一种油田嗜热降解长链烃芽孢杆菌hnmc 11117及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种油田嗜热降解长链烃芽孢杆菌HNMC11117及其应用，该菌株保藏编号为CGMCC No.12204。HNMC 11117菌株为以河南中原油田油藏底层温度大于60℃充气井的采出液为分菌样品，经分离纯化、筛选复检，得到对链长C16～C30的烷烃有选择性降解作用的高效菌株。本发明的菌株可用于提高高温条件下的原油采收率及修复石油污染的土壤等领域。CGMCC No.1220420160311
【专利说明】
一种油田嗜热降解长链烃芽孢杆菌HNMC 11117及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及石油开采及石油污染的土壤生物处理技术领域，具体涉及在高温环境 下降解长链烃的菌株，菌株分离、筛选的方法，及其在提高原油采收率及修复石油污染的土 壤中的应用。
【背景技术】
[0002] 我国是一个能源消耗大国，石油供需矛盾十分突出，已经成为制约我国国民经济 发展的重要因素之一。目前，我国陆上大多数主力油田已进入中后期开发阶段，石油产量逐 年递减，平均采收率不足30 %，采用新的技术来提高石油产量和采收率是当务之急。油藏微 生物一般是在特殊的温度、压力、盐度、PH地质环境下，自然选择出的一类种群结构和代谢 方式相适应的微生物，主要通过其代谢过程和代谢产物作用于原油、岩油、水界面以提高原 油采收率。利用油藏环境中的微生物资源提高采收率技术，通过调控油藏中微生物和微生 物群落、充分发挥其有利于采油的功能，可以很好地提高原油采收率和产量，适合于我国多 数油藏，在我国具有巨大的发展潜力。
[0003] 随着各地油井开采深度的增加，大多数油井温度已达50°C以上，原油中胶质、沥青 质含量也越来越高，之前筛选和投入使用的采油微生物菌剂大多数是常温菌，对油田长链 烃(胶质、沥青质等）的降解不尽如人意，人们对井下油藏嗜热微生物种群研究较少，配伍效 应研究不够，而且不同油田环境存在差异较大的嗜热菌群，用原来的采油微生物菌剂远不 能满足深井采油的需要。
[0004] 同时，在石油开采的过程中，由于井喷事故、输油管和贮油罐的泄漏等原因，各种 石油制品不可避免的进入环境而造成污染。石油污染物进入土壤后，会破坏土壤结构，影响 土壤的通透性，影响植物生长，还可能污染地表水和地下水。
[0005] 基于以上因素，亟需优化、筛选、培养出群体效应好、可有效降解长链烃的耐热或 嗜热微生物用于降解原油中的胶质、沥青来提高原油采收率，或者用于修复被石油污染的 土壤。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对上述高温条件下降解石油存在的难题以及石油污染土壤的 问题，提供能高效降解石油的菌株。
[0007] 本发明的目的在于提供以下方面：
[0008] (1)-种油田嗜热降解长链烃芽孢杆菌HNMC 11117,该菌为苍白空气芽孢杆菌 (Aeribacillus pallidus)，芽孢杆菌属，已于2016年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物 研究所，邮政编码：1〇〇1〇1，保藏编号:CGMCC No. 12204。
[0009] (2)根据上述（1)所述的菌，可有效降解石油烃，优选长链烷烃，更优选链长C16~ C30的烷烃。
[0010] (3)根据上述(1)或(2)所述的菌的分离、筛选方法，包括以下步骤：
[0011] 1)分离纯化:直接取油田采出液，涂布于培养基平板上，恒温培养，待菌落生长稳 定，接入培养基上，继续恒温培养，采用划线法，多次挑取单菌落纯化，直至获得菌落形态一 致的纯菌株；
[0012] 2)筛选:活化菌体细胞，将菌体细胞接入液体摇瓶筛选基础培养基中，恒温培养， 选取使原油分散明显、培养基浊度增加显著的菌株；
[0013] 3)重复上述分离纯化、筛选实验，直至筛选到原油降解效果好的菌株。
[0014] (4)根据上述(3)所述的方法，其中，所述步骤1)中菌的培养温度为45-65Γ，优选 50-60°C ;所述步骤2)中菌的培养温度为45-65°C，优选50-60°C。
[0015] (5)根据上述(3)所述的方法，其中，步骤1)中H培养基包括以下重量配比的组分： 酵母膏 8-12份， 乳酸 0.5-2份，
[0016] NaCl 8-1.2份，' H2O 1000 份，
[0017] 调节其 pH 为 7.0-7.5。
