCTGGGCTGGGCAGTCGAAGATACCGAACAAGGTACCAAGA TGCTTGTTCAGACGCTTGTCCAATACAAGTCATGGTACAATATGCACATTATCTTCAAGGATCCATGATCCAACTCT ATTCGCCGACCTCACGATCGTCCGCCCAGCGCACCAATGACATGATCCGCCACCGCCAAGTCCTCGTCCGGAGCGCC TTGCCCCCcAAGTATAAGGGAATCCACATGATAATGACAGCCGCCGAGATGCCAGCCATGGCGCCATATGTATTTTG ATAGCCAGACTTGTTGATCCAAGGGTTTGTCTCGAAGGAAAGGAAAAATCCGAATAGTGCTGTACAGATCTGTGTTA GCGCAGGGTTCATGGAACGTATTGGAAGC-3 ； 3F/3R弓丨物对所扩增的DNA序列为5-TTCAGCTTCAGTCCGTTCTGGGCCGAGGACGAGTGCATTGTAGATTCAGAATCTGCCATCGACTCAA TCCGATGCCATGCTTTACGAGTTTCTCTGGAAAAGAACAGGGGAAGGGAAGAGAAACTACCGTGCCTGCAGGGTACG CGGTCTCTGGTCGGTTTGATATTTTGTCGCTAACCAAGTGCACCTAGATGTACTAGAAGATGTCATCTACGCGATCG AGAGCCTACTATGGAACCCCCGAGACGACAACATTATAATAAACCGAATAGTTGCGCTCGGCGTAGAAGAGACGATC GACCCCGTCCTGCTGGTCAAAGAAGCGATCGCCCACTGGTACATTAGCGCAGTGCCAATCTCAACCCGAGATCCTCA CCATGGCTTGCCGCCGGACGCAGAGATAGAGCAGGAGGACGGCGCGACAATACTGAGATGGAATCGACAATATGCAG CTGAGAAACACGAAATAGCGAACCTCGGTCTCATAGCAATGCTCTTGACATCTGAGACATGGTCCCGTCCTGAAAGC CCAACTTTGCGGTTAGGGACATTAGTGGCAAACGCCGCCACTGCAATTTTATTCGGAGCTTTCATGATTATACCGAA AATTAGCATCAGAGAATCTTCAAATTTGCTGGTATCAGTCCTGAAAGATAACGAAGCGATGCGATTATATCTGAGAA CCACCTGGCAATTGGCTCAAGATGGCGCTTCAAAATACACACACTCGCCGTCCGCTGAGTTCGGAACAACTACATCT GAGGTTAAAATTGATCATGCTGGAAAGCGACTCTTGAATAAGGTTGGACAAGAGAACTGGCCTGTGGCGTCGCTTTGGCATTCTAGTCGAAAGACCCCCGGTTCTGCTTG GAATAAATCATGAGGAATACACAGCAACCATATTTCCCCTGCAAGAAAATCAAAACTGAGATTCGATATCGACTTCC AAGCTCTTGTCTCTCTTTAGCCGAGCCTTGGGAGGTATATTATTCTGAGCTGCGCTCCAAATTTGACCAGGTACGAT GTCTGCC-3 ；1F/1R引物对所扩增的DNA序列为5-ATGGATCTGCAACTGGATCGGACCAGACTCCAAGATCAGGAGCTTTGGGATGCCGTCAGCGTCGGCA TCAACCCATTTGTGAAAGTTCTCAGTATCGACGGTCTCATCTACCGTTCCTTGACTGTGAAAACAAAAAGATCTTTG GCTGAAAATTTCGTGTAAGGACACATCCATGGCGACATTTGGGCGGCGCGCTAACTTTGCCAAGCAAACACGTACAA GAACCAGTCATGTTTTGTCGCGATGGTTTTGGCCCAGACAGATACTTCCTTGGAAATCCACGACATTTGATGTCCGG CACTGGCATCATTCTAGCTGCCGCGGAAGTAGAGCCTATTTGGTTTGAACAACCAGGCTTGAAGTACCAAAAGGCGA CCATGTGTCAGTCGTCGCTTCCACGCAAACACATCAAGATCCCGAGGCCACCCAATGCGTATATTCTATACCGCAGA GACCGACATACGCTTGTCAAGAAAAGCGAGCCACATTTGTCGAACAATGAAGTTTGTAAGAGCAACTGTACGCCCCC TAAAGATAAAGTTACTGACCATTCATAGCGCAAGTGCTTGGTAAAGCTTGGAATGCAGAACCTCCAGAGGTGCGACA ACGCTACAAGGAAATGTCGGAGAGGATCAAGAAGGCTCTCCTCGAACGGCATCCCCAATATCAATATCAACCTCGCAAACCCTCTGAGCGGAAGCGACGCCGCAAGCGCACTCAGGATACCGAATCTCAAAGCAGTGAGACTACGTCGGCAACG CCAGACAGCACCATTATGACAGGAAGCGAGCTTTCAATGAGCCCGGAGTCAATCATGTAG-3 ；(3)特异PCR扩增引物的获得以上述扩增得到的DNA片段的序列为基础，分别设计457bp，1031bp及819bp的特异PCR扩增引物，引物对的序列如下457bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为45 7bpF 5 ‘ ATGGAACACAGATCGAGCGACACT3 ‘ ； 4 5 7bpR 5' ATATACCTTCGCGATCATTGCCCAG3‘；1031bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为103 IbpF 5 ‘ T T C AG C T T C AG T C C G T T C T G G A C A 3 ‘ ； 103 IbpR 5' GGCAGACATCGTACCTGGTCAAAT3‘；819bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为8 1 9bpF 5 ‘ A T G G A T C T G C A A C T G G A T C G G A C C A 3 ‘ ；8 19bpR 5' CTACATGATTGACTCCGGGCTCATTG3‘。