专利名称：利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽 CecropinB2 的方法。
背景技术：
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。随着生物科技不断发展，抗菌肽作为新型抗生素及新型药物，在农业、医药、食品等领域发挥着重要作用。至今为止，已从自然生物中分离得到上千种抗菌肽，其中ceCTopins类抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽，已发现有A、B、C、D、E五种结构，这类抗菌肽还具有耐酸，耐热，耐碱以及不易产生耐药性等特点， 在微生物，动植物方面有广泛应用。
近年来，Bac-to-Bac杆状病毒表达系统得到广泛应用，该系统根据F因子载体的原理，改变了传统的昆虫重组杆状病毒的构建方法，构建一种新杆状病毒穿梭载体Bacmid， 该系统具有以下优势(1)重组率有显著提高，几乎可达100% (2)通过蓝白斑筛选重组病毒有筛选优势，不会产生野生型和非重组型病毒污染的问题，也不再需要传统繁琐的空斑筛选分析来纯化重组病毒(3)大大地缩短了重组病毒构建所需要的时间，可以由原来的4-6 周或更长减少到仅7-10天。因此，该技术可以快速、同时产生多种重组病毒。这是一种最快速简捷地生产重组病毒的方法。
随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品和环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用认识日益加深，而抗菌肽具广谱抗菌作用，对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。可应用生物工程的技术方法生产抗病菌的转基因动植物产品，同时可以通过基因工程的技术方法大量的表达抗菌肽，使之成为新一代肽类抗菌药的来源，具有出广阔的应用前景。
利用家蚕杆状病毒作为表达载体时，应用最多的是将外源目的基因替代polh基因，利用Pph带动目的基因高效表达。产生的重组病毒由于没有多角体蛋白外壳的保护，只能通过皮下注射的方式接种家蚕，导致效率低下，因此可利用双启动子表达载体构建可同时表达polh基因和BmCecB2基因的表达载体，获得的重组病毒，可经口接种家蚕，在家蚕体中表达抗菌肽，此方法与人工皮下注射家蚕相比，其优点省时省力，提高了生产效率，有利于规模化生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽Cecr0pinB2的方法， 步骤包括
将如序列表所示BmCecB2基因及polh基因分别克隆到启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；将重组双启动子表达载体转化到DHlOBac感受态细胞中，提取质粒， 获得重组穿梭载体Bacmid ；Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞,获得重组病毒多角体；重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达， 获得具有抑菌活性的抗菌肽。
进一步地，上述双启动子表达载体为pFastBacDUAL。
进一步地，上述BmCecB2基因及polh基因分别插入双启动子表达载体 pFastBacDUAL的PplO和Pph的MCS的下游处构建重组双启动子表达载体。
进一步地,上述重组穿梭载体Bacmid是通过将mini_Tn7转座子从双启动子表达载体转位到穿梭载体Bacmid上mini_attTn7祀位点,得到Gen抗性,再通过通过涂布于含有Kan，Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白斑过夜振荡培养，碱裂解法提取获得的。
进一步地，上述在转染试剂脂质体介导是指重组Bacmid及脂质体，分别加入无血清的Bm细胞培养基，将两种溶液混匀，室温静置，另取生长良好的Bm细胞，加入无血清的 Bm细胞培养基及重组Bacmid/脂质体复合物，培养一段时间，吸掉上清,加入含有10%血清的Bm细胞培养基，继续培养，观察。
进一步地，上述定量的重组病毒多角体的浓度为2X107NPB/ml。
进一步地，上述重组病毒多角体的添食量为每头蚕7 μ I。
本发明的有益效果
利用双启动子表达载体，在家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中获得的重组病毒，可经口添食家蚕，使家蚕抗菌肽Cecropin B基因在家蚕体中表达，与人工注射家蚕相比，省时省力，提高了生产效率。由于杆状病毒宿主域仅限于家蚕，不会感染其他动物，因此，高效表达抗菌肽后，可以将蚕体磨粉后添加到饲料中，无需纯化，作为饲料添加剂，有望成为替代抗生素的产品之一，具有很好的市场应用前景。
