一种利用蛹虫草菌种感染家蚕幼虫培育蚕虫草的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用蛹虫草菌种感染活体家蚕幼虫培育蚕虫草的方法。
【背景技术】
[0002]虫草是一类具有显著保健功能的药食两用真菌，其中最著名的是冬虫夏草，其相关产品涉及保健品、食品、中成药等几大类十几个品种，在全世界都享有盛誉。但冬虫夏草寄主专一，生活环境苛刻，人工培育很难完全成功，而且由于其天然寄主蝙蝠蛾生活周期长、天敌多、病害多，自然繁殖的幼虫产量严重不足，加之这些年来冬虫夏草产区环境污染严重，人为过早、过量地滋采滋挖以及草甸沙化，造成未成熟的虫草菌感染寄主的机会大量减少等原因，从而造成冬虫夏草产量和质量大幅度下降，货源稀缺，价格昂贵，远远不能满足市场日益增长的需求。
[0003]家蚕是一种可以大规模人工饲养的鳞翅目昆虫，其形态与冬虫夏草的虫体最为接近，以其作为寄主培育出的蚕虫草是野生冬虫夏草最佳的替代品。特别是中药讲究的是营养成分的全面性，即全草入药，蚕虫草在形态和有效成分上与冬虫夏草最为接近，利用蚕虫草替代冬虫夏草对家蚕资源的综合开发利用及青藏高原的生态环境保护都具有重要意义。
[0004]潘中华(2001)用5龄桑蚕幼虫培育蚕虫草，接种后在温度22°C、湿度95%以上培养，其僵化率为48%?80%，但菌种退化明显；温鲁(2004)和朱芬娣(2005)研究了蛹虫草菌感染4龄起蚕、5龄起蚕的桑蚕的感染情况，发现5龄2?4天的感染效果比较好，僵化率达到了 80%左右。中国发明专利申请201110381394.6公开了以家蚕幼虫为寄主的蛹虫草子实体及其培育方法，采用了注射液体稀释菌种后，把家蚕插入珍珠岩和蛭石的混合物里，然后在温度18?24°C、湿度为70%?90%条件下培养，但没有提及其家蚕的感染率。中国发明专利申请201110306713.7公开了一种利用桑蚕幼虫培育蛹虫草的方法，采用了 5龄熟蚕，低温麻醉后注射蛹虫草菌丝悬浮液，然后经过前期不断进行温差培养一段时间后，转入温度19?20°C、湿度85%?95%条件下培养3?5天后，给光培养。此方法操作比较复杂，技术难以控制。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种感染率及出草率高的蚕虫草人工培育方法，该方法具有操作简单、成本低、感染率及出草率高、稳定性好、易于规模化栽培等优点，具有广阔的发展前景。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
[0007]其包括如下步骤:1、一种蚕虫草的培育方法，其包括如下步骤:
[0008](1)家蚕的选择:选择五龄第3天到第5天的家蚕作为寄主；
[0009](2)蛹虫草菌种的制备:将复壮后的蛹虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2?3块接种到一瓶液体培养基中，23°C、130r/min震荡培养5d得发酵液，过无菌纱布得液体菌种；
[0010](3)营养土的制备:选取含水量5%?20%的土壤，121°C , 0.1Mpa灭菌30min ;
[0011](4)接种:将上述的家蚕放入超净工作台上紫外灭菌20?50min，然后用一次性的注射器吸取0.2?0.4ml的液体菌种注射到家蚕体内；
[0012](5)前期培养管理:将接种后的家蚕放入上述的营养土内，放置在5°C?12°C环境下避光培养5?12d ;
[0013](6)后期培养管理:将经步骤(5)中的培养的家蚕放在光照强度50?2001x，温度21°C?23°C，湿度86%?89%条件下培养35?60d，即得蚕虫草。
[0014]本发明的优点是:操作简单、成本低、技术容易推广、感染率及出草率高、稳定性好、易于规模化栽培。
[0015]更具体地，本发明涉及:
[0016]1.一种蚕虫草的培育方法，其包括如下步骤:⑴家蚕选择；(2)菌种制备；(3)营养土的准备；⑷蚕体表灭菌:(5)接种；(6)管理。
[0017]2.项1所述的一种蚕虫草的培育方法，其特征在于，步骤(2)，所述的菌种制备为:过滤，无菌纱布除去液体发酵液菌球。
[0018]3.项1所述的一种蚕虫草的培育方法，其特征在于，步骤(3)，所述营养土为:含水量5%?20%的土壤，尚温尚压灭囷。
[0019]4.项1所述的一种蚕虫草的培育方法，其特征在于，步骤(4)，家蚕体表灭菌方法为:紫外灭菌，灭菌时间20min?50min。
[0020]5.项1所述的一种蚕虫草的培育方法，其特征在于，步骤￠)，所述的管理是:将接种后的家蚕放入步骤(3)制备的营养土内，5?12°C环境避光培养5?12d ;然后转入光强50?2001x，温度21?23°C，湿度为86?89%条件下培养35?60d，即得蚕虫草。
【附图说明】
[0021]图1为本发明操作流程示意图。
[0022]图2为本发明培育的蚕虫草产品图。
【具体实施方式】
[0023]实施例1
[0024](1)家蚕的选择:选择五龄第3天的家蚕作为寄主；