(4)与蛹虫草子实体形成有关的分子标记的PCR扩增457bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是5-ATGGAACACAGATCGAGCGACACTGAGCATCAAGAGCTGCTTAGGCGGCTCTCAACCGTCTCTTCA CATACAATTCTCCGTCATCTGCAAGAGGAGACAATATTGCAGATCGCCGCAAAGTGCTTCGAAGACAAAGAAAAGG AGAACAATTCGACAAAATACTCCAAGCCTCAATCGACCCTTCATTTCACGGAGCCGCAACGAGCCTTGCCACAGA AGAGAAGCAACAGCAAGCAGGCCGGAGACCGCGCAAAACGACCATTGAATGCTTTCATCGCATTCAGAAGTGAGT GCAGAATATTAATTTCCCTCGAGAACAAATCTAACTCCAATGATTAAAAGGCTACTACGTGAAACTATTTCCAGA GTCGCAACAAAAGGCGGCGTCCGGCTTCCTCACGACACTCTGGAATAAAGACCCGTTCAGAAATCGCTGGGCAAT GATCGCGAAGGTATAT-3 ；1031bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是5-TTCAGCTTCAGTCCGTTCTGGGCCGAGGACGAGTGCATTGTAGATTCAGAATCTGCCATCGACTCAA TCCGATGCCATGCTTTACGAGTTTCTCTGGAAAAGAACAGGGGAAGGGAAGAGAAACTACCGTGCCTGCAGGGTACG CGGTCTCTGGTCGGTTTGATATTTTGTCGCTAACCAAGTGCACCTAGATGTACTAGAAGATGTCATCTACGCGATCG AGAGCCTACTATGGAACCCCCGAGACGACAACATTATAATAAACCGAATAGTTGCGCTCGGCGTAGAAGAGACGATC GACCCCGTCCTGCTGGTCAAAGAAGCGATCGCCCACTGGTACATTAGCGCAGTGCCAATCTCAACCCGAGATCCTCA CCATGGCTTGCCGCCGGACGCAGAGATAGAGCAGGAGGACGGCGCGACAATACTGAGATGGAATCGACAATATGCAG CTGAGAAACACGAAATAGCGAACCTCGGTCTCATAGCAATGCTCTTGACATCTGAGACATGGTCCCGTCCTGAAAGC CCAACTTTGCGGTTAGGGACATTAGTGGCAAACGCCGCCACTGCAATTTTATTCGGAGCTTTCATGATTATACCGAA AATTAGCATCAGAGAATCTTCAAATTTGCTGGTATCAGTCCTGAAAGATAACGAAGCGATGCGATTATATCTGAGAA CCACCTGGCAATTGGCTCAAGATGGCGCTTCAAAATACACACACTCGCCGTCCGCTGAGTTCGGAACAACTACATCT GAGGTTAAAATTGATCATGCTGGAAAGCGACTCTTGAATAAGGTTGGACAAGAGAACTGGCCTGTGGCGTCGCTTTG GCATTCTAGTCGAAAGACCCCCGGTTCTGCTTGGAATAAATTCATGAGGAATACACAGCAACCATATTTCCCCTGCA AGAAAATCAAAACTGAGATTCGATATCGACTTCCAAGCTCTTGTCTCTCTTTAGCCGAGCCTTGGGAGGTATATTAT TCTGAGCTGCGCTCCAAATTTGACCAGGTACGATGTCTGCC-3 ；819bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是
5-ATGGATCTGCAACTGGATCGGACCAGACTCCAAGATCAGGAGCTTTGGGATGCCGTCAGCGTCGGCA TCAACCCATTTGTGAAAGTTCTCAGTATCGACGGTCTCATCTACCGTTCCTTGACTGTGAAAACAAAAAGATCTTTG GCTGAAAATTTCGTGTAAGGACACATCCATGGCGACATTTGGGCGGCGCGCTAACTTTGCCAAGCAAACACGTACAA GAACCAGTCATGTTTTGTCGCGATGGTTTTGGCCCAGACAGATACTTCCTTGGAAATCCACGACATTTGATGTCCGG CACTGGCATCATTCTAGCTGCCGCGGAAGTAGAGCCTATTTGGTTTGAACAACCAGGCTTGAAGTACCAAAAGGCGA CCATGTGTCAGTCGTCGCTTCCACGCAAACACATCAAGATCCCGAGGCCACCCAATGCGTATATTCTATACCGCAGA GACCGACATACGCTTGTCAAGAAAAGCGAGCCACATTTGTCGAACAATGAAGTTTGTAAGAGCAACTGTACGCCCCC TAAAGATAAAGTTACTGACCATTCATAGCGCAAGTGCTTGGTAAAGCTTGGAATGCAGAACCTCCAGAGGTGCGACA ACGCTACAAGGAAATGTCGGAGAGGATCAAGAAGGCTCTCCTCGAACGGCATCCCCAATATCAATATCAACCTCGCA AACCCTCTGAGCGGAAGCGACGCCGCAAGCGCACTCAGGATACCGAATCTCAAAGCAGTGAGACTACGTCGGCAACG CCAGACAGCACCATTATGACAGGAAGCGAGCTTTCAATGAGCCCGGAGTCAATCATGTAG-3 ；(5)琼脂糖凝胶电泳检测。