[0018] (6)根据上述(3)所述的方法，其中，步骤2)中的液体摇瓶筛选基础培养基包括以 下重量配比的组分： NaCl 4-6份， K3PO4 0.8-1.2份， NHvHaPOi 0.8-1,2份，
[0019] (NH4)2SO1 0.8-1.2 份， MgSOt 7H2O 0,1_0..3份， KNOs 2-4份， HjO 1000 份，
[0020] 调节 pH至 7.5-8.5。
[0021] (7)根据上述(3)所述的方法，其中，步骤2)中的液体摇瓶筛选基础培养基中加入 原油，其添加量为培养基总重量的〇. 5wt %-2. Owt %。
[0022] (8)根据上述(1)或(2)所述的菌用于降解长链烷烃的用途。
[0023] (9)根据上述(8)所述的菌的用途，其中，菌的降解条件如下：
[0024]温度45-65°(：，优选50-60°(：，更优选55°(：;和/或
[0025] pH6 · 0-8 · 5，优选 pH6 · 5-7 · 5，更优选 pH7 · 0;和/或
[0026] NaCl 浓度0.1%-2.0%，优选0.5%_1.5%，更优选1.0%。
[0027]根据本发明提供的一种油田嗜热降解长链烃芽孢杆菌HNMC 11117,具有以下有益 效果：
[0028] I、耐热性:本发明成功地从油田高温采出液中分离、筛选出在高温条件下生长良 好的苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus)，可有效提高高温条件下长链烃降解率；
[0029] 2、群体效应:本发明中菌株在高温高压油藏环境中，和环境中自然存在的菌株产 生配伍，协同作用原油，提高了原油中长链烃降解效率；
[0030] 3、对长链烷烃的选择性降解：能够利用石油烃和多种烷烃为唯一碳源和能源生 长，可选择性的降解长链烷烃；
[0031] 4、高降解能力:在高温条件下，相比于已有的采油微生物菌，无论是常温菌还是耐 热菌，本发明菌株具有更好的长链烷烃降解能力。
【附图说明】
[0032] 图1为HNMC 11117菌株显微镜观察(40X100)下的菌体形态；
[0033]图2为AlkB基因的烃类降解途径；
[0034] 图3为HNMC 11117菌株基于16SrDNA相似性构建的系统进化树；
[0035] 图4为原油空白对照气相全烃色谱图；
[0036] 图5为HNMC 11117菌株以原油为唯一碳源气相全烃色谱图；
[0037]图6为HNMC 11117菌株以原油和1 %酵母粉为碳源气相全烃色谱图。
【具体实施方式】
[0038] 下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更 为清楚、明确。
[0039] 在这里专用的词"示例性"意为"用作例子、实施例或说明性"。这里作为"示例性" 所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各 种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。
[0040] 本发明提供了一种油田嗜热降解长链烃芽孢杆菌HNMC 11117菌株。所述菌株为苍 白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus)，芽孢杆菌属，保藏编号为CGMCC No. 12204。 HNMC 111 17菌株的菌体形态如图1所示，芽孢椭圆到柱状，大小为(0·6μπι~0·9μπι) X (1 ·Ομπι ~1.5μπι)，菌落表面粗糙不透明，乳白色类圆状，直径为2mm~4mm。本发明中，HNMC 111 17菌 株可降解石油烃，优选长链烷烃，更优选链长C16~C3q的烷烃。
[0041] HNMC 11117菌株来源于河南中原油田油藏底层温度大于60°C充气井的采出液，菌 株经分离纯化，筛选复检，从多株优选菌株中筛选出一株能有效利用石油烃生长，对长链烷 烃有选择性降解能力的高效菌株。
[0042]本发明中，所述油田嗜热降解长链烃芽孢杆菌HNMC 11117的分离、筛选方法，包括 以下步骤：
[0043] 1)分离纯化:取油田采出液，在培养基平板上培养，多次挑取单菌落纯化，直至获 得纯菌株；
[0044] 2)筛选:纯化菌体细胞，将菌体细胞接入液体摇瓶筛选基础培养基中培养，选取降 解率高的菌株。
[0045] 在一种优选的实施方式中，HNMC 11117菌株的分离、筛选方法为：
