多菌种微生态制剂的制备
【专利摘要】本发明多菌种微生态制剂的制备，公开了一种芽孢杆菌属、乳酸菌属、光合细菌以及酵母菌等益生菌复合培养的条件。本发明通过对培养基配方和培养条件的优化得到了复合培养的最佳条件。本发明克服了多菌种之间的拮抗作用，得到了共生以及互利共生的培养环境，培养出了稳定的微生态菌剂，在很大程度上节省时间以及降低了生产成本，提高了经济效益。
【专利说明】
多菌种微生态制剂的制备
技术领域
[0001] 本发明涉及一种多菌种微生态制剂的发酵工艺，特别是涉及菌种的挑选和具体发 酵的方法。
【背景技术】
[0002] 随着水产养殖业的迅速发展，工厂化高密度养殖的规模日益扩大，而排出的养殖 废水使养殖水域生态环境遭到严重的破坏，成为导致近岸水体富营养化、赤潮和大规模病 害频发的原因之一。而近年来人们对环境污染越来越重视，以及对食品安全的要求不断提 高，在这种背景下，通过使用微生态制剂来改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫力，以 减少疾病的发生。微生态制剂因绿色环保、无毒副作用、无残留污染、不产生抗性、作用范围 广等优点成为抗生素最有潜力的替代品。
[0003] 微生态制剂是一种含有大量有益菌的制剂，根据微生态学的原理制成，具有维持 宿主微生态平衡、调整宿主微生态失调和提高宿主健康水平的功能。在水产养殖中微生态 制剂能够改善宿主和周围环境的微生物菌群、提高饵料利用率、宿主免疫力、改善周围水质 环境、对宿主的生长和免疫都有很好的效果，因此，具有广阔的开发前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于为水产养殖业提供一种全方面、高效率的多菌种复合微生态制 剂，使水产养殖水域生态环境保持原样，提高水产养殖效益，达到绿色、环保的养殖模式。
[0005] 为实现上述目的，我们提供一种多菌种混合培养微生态制剂的方法，包括以下步 骤：
[0006] 步骤a)菌种活化:将置于斜面或石蜡管中保藏的芽孢杆菌(Bacillus)接种到LB肉 汤固体斜面培养基中，30 °C条件下培养24h。
[0007] b)将置于斜面或石錯管中保藏的光合细菌(Photosynthetic Bacteria, PSB)接种 到LB肉汤固体斜面培养基中，30 °C条件下培养48h。
[0008] c)将置于斜面或石蜡管中保藏的乳酸菌(Lactobacillus)接种到MRS固体斜面培 养基中，36°C条件下培养48h。
[0009] d)将置于斜面或石蜡管中保藏的酵母菌(Yeast)接种到Yro固体斜面培养基中，30 °C条件下培养24h。
[0010] 菌种活化用斜面培养基配方如下：
[0011 ] LB肉汤培养基:氯化钠10 · Og，胰蛋白胨10 · Og，酵母浸粉0 · 5g，蒸馏水I OOOmL，琼脂 15~20g，pH 7.0±0.1，30°C。
[0012] MRS培养基：蛋白胨10 . Og，牛肉膏10 . Og，酵母膏5 . Og，葡萄糖20 . Og，吐温80 1.0 mL，磷酸氢二钾2. Og，乙酸钠5. Og，柠檬酸三铵2. Og，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水 1000 mU琼脂 15~20g，pH 6.2~6.4,36°C。
[0013] YPD培养基：葡萄糖20g，蛋白胨IOg，酵母膏IOg，蒸馏水1000 mL，琼脂15~20g，自然 pH，30°C。
[0014] 步骤b)种子液的制备:种子液培养基配方是在活化用斜面培养基的基础上去掉琼 脂制备而成。将配好的培养基在121°C，0.1MPa条件下灭菌20min，冷却备用。分别挑取2环活 化好的菌种，洗至种子培养基中。芽孢杆菌、酵母菌的培养条件为30°C，180r/min，培养20h; 光合细菌的培养条件为30°C，光照，180r/min，培养48h;乳酸菌的培养条件为36°C，静置培 养，48h。
[0015] 步骤c)发酵液的制备：
[0016] 将步骤b)中得到的各菌种种子液混合，按照2-5%v/v接种量接种到发酵培养基 中，其中各菌种体积比为1:1:1:1;或将步骤b)中得到的各菌种种子液按照光合细菌、乳酸 菌、芽孢杆菌、酵母菌的顺序，分别按照2-3%接种量接种到发酵培养基中，菌与菌之间接种 时间分别相隔12h;将接好种的发酵培养基在25°C、180r/min条件下震荡培养48h;
[0017] 采用该配方发酵得到成品。