所述步骤(4)的扩增体系为25μL，10XLAPCR buffer II (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, dNTP (各 2· 5mM)4uL，5U/y L TaKaRa LA Taq DNA 酶 0. 25 μ L，10 μ mol/L 蛹虫草菌株检测专用引物对各 0.5 μ L，模板 DNA 0.5“1^(浓度50叫/^1^)，(1(1!120 16. 75 μ L ;PCR 反应条 # 95°C 5min ；95°C 30second, 55°C 30second, 72°C Imin 或 90second，30 个循环；72°C IOmin ；所述步骤(5)中的电泳检测为取步骤G) PCR扩增产物6 μ L，与IyL加样缓冲液混勻，点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于0. 5ΧΤΒΕ缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。本发明采用PCR技术，设计特异PCR扩增引物，通过对蛹虫草菌株的特异片段检测从而对蛹虫草菌株进行鉴定和检测，检测所需时间只需要1-2天，而蛹虫草的出菇试验一般需要50天左右的时间；该方法在出菇试验之前做，可以预先判定所检测菌株是否不能正常出菇；通过此方法既减少了成本又提高了效率。该方法在我国所收集的15种不同的蛹虫草菌株中具有通用性。通过分子生物学的方法扩增特异性条带，可以根据特异性条带的扩增情况来判断所用蛹虫草菌株是否不能正常出菇。三条长度分别是457bp，1031bp和819bp的特异性条带，若长819bp的条带与其余两条带G57bp和1031bp)中的一个或两个不能同时扩出，则可断定该所检测菌株在栽培试验中不能正常出菇。有益效果本发明的检测方法具有检测时间短，准确性高，提高效率，减少损失等优点；在试管菌种生产阶段进行检测，可检测出50%不能正常出菇的菌株，从而可以在实际生产中减少50%不出子实体的损失。
图1是蛹虫草菌种特异DNA条带的扩增图谱；(其中，M :D2000 ；1 与819bp的DNA片段相对应；2 与457bp的DNA片段相对应； 3 与103Ibp的DNA片段相对应。)图2是农益科技有限公司1号菌株及其子实体1031bp特异性条带的扩增图谱；
图3是农益科技有限公司1号菌株及其子实体457bp特异性条带的扩增图谱；图4是农益科技有限公司1号菌株及其子实体819bp特异性条带的扩增图谱；(其中，图2，图3和图4中的M:D2000 ；1 农益科技有限公司1号菌株的子实体
1；2 农益科技有限公司1号菌株的子实体2 ；3 农益科技有限公司1号菌株的菌丝1 ；4 农益科技有限公司1号菌株的菌丝2 ；5 农益科技有限公司1号菌株的菌丝3 ；6 农益科技有限公司1号菌株的菌丝4 ；7 农益科技有限公司1号菌株的菌丝5 ；8 农益科技有限公司1 号菌株的菌丝6 ；9 农益科技有限公司1号菌株的菌丝7 ；10 农益科技有限公司1号菌株的菌丝8 ;11 农益科技有限公司1号菌株的菌丝9 ;12 农益科技有限公司1号菌株的菌丝 10)；图5是农益科技有限公司2号菌株及其子实体457bp特异性条带的扩增图谱；图6是农益科技有限公司2号菌株及其子实体1031bp特异性条带的扩增图谱；图7是农益科技有限公司2号菌株及其子实体819bp特异性条带的扩增图谱；(其中，图5，图6和图7中的M:D2000 ；1 农益科技有限公司2号菌株的子实体；
2农益科技有限公司2号菌株的畸形子实体；3 农益科技有限公司2号菌株畸形子实体培养料上的菌丝；4 农益科技有限公司2号菌株的菌丝)；图8是所收集的不同蛹虫草菌种的457bp特异性条带的扩增图谱；图9是所收集的不同蛹虫草菌种的1031bp特异性条带的扩增图谱；图10是所收集的不同蛹虫草菌种的819bp特异性条带的扩增图谱；(其中，图8，图9和图10中的M:D2000 ;1 :1804江苏徐州；2 :1806上海农科院食用菌所；3 :1807上海农科院植保所；4 :1809南汇大中；5 :1810韩国CM-Ol ；6 :03169来源不知；7 611沈阳农业大学食用菌研究所；8 :NX沈阳农业大学食用菌研究所；9 上海农科院瑞丰公司)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1农益科技有限公司1号菌株及其子实体的检测鉴定(1)菌株或子实体基因组DNA的提取将子实体及菌丝，放入-20°C冰箱冻存，用CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至 50ng/yL, _20°C冰箱贮藏备用；(2)蛹虫草菌种或其子实体特异DNA片段的获得通过摸索得到蛹虫草的特异DNA片段，这三条DNA带并不一定同时存在于一种蛹虫草中，但是它们在蛹虫草中普遍存在，所以可以作为一种分子标记；对应457bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为2F 5' CCGTCATCTGCAAGAGGAGACAAT3‘；2R 5' GCTTCCAATACGTTCCATGAAC CCT3‘；
对应1031bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为3F 5' TTCCTTCGCTTCCCTGAGTTCTGT3‘；3R 5' GGCAGACATCGTACC TGGTCAAAT3‘；对应819bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为IF 5' TCAACAATCCTCCATTTCCTCCAGC3‘；IR 5' CTACATGATTGACTCCGGGCTCATTG3‘；应用以上引物分别对蛹虫草菌种或其子实体DNA进行扩增；其扩增得到的DNA片段的序列分别是2F/2R弓丨物对所扩增的DNA序列为5-CCGTCATCTGCAAGAGGAGACAATATTGCAGATCGCCGCAAAGTGCTTCGAAGACAMGAAAAGGAG AACAATTCGACAAAATACTCCAAGCCTCAATCGACCCTTCATTTCACGGAGCCGCAACGAGCCTTGCCACAGAAGAG