[0046] 1)菌株的分离纯化:直接取油田高温采出液，均以200yL涂布于H培养基平板上，于 45-65Γ恒温培养，观察菌落生长情况。待菌落生长稳定，从每个样品的分离平板中，挑选单 菌落生长较清晰的平板，尽可能挑去平板上所有单菌落，全部转接入H培养基上，45-65Γ恒 温培养。采用平板3区划线法，多次挑取单菌落纯化，直至获得菌落形态一致的纯菌株。 [0047] 2)原油降解菌的多项筛选试验:应用H培养基活化纯培养细胞，45-65 °C恒温培养1 天，离心收集新鲜的菌体细胞，无菌水清洗3次以除去残留碳源。按1 %接种量，将菌体细胞 转接入以原油为唯一碳源的液体摇瓶筛选基础培养基中，以不接菌的液体摇瓶筛选基础培 养基做空白对照，120r/min、45-65°C恒温培养21天，观察摇瓶中原油在水溶液中的分散状 况、培养基浊度变化等表观现象，并记录试验结果。选取原油分散较明显、培养基浊度增加 显著的菌株。
[0048] 其中，所述H培养基，包括8-12重量份酵母膏、0.5-2重量份乳酸、8-12重量份NaCl 和 1000 重量份H2O,调节 pH至 7 · 0-7 · 5，121°C 灭菌 25min。
[0049] 所述液体摇瓶筛选基础培养基，包括4-6重量份NaCl、0.8-1.2重量份K3P〇4、0.8-1 ·2重量份ΝΗ4Η2Ρ〇4、0·8-1 ·2重量份(NH4)2S〇4、0· 1-0·3重量份MgS〇4 · 7Η20、2-4重量份ΚΝ〇3、 以及1000重量份H2O，调节pH至7.5-8.5;所述摇瓶筛选培养基中还加入原油，添加量为培养 基总重量的〇.5%-2.0%，加入原油后，121°(：灭菌3〇11^11，灭菌3次。
[0050] 在进一步优选的实施方式中，重复上述分离纯化、筛选试验，直至筛选到效果稳定 的菌株。对该功能菌株做进一步经降解特性分析，同时进行菌种多项分类鉴定。
[0051] 本发明中主要通过基因筛选和摇瓶筛选两种方法对石油烃进行降解功能特性的 研究，通过对其实验结果的判定筛选出高效的石油烃降解菌株，并确定其降解效率。
[0052] 在基因筛选实验中，主要研究途径是通过对纯化得到的菌株基因组DNA中石油烃 降解功能基因 AlkB的筛选，判断其是否含有石油烃降解基因片段。首先利用AlkB功能基因 的引物对样品基因组DNA进行扩增，阳性扩增序列的表达呈现，说明此菌株具有潜在的含有 石油烃降解的基因片段，再通过分子克隆技术，测出该系列的全部系列长度，与GenBank数 据库中信息进行比对，从而确定该菌株对石油烃降解的潜力。AlkB基因为烃类降解的单加 氧酶基因，主要是合成烃类降解的单加氧酶，是目前所有研究发现的烃类降解途径中最主 要的、必须经过的途径，具体降解途径如图2所示。
[0053]在摇瓶筛选实验中，主要研究途径是将纯化得到的菌种活化后加到以原油为唯 一碳源的无机盐培养基中，在55°C条件下培养21天后，摇瓶培养120r/min，通过观察原油分 散于培养基水相、并使培养基逐渐浑浊的表观现象的初步判断其降解功能。收集微生物降 解原油的反应液，采用三氯甲烷进行萃取，气相色谱一质谱(GC-MS)联用技术进行全烃组分 的测定，确定原油组分中正构烷烃的浓度变化。具体方法如下：
[0054]在IOOmL培养液中加入ImL盐酸水（I: 1)酸化，使pH降至2.0以下;将全部水样倒入 分液漏斗中，部分原油黏附在三角瓶的瓶壁上，用三氯甲烷将该部分原油从瓶壁上洗脱后 倒入分液漏斗中，每IOOmL水样加入20mL三氯甲烷，充分振荡，倒入250mL分液漏斗中，240r/ min振荡5min，静置。待分层完全后，先将水样放出，然后放出下层油样至50mL离心管中；重 复三氯甲烷萃取步骤两次;将萃取液于SOOOrpm离心10min，吸去上层水相，将油相转移至已 知重量的IOOmL三角瓶中；放于通风橱内蒸干溶剂，残油称重，常温保存在三角瓶中；萃取回 收后，用气相色谱分析其与对照样品组分的全烃成分变化情况，通过对其全烃组分含量的 测定判断其降解效率。从而优选出最佳降解菌株。
[0055] 筛选出的菌株基因测序结果与GenBank中的已有序列进行Blast比对，采用MEGA软 件绘制系统进化树以确定菌株的种属关系，如图3所示，其中括号内的编号为菌株的 GenBank登录号。顯MC 11117基因序列与苍白空气芽抱杆菌(Aeribacillus pallidus) DSM3670T(GenBank登录号为Z26930)的16SrDNA基因同源性最高，相似性为100%，结合菌种 形态以及多项分类鉴定试验结果，确定H N M C I I I 1 7菌株为苍白空气芽孢杆菌 (Aeribacillus pallidus)。