[0018] 本发明对微生态制剂制备过程中采用的菌种，进行了严格的筛选而确定的。本发 明中利用的菌种均为共生或互利共生的、活性强、菌量高的优质菌种。
[0019] 本发明对步骤c中所提到的发酵培养基如表1。
[0020] 表1.优化的发酵培养基配方
[0022] 发酵液培养基需在121°C，0.1MPa条件下灭菌20min。
[0023]芽孢杆菌：来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC20037-枯草芽孢 杆菌。
[0024] 光合细菌:来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CCREMSDMCC150016-球 形红细菌。
[0025]酵母菌:来自中国农业微生物菌种保藏管理中心中国微生物菌种保藏库，编号为 ACCC20165-酿酒酵母。
[0026]乳酸菌:来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC11016-植物乳杆菌。 [0027]本发明一种益生菌复合发酵的方法，能够同时满足各种菌种的生长需求，而且能 使有些菌种共生或者互利共生，使它们达到一个动态平衡，这不仅节省了时间，最重要的是 在很大程度上节约了生产成本。本发明复合益生菌选用菌种的多样性，使得一种产品能够 同时满足多方面的要求。
[0028]发明有益效果
[0029] 1.本发明灵活应用了生物工程技术，使得种属不同的多个菌种在同一环境下共 存，形成一种动态平衡，从而得到一种高效、稳定的微生态制剂。
[0030] 2.本发明所用到的有益菌，均经过严格分离筛选的，农业部公告第1126号所允许 使用的有益菌，在水产养殖、畜牧养殖中使用不仅不会对养殖动物产生任何不良影响，而且 对环境也不会造成污染的绿色环保菌种。
[0031] 3.本发明采用的发酵技术，使得所有菌种能同时在同一个培养环境中生长、繁殖， 比单一菌种发酵得到的微生态制剂要发挥更全面的作用，并且由于发酵速度明显提高，能 在很大程度上节约生产时间，发酵设备也比单一菌种发酵要简便，这样就大大地降低了生 产成本，提高了设备利用率，为工业化生产奠定了坚固的基础。
【附图说明】
[0032] 图1为接种量优化结果图；
[0033]图2为接种顺序优化结果图；
[0034]图3为发酵温度优化图。
【具体实施方式】
[0035]芽孢杆菌：来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC20037-枯草芽孢 杆菌。
[0036] 光合细菌:来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CCREMSDMCC150016-球 形红细菌。
[0037]酵母菌:来自中国农业微生物菌种保藏管理中心中国微生物菌种保藏库，编号为 ACCC20165-酿酒酵母。
[0038]乳酸菌:来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC11016-植物乳杆菌。 [0039] 一种多菌种混合培养微生态制剂的方法，包括以下步骤：
[0040]步骤a)菌种活化:将置于斜面或石蜡管中保藏的芽孢杆菌(Bacillus)接种到LB肉 汤固体斜面培养基中，30 °C条件下培养24h。
[0041 ] b)将置于斜面或石錯管中保藏的光合细菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)接种 到LB肉汤固体斜面培养基中，30 °C条件下培养48h。
[0042] c)将置于斜面或石蜡管中保藏的乳酸菌(Lactobacillus)接种到MRS固体斜面培 养基中，36°C条件下培养48h。
[0043] d)将置于斜面或石蜡管中保藏的酵母菌(Yeast)接种到YH)固体斜面培养基中，30 °C条件下培养24h。
[0044] 菌种活化用斜面培养基配方如下。
[0045] LB肉汤培养基:氯化钠10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉0.5g，蒸馏水I OOOmL，琼脂 15~20g，pH 7.0±0.1，30°C。
[0046] MRS培养基：蛋白胨10 . Og，牛肉膏10 . Og，酵母膏5 . Og，葡萄糖20 . Og，吐温80 1.0 mL，磷酸氢二钾2. Og，乙酸钠5. Og，柠檬酸三铵2. Og，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水 1000 mU琼脂 15~20g，pH 6.2~6.4,36°C。