AAGCAACAGCAAGCAGGCCGGAGACCGCGCAAAACGACCATTGAATGCTTTCATCGCATTCAGAAGTGAGTGCAGAA TATTAATTTCCCTCGAGAACAAATCTAACTCCAATGATTAAAAGGCTACTACGTGAAACTATTTCCAGAGTCGCAAC AAAAGGCGGCGTCCGGCTTCCTCACGACACTCTGGAATAAAGACCCGTTCAGAAATCGCTGGGCAATGATCGCGAAG GTATATACTTTCATTCGCGATGAGATGGGAAAGAAGAGGGCTCCCCTCTCCTCATTTCTGATGGCTGCTTGTCCGGC AATGGACATTTTACCTCCTGATGAGTACCTTCAGGTTCTGGGCTGGGCAGTCGAAGATACCGAACAAGGTACCAAGA TGCTTGTTCAGACGCTTGTCCAAATACAAGTCATGGTACAATATGCACATTATCTTCAAGGATCCATGATCCAACTC TATTCGCCGACCTCACGATCGTCCGCCCAGCGCACCAATGACATGATCCGCCACCGCCAAGTCCTCGTCCGGAGCGC CTTGCCCCCcAAGTATAAGGGAATCCACATGATAATGACAGCCGCCGAGATGCCAGCCATGGCGCCATATGTATTTT GATAGCCAGACTTGTTGATCCAAGGGTTTGTCTCGAAGGAAAGGAAAAATCCGAATAGTGCTGTACAGATCTGTGTT AGCGCAGGGTTCATGGAACGTATTGGAAGC-3 ；3F/3R弓丨物对所扩增的DNA序列为5-TTCAGCTTCAGTCCGTTCTGGGCCGAGGACGAGTGCATTGTAGATTCAGAATCTGCCATCGACTCAA TCCGATGCCATGCTTTACGAGTTTCTCTGGAAAAGAACAGGGGAAGGGAAGAGAAACTACCGTGCCTGCAGGGTACG CGGTCTCTGGTCGGTTTGATATTTTGTCGCTAACCAAGTGCACCTAGATGTACTAGAAGATGTCATCTACGCGATCG AGAGCCTACTATGGAACCCCCGAGACGACAACATTATAATAAACCGAATAGTTGCGCTCGGCGTAGAAGAGACGATC GACCCCGTCCTGCTGGTCAAAGAAGCGATCGCCCACTGGTACATTAGCGCAGTGCCAATCTCAACCCGAGATCCTCA CCATGGCTTGCCGCCGGACGCAGAGATAGAGCAGGAGGACGGCGCGACAATACTGAGATGGAATCGACAATATGCAG CTGAGAAACACGAAATAGCGAACCTCGGTCTCATAGCAATGCTCTTGACATCTGAGACATGGTCCCGTCCTGAAAGC CCAACTTTGCGGTTAGGGACATTAGTGGCAAACGCCGCCACTGCAATTTTATTCGGAGCTTTCATGATTATACCGAA AATTAGCATCAGAGAATCTTCAAATTTGCTGGTATCAGTCCTGAAAGATAACGAAGCGATGCGATTATATCTGAGAA CCACCTGGCAATTGGCTCAAGATGGCGCTTCAAAATACACACACTCGCCGTCCGCTGAGTTCGGAACAACTACATCT GAGGTTAAAATTGATCATGCTGGAAAGCGACTCTTGAATAAGGTTGGACAAGAGAACTGGCCTGTGGCGTCGCTTTG GCATTCTAGTCGAAAGACCCCCGGTTCTGCTTGGAATAAATTCATGAGGAATACACAGCAACCATATTTCCCCTGCA AGAAAATCAAAACTGAGATTCGATATCGACTTCCAAGCTCTTGTCTCTCTTTAGCCGAGCCTTGGGAGGTATATTAT TCTGAGCTGCGCTCCAAATTTGACCAGGTACGATGTCTGCC-3 ；1F/1R引物对所扩增的DNA序列为5-ATGGATCTGCAACTGGATCGGACCAGACTCCAAGATCAGGAGCTTTGGGATGCCGTCAGCGTCGGCA TCAACCCATTTGTGAAAGTTCTCAGTATCGACGGTCTCATCTACCGTTCCTTGACTGTGAAAACAAAAAGATCTTTGGCTGAAAATTTCGTGTAAGGACACATCCATGGCGACATTTGGGCGGCGCGCTAACTTTGCCAAGCAAACACGTACAA GAACCAGTCATGTTTTGTCGCGATGGTTTTGGCCCAGACAGATACTTCCTTGGAAATCCACGACATTTGATGTCCGG CACTGGCATCATTCTAGCTGCCGCGGAAGTAGAGCCTATTTGGTTTGAACAACCAGGCTTGAAGTACCAAAAGGCGA CCATGTGTCAGTCGTCGCTTCCACGCAAACACATCAAGATCCCGAGGCCACCCAATGCGTATATTCTATACCGCAGA GACCGACATACGCTTGTCAAGAAAAGCGAGCCACATTTGTCGAACAATGAAGTTTGTAAGAGCAACTGTACGCCCCC TAAAGATAAAGTTACTGACCATTCATAGCGCAAGTGCTTGGTAAAGCTTGGAATGCAGAACCTCCAGAGGTGCGACA ACGCTACAAGGAAATGTCGGAGAGGATCAAGAAGGCTCTCCTCGAACGGCATCCCCAATATCAATATCAACCTCGCA AACCCTCTGAGCGGAAGCGACGCCGCAAGCGCACTCAGGATACCGAATCTCAAAGCAGTGAGACTACGTCGGCAACG CCAGACAGCACCATTATGACAGGAAGCGAGCTTTCAATGAGCCCGGAGTCAATCATGTAG-3 ；(3)特异PCR扩增引物的获得以上述扩增得到的三条DNA片段的序列为基础，分别设计457bp，1031bp及819bp 