图1为本发明利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽Cecr0pinB2 的方法的流程示意图2为重组双启动子pFastBac Dual表达载体的示意图3为BmCecB2基因及polh基因表达产物的Tricine-SDS-PAGE检测示意图；其中M为蛋白质分子标准，Γ2分别为正常家蚕第六天和第七天的血液，3 4分别为经口添食重组病毒的家蚕第六天和第七天的血液，5飞分别为经口舔食野生型杆状病毒的家蚕第六天和第七天的血液，箭头所指为目的条带；
图4为BmCecB2抑菌活性检测示意图2分别为添食重组病毒的家蚕第六天和第七天的血液,3为添食野生型病毒的家蚕血液，4为正常家蚕的血液，5表示Amp，6表示无菌水。
具体实施方式
下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的整体的方法流程如图1所示。
实施例1
(I)构建双启动子表达载体分别以合成好的PET-32a-BmCecB2和野生型病毒株基因组DNA为模板，合成BmCecB2基因及polh基因，分别插入到双启动子表达载体 pFastBacDUAL的PplO和Pph的MCS的下游,设计合成引物如下
CecB-F (5，-CATGCCATGGCGCCGGAACCGCGTTGGAAA-3，)
CecB-R(5’ ~CGGGGTACCTCATTATTTACCGATGGCTTTCG~3，)
Polh-F (5，~CGCGGATCCATGCCGAATTATTCATACA~3，)，
Polh-R(5’-CCCAAGCTTTTAATACGCCGGACCAGTGAACAG-3，)
插入的酶切位点为，BmCecB2(Nco Ι/Κρη I), polh (BamH I/Hind III)
(2)重组穿梭载体Bacmid :用上述双启动子表达载体转化DHlOBac感受态细胞， 将已构建好的重组双启动子表达载体转化到E. coli DHlOBac感受态细胞中，37°C振荡培养 4h,重组穿梭载体Bacmid是通过将mini_Tn7转座子从双启动子表达载体转位到穿梭载体 Bacmid上min1-attTn7祀位点而产生的，并且得到了 Gen抗性。通过涂布于含有Kan,Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上进行蓝白斑筛选。挑选白斑过夜振荡培养，碱裂解法提取重组穿梭载体Bacmid,用M13引物进行PCR验证。重组双启动子pFastBac Dual表达载体如图2所示。
注PCR反应体系(25 μ L 反应体系)10 X Taq Buffer 2. 5 μ I, dNTPs1. 5 μ 1，混合引物(M13F+M13R) I μ I, Taq polymerase 0. 2 μ I, ddH20 up to25 μ I,模板(rBacmid) I μ I。
PCR 扩增条件93°C预变性 3min，94°C变性 45s，55°C 复性 45s，72°C延伸 4min，进行35个循环。
(3)获得重组病毒
取重组穿梭载体Bacmid(7 10 μ g)及脂质体8 μ I,并分别加入无血清的Bm细胞培养基补充体积至100 μ 1，将两种溶液混匀，室温静置20min，另取生长良好的Bm细胞，用无血清的Bm细胞培养基洗2 3次，再加入800 μ I无血清的Bm细胞培养基及准备好的重组 Bacmid/脂质体复合物200 μ 1，28°C培养3 5h后，吸掉上清，加入2ml含有10%血清的Bm 细胞培养基，28°C继续培养60h后，在显微镜下观察Bm细胞是否有感染的症状，吸取细胞上清，获得重组病毒粒子，复感家蚕细胞，获得重组病毒。
(4)家蚕抗菌肽Cecropin B2在家蚕体中表达
将重组病毒液定量至2X 107NPB/ml并准备五龄第一天的家蚕幼虫，第一区经口添食重组病毒液，每头蚕添食7 μ 1，分别以相同浓度的野生型杆状病毒和饲水区作为对照。每天观察家蚕的感染情况，并分别在第6天，第7天后收集蚕血，纯化多角体，并从中抽提病毒 DNA，PCR 验证(引物为 CecB-F/CecB-R)。
实施例2
家蚕抗菌肽Tricine-SDS-PAGE 鉴定
样品处理取感染的家蚕血液,放入100°C煮 沸5min, IlOOOrpm离心5min,上清加 2X上样缓冲液(4%SDS，12%甘油，50mM Tris, 2%巯基乙醇，O. 01%溴酚蓝，6M Hcl调PH调到6. 8)，煮沸5分钟。
Tricine-SDS-PAGE :制备15%浓度的分离胶(尿素)，10%浓度的中间胶及4%的浓缩胶；样品处理后上样电泳，固定液(50%甲醇，10%醋酸)固定30min，考马斯亮蓝染色lOmin， 再用脱色液脱色。
Tricine-SDS-PAGE检测结果如图3所示，其中polh蛋白的分子量为29KD， BmCecB2分子量为4.9KD。分析结果说明多角体与家蚕抗菌肽cecropin B均得到了表达。
