专利名称：一种家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量的测定方法。
背景技术：
糖尿病是一种内分泌代谢紊乱的常见多发慢性病，临床症状主表现为高血糖。随着社会经济条件的改善和饮食结构的改变，近年来糖尿病的患病率大幅度增长，已成为当今医学上一个严重的公共卫生问题，给国民经济发展造成了很大的影响。目前临床上用于治疗糖尿病的药剂主要有胰岛素类、磺酰脲类、双胍类及α -糖苷酶抑制剂类这几类，胰岛素类、磺酰脲类、双胍类药物会引起肝损伤、血糖过低、水肿等，副作用较大，α -糖苷酶抑制剂为当前开发的重点领域。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)是一种α-糖苷酶抑制剂，可竟争性地与α-糖苷酶结合，以阻害α-糖苷酶对二糖的水解，使二糖不能被水解成单糖进入血液内，而被直接送入大肠排泄，从而起到了有效降血糖的作用，是当前糖尿病治疗药物开发的一个崭新领域。国外学 者对DNJ进行了大量的研究，人工化学合成出了许多衍生物，其中N-羟乙基-1-DNJ被开发成了治疗糖尿病的新药一格列米醇(也叫格列本醇)，于1998年用于临床。但DNJ分子中具有多个(4个)手性中心，与其相关的立体异构体多达15种以上，人工化学合成的其衍生物在药理药效与毒副作用上与天然DNJ存在较大的差异，不能满足当今社会的高水平需求。家蚕是当今地球上室内饲养量最大的经济资源昆虫，不仅资源丰富，而且活性物质与营养成分充足，很适宜作为高效、安全生物反应器用于开发生产附价值高、发展前景广阔的活性药物。家蚕幼虫体具有高效合成与富集DNJ的特性，不仅DNJ含量高，而且降血糖效果显著，可用于糖尿病治疗药物和保健食品的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，是用
9-芴基氯甲酸甲酯(FMOC-Cl)标记DNJ，在配有荧光检测器的反相高效液相色谱检测，建立精确、稳定的家蚕幼虫体DNJ含量检测方法。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下:
1)家蚕幼虫于-50°c下真空干燥36h，于-15°c下超微粉碎10 15 min，过80 100目筛，得到家蚕幼虫粉；
2)取家蚕幼虫体粉，按重量体积比为1:70(Γ800比例，加入0.05 mol/L HC1，常温下涡流15 20 s并超声波处理20 30 min后，用21690 g离心20 min，收集上清液，沉淀物再按上述步骤提取一次，合并两次上清液，定容得供试液；
3)取10UL供试液，与10 μ L 0.4 mol/L、pH8.5的硼酸钾缓冲液混和，加入20 μ L5 mmol/L FM0C-C1液，混匀并在20°C水浴锅中反应20 25 min，加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl来终止反应； 4)反应液用950μ L质量百分比为0.1%醋酸液稀释，生成的DNJ-FMOC，并用孔径0.2μ m尼龙吸管式过滤器过滤，得测定液；
5)将10μ L测定液用进样器注入色谱柱为DIAMONSIC C18柱的Waters 600高效液相色谱仪，以体积比为1:1的乙腈-0.1%醋酸为流动相，按1.0 mL/min流速在常温下洗脱；
6)用激发光254nm、发射光322 nm的Waters 474荧光检测器检测洗脱曲线，根据DNJ-FMOC色谱峰面积按回归方程Y=0.0002X+ 2.9815计算出1-脱氧野尻霉素含量。本发明具有的有益效果是:
本发明建立的家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量测定方法，精密度、重现性与加样回收率高，稳定地好，可用于大数量家蚕幼虫制品中DNJ含量的检测，这对于推进家蚕幼虫体的药用开发，具有积极的社会效益和经济效益。
具体实施例方式实施例1:
取家蚕幼虫体粉，按1:700 (ff:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常温下涡流15 s并超声波处理30 min后,用21690 g离心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步骤提取一次，合并两次上清液，定容得供试液。取10 μ L供试液，与10 UL 0.4 mol/L硼酸钾缓冲液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FMOC-Cl液，迅速混匀并在20°C水浴锅中反应20 min,加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FM0C-C1来终止反应。反应液用950 μ L 0.1%(V/V)醋酸液稀释，以稳定生成的DNJ-FM0C，并用孔径0.2 μ m尼龙吸管式过滤器过滤，得测定液。将10 UL测定液用进样器注入色谱柱为DIAMONSIC C18柱(250 X 4.60 mm, ID)的Waters 600高效液相色谱仪，以乙腈-0.1%醋酸(1:1，V/V)为流动相，按1.0 mL/min流速在常温下洗脱。用Waters 474荧光检测器(激发光254 nm，发射光322 nm)检测洗脱曲线，DNJ与FMOC-CI络合成的DNJ-FMOC得到很好的分离，根据DNJ-FMOC色谱峰面积按标样的回归方程计算出DNJ含量为0.523%，精密度试验的RSD = 0.6%，稳定性试验的RSD =
1.59%，重现性试验的RSD = 6.78%，平均加样回收率为104.5% (RSD=4.64%)。试验6批次均得到相同的结果。实施例2:
取家蚕幼虫体粉，按1:800 (W:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常温下涡流20 s并超声波处理25 min后,用21690 g离心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步骤提取一次，合并两次上清液，定容得供试液。取10 μ L供试液，与10 UL 0.4 mol/L硼酸钾缓冲液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FM0C-C1液，迅速混匀并在20°C水浴锅中反应25 min,加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FM0C-C1来终止反应。反应液用950 μ L 0.1%(V/V)醋酸液稀释，以稳定生成的DNJ-FM0C，并用孔径0.2 μ m尼龙吸管式过滤器过滤，得测定液。将10 μ L测定液用进样器注入色谱柱为DIAMONSIC C18柱(250 X 4.60 mm，ID)的Waters 600高效液相色谱仪，以乙腈-0.1%醋酸(1: 1，V/V)为流动相，按1.0 mL/min流速在常温下洗脱。用Waters 474荧光检测器(激发光254 nm，发射光322 nm)检测洗脱曲线，DNJ与FMOC-CI络合成的DNJ-FMOC得到很好的分离，根据DNJ-FMOC色谱峰面积按标样的回归方程计算出DNJ含量为0.525%，精密度试验的RSD = 0.56%，稳定性试验的RSD =1.41%，重现性试验的RSD = 5.78%，平均加样回收率为101.2% (RSD=3.12%)。试验7批次均得到相同的结果。实施例3:
取家蚕幼虫体粉，按1:750 (ff:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常温下涡流18 s并超声波处理20 min后,用21690 g离心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步骤提取一次，合并两次上清液，定容得供试液。取10 μ L供试液，与10 UL 0.4 mol/L硼酸钾缓冲液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FMOC-Cl液，迅速混匀并在20°C水浴锅中反应23 min,加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl来终止反应。反应液用950 μ L 0.1%(V/V)醋酸液稀释，以稳定生成的DNJ-FM0C，并用孔径0.2 μ m尼龙吸管式过滤器过滤，得测定液。将10 4 1测定液用进样器注入色谱柱为0^^0吧1(:(:18柱(250\4.60臟，ID)的Waters 600高效液相色谱仪，以乙腈-0.1%醋酸(1: 1，V/V)为流动相，按1.0 mL/min流速在常温下洗脱。用Wat ers 474荧光检测器(激发光254 nm，发射光322 nm)检测洗脱曲线，DNJ与FMOC-CI络合成的DNJ-FMOC得到很好的分离，根据DNJ-FMOC色谱峰面积按标样的回归方程计算出DNJ含量为0.524%，精密度试验的RSD = 0.72%，稳定性试验的RSD =
1.33%，重现性试验的RSD = 4.58%，平均加样回收率为102.1% (RSD=2.21%)。试验7批次均得到相同的结果。
权利要求
1.一种家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，其特征在于: .1)家蚕幼虫于-50°c下真空干燥36h，于-15°c下超微粉碎10 15 min，过80 100目筛，得到家蚕幼虫粉； .2)取家蚕幼虫体粉，按重量体积比为1:70(Γ800比例，加入0.05 mo I/L HC1，常温下涡流15 20 s并超声波处理20 30 min后，用21690 g离心20 min，收集上清液，沉淀物再按上述步骤提取一次，合并两次上清液，定容得供试液； .3)取10UL供试液，与10 μ L 0.4 mol/L、pH8.5的硼酸钾缓冲液混和，加入20 μ L.5 mmol/L FM0C-C1液，混匀并在20°C水浴锅中反应20 25 min，加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl来终止反应； .4)反应液用950μ L质量百分比为0.1%醋酸液稀释，生成的DNJ-FM0C，并用孔径0.2μ m尼龙吸管式过滤器过滤，得测定液； .5)将10μ L测定液用进样器注入 色谱柱为DIAMONSIC C18柱的Waters 600高效液相色谱仪，以体积比为1:1的乙腈-0.1%醋酸为流动相，按1.0 mL/min流速在常温下洗脱； .6)用激发光254nm、发射光322 nm的Waters 474荧光检测器检测洗脱曲线，根据DNJ-FMOC色谱峰面积按回归方程 Y=0.0002X+ 2.9815计算出1-脱氧野尻霉素含量。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量的测定方法。以0.05mol/LHCl为溶剂，在室温下经涡流15~20s并超声波处理20~30min的步骤抽提2次，从家蚕幼虫体中有效提取出DNJ。用5mmol/L9-芴基氯甲酸甲酯(FMOC-Cl)在20℃下标记DNJ20~25min，形成具有荧光性的DNJ-FMOC络合物，用配有荧光检测器的反相高效液相色谱检测，根据峰面积计算出DNJ含量。本发明建立的家蚕幼虫体DNJ含量测定方法，精密度、重现性与加样回收率高，稳定地好，可用于大数量家蚕幼虫制品中DNJ含量的检测，对于推进家蚕幼虫体的药用开发具有积极的社会效益和经济效益。
文档编号G01N30/02GK103091421SQ20131001538
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者时连根, 张作法, 刘淑梅, 金卫明, 费建明, 李玉峰, 赵丽华, 施国方, 黄秀娣 申请人:浙江大学, 湖州市农业科学研究院