的特异PCR扩增引物，引物对的序列如下457bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为45 7bpF 5 ‘ ATGGAACACAGATCGAGCGACACT3 ‘ ； 4 5 7bpR 5' ATATACCTTCGCGATCATTGCCCAG3‘；1031bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为103 IbpF 5 ‘ T T C AG C T T C AG T C C G T T C T G G A C A 3 ‘ ； 103 IbpR 5' GGCAGACATCGTACCTGGTCAAAT3‘；819bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为8 1 9bpF 5 ‘ A T G G A T C T G C A A C T G G A T C G G A C C A 3 ‘ ；8 19bpR 5' CTACATGATTGACTCCGGGCTCATTG3‘。(4)与蛹虫草子实体形成有关的分子标记的PCR扩增扩增体系为25μ L，10 X LAPCR buffer II (Mg2+ Plus) 2· 5 μ L，dNTP (各 2. 5mM) 4uL,5U/y L TaKaRa LA Taq DNA酶0. 25 μ L，10 μ mol/L蛹虫草菌株检测专用引物对各 0.5yL，模板 DNA0.5yL (浓度 50ng/yL)，ddH20 16. 75 μ L ;PCR 反应条件95°C 5min ； 95°C 30second，55°C 30second, 72°C Imin 或 90second，30 个循环；72°C IOmin ；457bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是5-ATGGAACACAGATCGAGCGACACTGAGCATCAAGAGCTGCTTAGGCGGCTCTCAACCGTCTCTTCA CATACAATTCTCCGTCATCTGCAAGAGGAGACAATATTGCAGATCGCCGCAAAGTGCTTCGAAGACAAAGAAAAGG AGAACAATTCGACAAAATACTCCAAGCCTCAATCGACCCTTCATTTCACGGAGCCGCAACGAGCCTTGCCACAGA AGAGAAGCAACAGCAAGCAGGCCGGAGACCGCGCAAAACGACCATTGAATGCTTTCATCGCATTCAGAAGTGAGT GCAGAATATTAATTTCCCTCGAGAACAAATCTAACTCCAATGATTAAAAGGCTACTACGTGAAACTATTTCCAGA GTCGCAACAAAAGGCGGCGTCCGGCTTCCTCACGACACTCTGGAATAAAGACCCGTTCAGAAATCGCTGGGCAAT GATCGCGAAGGTATAT-3 ；1031bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是5-TTCAGCTTCAGTCCGTTCTGGGCCGAGGACGAGTGCATTGTAGATTCAGAATCTGCCATCGACTCAA TCCGATGCCATGCTTTACGAGTTTCTCTGGAAAAGAACAGGGGAAGGGAAGAGAAACTACCGTGCCTGCAGGGTACG CGGTCTCTGGTCGGTTTGATATTTTGTCGCTAACCAAGTGCACCTAGATGTACTAGAAGATGTCATCTACGCGATCG AGAGCCTACTATGGAACCCCCGAGACGACAACATTATAATAAACCGAATAGTTGCGCTCGGCGTAGAAGAGACGATCGACCCCGTCCTGCTGGTCAAAGAAGCGATCGCCCACTGGTACATTAGCGCAGTGCCAATCTCAACCCGAGATCCTCA CCATGGCTTGCCGCCGGACGCAGAGATAGAGCAGGAGGACGGCGCGACAATACTGAGATGGAATCGACAATATGCAG CTGAGAAACACGAAATAGCGAACCTCGGTCTCATAGCAATGCTCTTGACATCTGAGACATGGTCCCGTCCTGAAAGC CCAACTTTGCGGTTAGGGACATTAGTGGCAAACGCCGCCACTGCAATTTTATTCGGAGCTTTCATGATTATACCGAA AATTAGCATCAGAGAATCTTCAAATTTGCTGGTATCAGTCCTGAAAGATAACGAAGCGATGCGATTATATCTGAGAA CCACCTGGCAATTGGCTCAAGATGGCGCTTCAAAATACACACACTCGCCGTCCGCTGAGTTCGGAACAACTACATCT GAGGTTAAAATTGATCATGCTGGAAAGCGACTCTTGAATAAGGTTGGACAAGAGAACTGGCCTGTGGCGTCGCTTTG GCATTCTAGTCGAAAGACCCCCGGTTCTGCTTGGAATAAATTCATGAGGAATACACAGCAACCATATTTCCCCTGCA AGAAAATCAAAACTGAGATTCGATATCGACTTCCAAGCTCTTGTCTCTCTTTAGCCGAGCCTTGGGAGGTATATTAT TCTGAGCTGCGCTCCAAATTTGACCAGGTACGATGTCTGCC-3 ；819bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是5-ATGGATCTGCAACTGGATCGGACCAGACTCCAAGATCAGGAGCTTTGGGATGCCGTCAGCGTCGGCA TCAACCCATTTGTGAAAGTTCTCAGTATCGACGGTCTCATCTACCGTTCCTTGACTGTGAAAACAAAAAGATCTTTG GCTGAAAATTTCGTGTAAGGACACATCCATGGCGACATTTGGGCGGCGCGCTAACTTTGCCAAGCAAACACGTACAA