[0025](2)蛹虫草菌种的制备:将复壮后的蛹虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2?3块接种到一瓶液体培养基中，于23°C、130r/min震荡培养5d得发酵液，过无菌纱布得液体菌种；
[0026](3)营养土的制备:配制含水量10%的土壤，121 °C，0.1Mpa灭菌30min ；
[0027](4)接种:将上述的家蚕放入超净工作台上紫外灭菌30min，然后用一次性的注射器吸取0.2ml的液体菌种注射到家蚕体内；
[0028](5)前期培养管理:将接种后的家蚕放入上述的营养土内，放置在9°C环境下避光培养10d ;
[0029](6)后期培养管理:将经步骤(5)中的培养的家蚕放在光照强度501x，温度21°C，湿度86%条件下培养45d;
[0030]培养结束后，其蚕体感染率90 %，出草率为89 %，子实体长3?6cm，经测定，所得蚕虫草子实体虫草素的含量为0.189%，多糖为0.839%，虫草酸为1.238% ;虫体虫草素的含量为0.077%，多糖为0.281%，虫草酸为0.227%。其中蚕虫草整体中虫草素含量为0.155%，多糖为0.495%，虫草酸为0.873%。
[0031]实施例2
[0032](1)家蚕的选择:选择五龄第5天的家蚕作为寄主；
[0033](2)蛹虫草菌种的制备:将复壮后的蛹虫草斜面菌种分割成黄豆大小，每2?3块接种到一瓶液体培养基中，于23°C、130r/min震荡培养5d得发酵液，过无菌纱布得液体菌种；
[0034](3)营养土的制备:配制含水量15%的土壤，121 °C，0.1Mpa灭菌30min ；
[0035](4)接种:将上述的家蚕放入超净工作台上紫外灭菌50min，然后用一次性的注射器吸取0.3ml的液体菌种注射到家蚕体内；
[0036](5)前期培养管理:将接种后的家蚕放入上述的营养土内，放置在7°C环境下避光培养12d ;
[0037](6)后期培养管理:将经步骤(5)中的培养的家蚕放在光照强度为1501x，温度23°C，湿度89%条件下培养60d ；
[0038]培养结束后，其蚕体感染率95 %，出草率为92 %，子实体长3?6cm，其中子实体中虫草素的含量为0.191%，多糖为0.911%，虫草酸为1.476%。其中虫体中虫草素的含量为0.062 %，多糖为0.237 %，虫草酸为0.309 %。其中蚕虫草整体中虫草素含量为0.169 %，多糖为0.523 %，虫草酸为0.987 %。
[0039]以上得到的蚕虫草经非临床研究机构湖南省实验动物中心和湖南省药物安全评价研究中心的研究专题“小鼠经口灌服蚕虫草粉急性毒性试验(HNSE2013 (3) 005ATSI) ”进行试验，结果显示:小鼠经口灌胃蚕虫草粉最大浓度0.48g/ml，最大体积40ml/kg，当日1次，小鼠自主活动如常，在给药后14天的观察期内未见明显毒性症状，未见动物死亡，观察期结束后麻醉处死所有动物，大体解剖后肉眼观察各脏器也未发现明显异常。
【主权项】
1.一种培育蚕虫草的方法，其包括如下步骤: (1)选择五龄第3-5天的家蚕作为寄主； (2)将复壮后的蛹虫草菌种接种到液体培养基中培养，得液体菌种； (3)配制含水量5-20%的营养土，灭菌； (4)将步骤(1)的家蚕灭菌，然后接种步骤(2)的液体菌种； (5)将接种后的家蚕在营养土内5-12°C避光培养5-12d; (6)将经步骤(5)培养的家蚕在光照强度50-2001x、温度21-23°C、湿度86-89%条件下培养35-60d。2.权利要求1的方法，其中营养土的含水量为10-20%。3.权利要求2的方法，其中营养土的含水量为10-15%。4.权利要求1-3之一的方法，其中步骤(5)的温度为7-12°C。5.权利要求4的方法，其中步骤(5)的温度为7-9°C。6.权利要求1-5之一的方法，其中步骤(5)的时间为10-12d。7.权利要求1-6之一的方法，其中步骤(6)的光照强度为50-1501x。8.权利要求1-7之一的方法，其中步骤(6)的光照时间为45-60d。
【专利摘要】一种蚕虫草的培育方法，其包括如下步骤：(1)家蚕的选择：选择五龄第3～5d的家蚕作为寄主；(2)菌种制备：将蛹虫草菌种接种于液体培养基中，震荡培养后，无菌纱布过滤除菌球后得液体菌种；(3)营养土的制备：配制含水量5％～20％的土壤，高温高压灭菌后作为营养土；(4)接种：将家蚕放入紫外下灭菌20～50min，然后注射0.2～0.4ml的液体菌种到家蚕体内；(5)培养管理：将接种后的家蚕放入营养土内，放置在5℃～12℃环境下避光培养5～12d，后转入光强为50～200lx，温度为21℃～23℃，湿度为86％～89％的条件下培养35～60d，即得蚕虫草。本发明具有操作简单、成本低、感染率及出草率高、稳定性好等优点，适合大规模生产，具有广阔的发展前景。
【IPC分类】A01G1/04
【公开号】CN105359825
【申请号】CN201510740832
【发明人】刘东波, 颜新培, 王蕾, 李坚, 赖锡湖
【申请人】刘东波
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2013年5月15日
【公告号】CN103262751A, CN103262751B