实施例3
家蚕抗菌肽Cecropin B抑菌活性检测
取家蚕血液，经超声破碎细胞后离心取上清，进行琼脂糖孔穴扩散实验。将大肠杆菌悬浮液(0D_=0. 3) 400 μ 1，与55°C的LB固体培养基IOOmL混匀后铺平板待其凝固后，用灭过菌的打孔器(直径5mm)打孔，孔中滴加200ul待测的表达上清，37°C培养16h，以同体积的灭菌水为阴性对照，Amp为阳性对照，第2天测量抑菌直径。根据抑菌圈的大小判定抗菌肽的活性。
活性检测结果如图4所示，结果表明家蚕 抗菌肽cecropin B基因在家蚕体内得到表达，有明显的抑菌活性，抑菌直径为10_，以Amp (100mg/ml)和无菌水作为阴性和阳性对照，通过加样正常家蚕的血液和添食野生型病毒的家蚕血液排除本底水平表达。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽Cecr0pinB2的方法，其特征在于，步骤包括将如序列表所示BmCecB2基因及polh基因分别克隆到启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；将重组双启动子表达载体转化到DHlOBac感受态细胞中，提取质粒，获得重组穿梭载体Bacmid ；Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞,获得重组病毒多角体；重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达，获得具有抑菌活性的抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述双启动子表达载体为pFastBacDUAL。
3.根据权利要求2所述的利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述BmCecB2基因及polh基因分别插入双启动子表达载体pFastBacDUAL的Pp 10和Pph的MCS的下游处构建重组双启动子表达载体。
4.根据权利要求1所述的利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述重组穿梭载体Bacmid是通过将mini_Tn7转座子从双启动子表达载体转位到穿梭载体Bacmid上mini_attTn7祀位点,得到Gen抗性,再通过通过涂布于含有Kan，Gen, Tet, IPTG，X-gal的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白斑过夜振荡培养，碱裂解法提取获得的。
5.根据权利要求1所述的利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法,其特征在于,所述在转染试剂脂质体介导是指重组Bacmid及脂质体,分别加入无血清的Bm细胞培养基，将两种溶液混匀，室温静置，另取生长良好的Bm细胞，加入无血清的Bm细胞培养基及重组Bacmid/脂质体复合物，培养一段时间，吸掉上清,加入含有10%血清的Bm细胞培养基，继续培养，观察。
6.根据权利要求1所述的利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述定量的重组病毒多角体的浓度为2X107NPB/ml。
7.根据权利要求1所述的利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法，其特征在于，所述重组病毒多角体的添食量为每头蚕7 μ I。
全文摘要
本发明公开了一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达家蚕抗菌肽CecropinB2的方法。步骤包括将BmCecB2基因及polh基因分别克隆到启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；将重组双启动子表达载体转化到DH10Bac感受态细胞中，提取质粒，获得重组穿梭载体Bacmid；Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞，获得重组病毒多角体；重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达，获得具有抑菌活性的抗菌肽本发明的有益效果在于经口添食家蚕，使家蚕抗菌肽Cecropin B基因在家蚕体中表达，与人工注射家蚕相比，省时省力，提高了生产效率。
文档编号C12N15/866GK102994551SQ201210504848
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者徐家萍, 李昕琦, 杜畅, 王文兵, 高娟, 王成林 申请人:安徽农业大学