GAACCAGTCATGTTTTGTCGCGATGGTTTTGGCCCAGACAGATACTTCCTTGGAAATCCACGACATTTGATGTCCGG CACTGGCATCATTCTAGCTGCCGCGGAAGTAGAGCCTATTTGGTTTGAACAACCAGGCTTGAAGTACCAAAAGGCGA CCATGTGTCAGTCGTCGCTTCCACGCAAACACATCAAGATCCCGAGGCCACCCAATGCGTATATTCTATACCGCAGA GACCGACATACGCTTGTCAAGAAAAGCGAGCCACATTTGTCGAACAATGAAGTTTGTAAGAGCAACTGTACGCCCCC TAAAGATAAAGTTACTGACCATTCATAGCGCAAGTGCTTGGTAAAGCTTGGAATGCAGAACCTCCAGAGGTGCGACA ACGCTACAAGGAAATGTCGGAGAGGATCAAGAAGGCTCTCCTCGAACGGCATCCCCAATATCAATATCAACCTCGCA AACCCTCTGAGCGGAAGCGACGCCGCAAGCGCACTCAGGATACCGAATCTCAAAGCAGTGAGACTACGTCGGCAACG CCAGACAGCACCATTATGACAGGAAGCGAGCTTTCAATGAGCCCGGAGTCAATCATGTAG-3 ；(5)琼脂糖凝胶电泳检测取上述PCR扩增产物6 μ L，与1 μ L加样缓冲液混勻，点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于0. 5Χ TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。
权利要求
1. 一种蛹虫草菌种的快速检测方法，包括下列步骤(1)菌株或子实体基因组DNA的提取将子实体及菌丝，放入_20°C冰箱冻存，用CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至50ng/ μ L，-20°C冰箱贮藏备用；(2)蛹虫草菌种或其子实体特异DNA片段的获得对应457bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为 2F 5' CCGTCATCTGCAAGAGGAGACAAT3‘；2R 5' GCTTCCAATACGTTCCATGAAC CCT3‘；对应1031bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为3F 5' TTCCTTCGCTTCCCTGAGTTCTGT3‘；3R 5' GGCAGACATCGTACC TGGTCAAAT3‘；对应819bp的DNA片段的PCR扩增引物对序列为IF 5' TCAACAATCCTCCATTTCCTCCAGC3‘；IR 5' CTACATGATTGACTCCGGGCTCATTG3‘；应用以上引物分别对蛹虫草菌种或其子实体DNA进行扩增；其扩增得到的DNA片段的序列分别是2F/2R引物对所扩增的DNA序列为5-CCGTCATCTGCAAGAGGAGACAATATTGCAGATCGCCGCAAAGTGCTTCGAAGACAAAGAAAAGGAGAAC AATTCGACAAAATACTCCAAGCCTCAATCGACCCTTCATTTCACGGAGCCGCAACGAGCCTTGCCACAGAAGAGAAG CAACAGCAAGCAGGCCGGAGACCGCGCAAAACGACCATTGAATGCTTTCATCGCATTCAGAAGTGAGTGCAGAATAT TAATTTCCCTCGAGAACAAATCTAACTCCAATGATTAAAAGGCTACTACGTGAAACTATTTCCAGAGTCGCAACAAA AGGCGGCGTCCGGCTTCCTCACGACACTCTGGAATAAAGACCCGTTCAGAAATCGCTGGGCAATGATCGCGAAGGTA TATACTTTCATTCGCGATGAGATGGGAAAGAAGAGGGCTCCCCTCTCCTCATTTCTGATGGCTGCTTGTCCGGCAAT GGACATTTTACCTCCTGATGAGTACCTTCAGGTTCTGGGCTGGGCAGTCGAAGATACCGAACAAGGTACCAAGATGC TTGTTCAGACGCTTGTCCAAATACAAGTCATGGTACAATATGCACATTATCTTCAAGGATCCATGATCCAACTCTAT TCGCCGACCTCACGATCGTCCGCCCAGCGCACCAATGACATGATCCGCCACCGCCAAGTCCTCGTCCGGAGCGCCTT GCCCCCcAAGTATAAGGGAATCCACATGATAATGACAGCCGCCGAGATGCCAGCCATGGCGCCATATGTATTTTGAT AGCCAGACTTGTTGATCCAAGGGTTTGTCTCGAAGGAAAGGAAAAATCCGAATAGTGCTGTACAGATCTGTGTTAGC GCAGGGTTCATGGAACGTATTGGAAGC-3 ；3F/3R引物对所扩增的DNA序列为5-TTCAGCTTCAGTCCGTTCTGGGCCGAGGACGAGTGCATTGTAGATTCAGAATCTGCCATCGACTCAATCC GATGCCATGCTTTACGAGTTTCTCTGGAAAAGAACAGGGGAAGGGAAGAGAAACTACCGTGCCTGCAGGGTACGCGG TCTCTGGTCGGTTTGATATTTTGTCGCTAACCAAGTGCACCTAGATGTACTAGAAGATGTCATCTACGCGATCGAGA GCCTACTATGGAACCCCCGAGACGACAACATTATAATAAACCGAATAGTTGCGCTCGGCGTAGAAGAGACGATCGAC CCCGTCCTGCTGGTCAAAGAAGCGATCGCCCACTGGTACATTAGCGCAGTGCCAATCTCAACCCGAGATCCTCACCA TGGCTTGCCGCCGGACGCAGAGATAGAGCAGGAGGACGGCGCGACAATACTGAGATGGAATCGACAATATGCAGCTG