[0047] YH)培养基:葡萄糖20g，蛋白胨IOg，酵母膏IOg，蒸馏水1000 mL，琼脂15~20g，自然 pH，30°C。
[0048] 实施例1
[0049] 为使四种菌生长在同一体系中时具有基本一致的生长速率，这几种菌混合前的种 子液的生长状态、混合时的接种量和接种比例是非常重要的。本发明首先将种子液活化至 菌种的对数生长期后期或稳定期前期，具体方法是（1)取保藏于斜面固体培养基中的芽孢 杆菌、光合细菌分别接种至LB肉汤培养基，30°C，180r/min条件下，分别震荡培养20h和48h; (2)取保藏于斜面固体培养基中的乳酸菌接种至MRS培养基，36°C，静置培养48h; (3)取保藏 于斜面固体培养基中的酵母菌接种至YPD培养基，30°C，180r/min条件下，震荡培养20h;然 后将培养好的种子液按照1%、2%、3%、5%、9%的量接种于发酵培养基中，其中种子液中4 种菌的比例为1: 1: 1:1; (4)将接好种的发酵液在25°C、180r/min条件下震荡培养48h，最后 采用稀释涂布平板法测定活菌数。结果测定为接种量在3%时，混合发酵出的菌液活菌数最 高。结果可见图1。
[0050] 上述用于混合发酵的培养基成分见表1所示。
[0051 ] 发酵液培养基需在121°C、0.1 MPa条件下，灭菌20min。
[0052] 实施例2
[0053]本发明使用的菌种，由于种属不同，所以菌种之间的生长速率相差明显。因此为使 四种菌生长在同一体系中时具有基本一致的生长速率，与实施例1的区别是接种顺序不同， 接种量为3%，分别为a)同时接菌;b)乳酸菌4光合细菌4芽孢杆菌4酵母菌;c)光合细菌 -乳酸菌-芽孢杆菌-酵母菌。（2)将四种菌的种子液活化至对数生长期后期或稳定期前 期，分别按照（1)中的顺序接种至上述表2的发酵培养基中，菌与菌之间接种时间分别相隔 1211。（3)将接好种的发酵液在25°C、180r/min条件下震荡培养48h，最后采用稀释涂布平板 法测定活菌数。结果可见图2。
[0054] 实施例3
[0055]温度是微生物生长的重要环境因素之一，而且本发明中使用的菌株对于温度的要 求也是截然不同。与实施例1的区别是发酵温度不同，（1)首先将各菌种种子液活化至菌种 的对数生长期后期或稳定期前期；（2)按照3%的接种量接种于优化好的发酵培养基中；（3) 分别在20°C、25°C、30°C、35°C，180r/min条件下震荡培养48h，最后采用稀释涂布平板法测 定活菌数。结果可见图3。
【主权项】
1. 一种益生菌复合发酵的方法，包括以下步骤： 步骤1)菌种活化： 将芽抱杆菌（Bacillus)、光合细菌（Photosynthetic Bacteria，PSB)、乳酸菌 (Lactobacillus)、酵母菌(Yeast)分别活化； 步骤2)种子液的制备： 将步骤1)中活化好的菌种培养， 芽孢杆菌培养后种子液中，0D600值为0.8~1.1; 光合细菌培养后种子液中，0D600值为0.8~1.1; 乳酸菌培养后种子液中，0D600值为0.8~1.1; 酵母菌培养后种子液中，0D600值为0.8~1.1; 步骤3)发酵液的制备： 将步骤2)中得到的各菌种种子液混合，按照2-5 %接种量接种到发酵培养基中，其中各 菌种体积比为1:1:1:1;或将步骤2)中得到的各菌种种子液按照光合细菌、乳酸菌、芽孢杆 菌、酵母菌的顺序，分别按照2-3%接种量接种到发酵培养基中，菌与菌之间接种时间分别 相隔12h;将接好种的发酵培养基在25°C、180r/min条件下震荡培养48h; 所述发酵培养基为： 葡萄糖 l〇g 可溶性淀粉 15g 蛋白胨 l〇g 酵母膏 2.5g 乙酸钠 CH3COONa 5g 柠檬酸三铵C6H507(NH 4)3 2g 结晶硫酸镁MgS04· 7H20 ().2g 磷酸氢二钾Κ2ΗΡ04·3Η20 0.15g 硫酸锰 MnS04 ().05g 吐温 80 O.lmL/L 蒸馏水 1000 niL pH 6.5 ~7.0。2. 根据权利要求1所述益生菌复合发酵的方法，其特征在于：所述发酵液培养基需在 121 °C，0· IMPa条件下灭菌20min。
【文档编号】C12R1/865GK105861387SQ201610355611
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】王际辉, 肖珊, 王晗, 崔美兰, 张天任
【申请人】大连工业大学