AGAAACACGAAATAGCGAACCTCGGTCTCATAGCAATGCTCTTGACATCTGAGACATGGTCCCGTCCTGAAAGCCCA ACTTTGCGGTTAGGGACATTAGTGGCAAACGCCGCCACTGCAATTTTATTCGGAGCTTTCATGATTATACCGAAAAT TAGCATCAGAGAATCTTCAAATTTGCTGGTATCAGTCCTGAAAGATAACGAAGCGATGCGATTATATCTGAGAACCACCTGGCAATTGGCTCAAGATGGCGCTTCAAAATACACACACTCGCCGTCCGCTGAGTTCGGAACAACTACATCTGAG GTTAAAATTGATCATGCTGGAAAGCGACTCTTGAATAAGGTTGGACAAGAGAACTGGCCTGTGGCGTCGCTTTGGCA TTCTAGTCGAAAGACCCCCGGTTCTGCTTGGAATAAATTCATGAGGAATACACAGCAACCATATTTCCCCTGCAAGA AAATCAAAACTGAGATTCGATATCGACTTCCAAGCTCTTGTCTCTCTTTAGCCGAGCCTTGGGAGGTATATTATTCT GAGCTGCGCTCCAAATTTGACCAGGTACGATGTCTGCC-3 ；·1F/1R引物对所扩增的DNA序列为5-ATGGATCTGCAACTGGATCGGACCAGACTCCAAGATCAGGAGCTTTGGGATGCCGTCAGCGTCGGCATCA ACCCATTTGTGAAAGTTCTCAGTATCGACGGTCTCATCTACCGTTCCTTGACTGTGAAAACAAAAAGATCTTTGGCT GAAAATTTCGTGTAAGGACACATCCATGGCGACATTTGGGCGGCGCGCTAACTTTGCCAAGCAAACACGTACAAGAA CCAGTCATGTTTTGTCGCGATGGTTTTGGCCCAGACAGATACTTCCTTGGAAATCCACGACATTTGATGTCCGGCAC TGGCATCATTCTAGCTGCCGCGGAAGTAGAGCCTATTTGGTTTGAACAACCAGGCTTGAAGTACCAAAAGGCGACCA TGTGTCAGTCGTCGCTTCCACGCAAACACATCAAGATCCCGAGGCCACCCAATGCGTATATTCTATACCGCAGAGAC CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGCGAGCCACATTTGTCGAACAATGAAGTTTGTAAGAGCAACTGTACGCCCCCTAA AGATAAAGTTACTGACCATTCATAGCGCAAGTGCTTGGTAAAGCTTGGAATGCAGAACCTCCAGAGGTGCGACAACG CTACAAGGAAATGTCGGAGAGGATCAAGAAGGCTCTCCTCGAACGGCATCCCCAATATCAATATCAACCTCGCAAAC CCTCTGAGCGGAAGCGACGCCGCAAGCGCACTCAGGATACCGAATCTCAAAGCAGTGAGACTACGTCGGCAACGCCA GACAGCACCATTATGACAGGAAGCGAGCTTTCAATGAGCCCGGAGTCAATCATGTAG-3 ；(3)特异PCR扩增引物的获得以上述扩增得到的三条DNA片段的序列为基础，分别设计457bp，1031bp及819bp的特异PCR扩增引物，引物对的序列如下·457bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为·4 5 7 b ρ F 5 ‘ ATGGAACACAGATCGAGCGACACT3 ‘ ； 4 5 7 b ρ R 5' ATATACCTTCGCGATCATTGCCCAG3‘；1031bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为·10 31bpF 5 ‘ TTCAGCTTCAGTCCGTTCTGGACA3 ‘ ； 103IbpR 5 ‘ GGCAGACATCGTACCTGGTCAAAT3‘；·819bp特异DNA片段的PCR扩增引物对序列为·8 1 9 b ρ F 5 ‘ ATGGATCTGCAACTGGATCGGACCA3 ‘ ； 8 1 9bpR 5 ‘ CTACATGATTGACTCCGGGCTCATTG3‘；(4)与蛹虫草子实体形成有关的分子标记的PCR扩增·457bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是5-ATGGAACACAGATCGAGCGACACTGAGCATCAAGAGCTGCTTAGGCGGCTCTCAACCGTCTCTTCACAT ACAATTCTCCGTCATCTGCAAGAGGAGACAATATTGCAGATCGCCGCAAAGTGCTTCGAAGACAAAGAAAAGGAGA ACAATTCGACAAAATACTCCAAGCCTCAATCGACCCTTCATTTCACGGAGCCGCAACGAGCCTTGCCACAGAAGAG AAGCAACAGCAAGCAGGCCGGAGACCGCGCAAAACGACCATTGAATGCTTTCATCGCATTCAGAAGTGAGTGCAGA ATATTAATTTCCCTCGAGAACAAATCTAACTCCAATGATTAAAAGGCTACTACGTGAAACTATTTCCAGAGTCGC AACAAAAGGCGGCGTCCGGCTTCCTCACGACACTCTGGAATAAAGACCCGTTCAGAAATCGCTGGGCAATGATCG CGAAGGTATAT-3 ；·1031bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是5-TTCAGCTTCAGTCCGTTCTGGGCCGAGGACGAGTGCATTGTAGATTCAGAATCTGCCATCGACTCAATCC GATGCCATGCTTTACGAGTTTCTCTGGAAAAGAACAGGGGAAGGGAAGAGAAACTACCGTGCCTGCAGGGTACGCGG TCTCTGGTCGGTTTGATATTTTGTCGCTAACCAAGTGCACCTAGATGTACTAGAAGATGTCATCTACGCGATCGAGA GCCTACTATGGAACCCCCGAGACGACAACATTATAATAAACCGAATAGTTGCGCTCGGCGTAGAAGAGACGATCGAC CCCGTCCTGCTGGTCAAAGAAGCGATCGCCCACTGGTACATTAGCGCAGTGCCAATCTCAACCCGAGATCCTCACCA TGGCTTGCCGCCGGACGCAGAGATAGAGCAGGAGGACGGCGCGACAATACTGAGATGGAATCGACAATATGCAGCTG AGAAACACGAAATAGCGAACCTCGGTCTCATAGCAATGCTCTTGACATCTGAGACATGGTCCCGTCCTGAAAGCCCA ACTTTGCGGTTAGGGACATTAGTGGCAAACGCCGCCACTGCAATTTTATTCGGAGCTTTCATGATTATACCGAAAAT TAGCATCAGAGAATCTTCAAATTTGCTGGTATCAGTCCTGAAAGATAACGAAGCGATGCGATTATATCTGAGAACCA CCTGGCAATTGGCTCAAGATGGCGCTTCAAAATACACACACTCGCCGTCCGCTGAGTTCGGAACAACTACATCTGAG GTTAAAATTGATCATGCTGGAAAGCGACTCTTGAATAAGGTTGGACAAGAGAACTGGCCTGTGGCGTCGCTTTGGCA TTCTAGTCGAAAGACCCCCGGTTCTGCTTGGAATAAATTCATGAGGAATACACAGCAACCATATTTCCCCTGCAAGA AAATCAAAACTGAGATTCGATATCGACTTCCAAGCTCTTGTCTCTCTTTAGCCGAGCCTTGGGAGGTATATTATTCT GAGCTGCGCTCCAAATTTGACCAGGTACGATGTCTGCC-3 ；819bpF/R引物对特异扩增DNA片段的序列是5-ATGGATCTGCAACTGGATCGGACCAGACTCCAAGATCAGGAGCTTTGGGATGCCGTCAGCGTCGGCATCA ACCCATTTGTGAAAGTTCTCAGTATCGACGGTCTCATCTACCGTTCCTTGACTGTGAAAACAAAAAGATCTTTGGCT GAAAATTTCGTGTAAGGACACATCCATGGCGACATTTGGGCGGCGCGCTAACTTTGCCAAGCAAACACGTACAAGAA CCAGTCATGTTTTGTCGCGATGGTTTTGGCCCAGACAGATACTTCCTTGGAAATCCACGACATTTGATGTCCGGCAC TGGCATCATTCTAGCTGCCGCGGAAGTAGAGCCTATTTGGTTTGAACAACCAGGCTTGAAGTACCAAAAGGCGACCA TGTGTCAGTCGTCGCTTCCACGCAAACACATCAAGATCCCGAGGCCACCCAATGCGTATATTCTATACCGCAGAGAC CGACATACGCTTGTCAAGAAAAGCGAGCCACATTTGTCGAACAATGAAGTTTGTAAGAGCAACTGTACGCCCCCTAA AGATAAAGTTACTGACCATTCATAGCGCAAGTGCTTGGTAAAGCTTGGAATGCAGAACCTCCAGAGGTGCGACAACG CTACAAGGAAATGTCGGAGAGGATCAAGAAGGCTCTCCTCGAACGGCATCCCCAATATCAATATCAACCTCGCAAAC CCTCTGAGCGGAAGCGACGCCGCAAGCGCACTCAGGATACCGAATCTCAAAGCAGTGAGACTACGTCGGCAACGCCA GACAGCACCATTATGACAGGAAGCGAGCTTTCAATGAGCCCGGAGTCAATCATGTAG-3 ；(5)琼脂糖凝胶电泳检测。
2.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种的快速检测方法，其特征在于所述步骤(4) 的扩增体系为25 μ L，10 X LAPCR buffer II (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, dNTP (各 2. 5mM) 4uL，5U/ μ L TaKaRa LA Taq DNA酶0. 25 μ L，10 μ mol/L蛹虫草菌株检测专用引物对各0. 5 μ L，模板 DNA 0. 5 μ L (浓度 50ng/μ L)，ddH20 16. 75 μ L ;PCR 反应条件95°C 5min ；95°C 30second, 55°C 30second，72°C Imin 或 90second，30 个循环；72°C IOmin0
3.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种的快速检测方法，其特征在于所述步骤(5) 中的电泳检测为取步骤G)PCR扩增产物6yL，与IyL加样缓冲液混勻，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于0. 5XTBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。
全文摘要
本发明涉及一种蛹虫草菌种的快速检测方法，包括下列步骤(1)菌株或子实体基因组DNA的提取；(2)蛹虫草菌种或其子实体特异DNA片段的获得；(3)特异PCR扩增引物的获得；(4)与蛹虫草子实体形成有关的分子标记的PCR扩增；(5)琼脂糖凝胶电泳检测。该检测方法具有检测时间短，准确性高，提高效率，减少损失等优点；在试管菌种生产阶段进行检测，可检测出50％不能正常出菇的菌株，从而可以在实际生产中减少50％不出子实体的损失。
文档编号C12R1/645GK102206698SQ20091019645
公开日2011年10月5日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者冯爱萍, 陈明杰, 魏静, 鲍大鹏 申请人:上海市农业科学院