[0056] 在更进一步优选的实施方式中，由于原油中可能存在耐高温菌，在摇瓶培养基制 备的灭菌过程中，重复灭菌3次。尽管如此，为确认摇瓶筛选培养效果是转接的目标菌株作 用的结果，重新分离纯化培养21天后的摇瓶筛选基础培养液中的菌株，即取培养21天后摇 瓶培养液20此，涂布于H培养基平板，45-65 °C培养24h，挑取多个单菌落纯化，分别提取各纯 培养物细胞的基因组DNA，PCR扩增、测序，比对16 SrDNA。所述PCR反应体系(2 5yL)包括:0.5μ 1正向引物组（2(^]\〇,0.541^反向引物组（2(^]\〇,2.541^10\?〇1?缓冲液，1.541^]\^(：12 (25mM)，0·5yL dNTP( IOmM)，0· 5yL TaqDNA聚合酶（2· 5U/yL)，DNA模板lyL，H2O补充至25yL。 PCR扩增反应程序为:盖温:98 °C，IOmin;预变性:95 °C，IOmin;变性:94 °C，Imin;退火:55 °C， 40s;延伸：72°C，lmin;72°C，5min;降温至4°C ;其中2-4步运行30个循环。经凝胶电泳分析 后，进行测序，16SrDNA(片段)测序结果一致，如SEQ ID N0.1所示。
[0057] 试验例
[0058]实验中所用各培养基配制分别为：
[0059] H培养基由IOg酵母膏、Ig乳酸、IOgNaCl和1000 gH2O配置而成，调节pH至7.0。
[0060]液体摇瓶筛选基础培养基由 5gNaCl、lgK3P〇4、lgNH4H2P〇4、lg(NH4)2S〇4、 0.2gMgS〇4 · 7H20、3gKN03、以及1000 gH2O配置而成，调节pH至8.0。
[0061]无机盐培养基由58似(：1、181(2册〇4、18顺4112?〇4、18(順4)23〇4、0.28]\^5〇4.7!12〇、 3g KNO3和1000 gH2O配制而成，调节pH至7.0。
[0062] 含1 %酵母膏的无机盐培养基由无机盐培养基添加 lwt%酵母膏配制而成，调节pH 至 7·0〇
[0063] 上述各培养基加入原油后，需121°C灭菌30min，灭菌3次。
[0064] 实验中所用各培养基中组分来源分别为：
[0065] 原油，来源于河南中原油田油藏底层温度大于60°C充气井的采出液;酵母膏，购自 北京奥博星生物技术有限公司；乳酸，分析纯，购自北联精细化学品有限公司；NaCl，分析 纯;K 3P〇4，分析纯;NH4H2P〇4，分析纯；（NH4) 2S〇4，分析纯;MgS〇4 · 7H20，分析纯;KNO3，分析纯； K2HPO4，分析纯;H2O，一级水。
[0066] 试验例1温度对HNMC 11117生长的影响
[0067]温度梯度实验采用无机盐培养基，菌株转接量为1 %，每个梯度3个平行，恒温培养 24h后测得其0D630值。结果如表1所示，可见菌株在55°C生长最佳。本菌株投入高温高压油 藏环境，和环境中自然菌株产生配伍，可通过信号分子协同作用原油。
[0068] 表1温度梯度菌液OD值
[0070] 试验例2pH对HNMC 111 17生长的影响
[0071] 以无机盐培养基为基础，灭菌后，采用无菌的NaOH溶液和HCl溶液调整培养基pH为 不同的梯度，并分装入无菌试管中（3mL/支）。转接量1%，每个梯度3个平行，恒温55°C培养， 24h后测得其OD 63q值。结果如表2所示，可见菌株在pH为7时生长最佳。
[0072] 表2pH梯度菌液OD值
[0074] 试验例3NaCl浓度对HNMC 11117生长的影响
[0075]以不含NaCl的无机盐培养基为基础，添加不同浓度的NaCl，配制成NaCl%(w/v)梯 度培养基，pH7.0，灭菌备用。转接活化好的菌液1 %接种量于NaCl %梯度培养液中，每个梯 度3个平行，恒温55°C培养，24h后测得其OD63q值。结果如表3所示，可见菌株在1 %的NaCl含 量时生长最佳。
[0076] 表3盐度梯度菌液OD值
[0078] 实施例
[0079] 实施例1HNMC 11117菌株的分离、筛选
[0080]本发明中油田嗜热降解长链烃芽孢杆菌HNMC 11117的分离、筛选方法，包括以下 步骤：
[0081 ] 1)分离纯化:直接取油田高温采出液，均以200yL涂布平板，涂布与于H培养基平板 上，置于55°C恒温培养，观察菌落生长情况。待菌落生长稳定，从每个样品的分离平板中，挑 选单菌落生长较清晰的平板，尽可能挑去平板上所有单菌落，全部转接入H培养基上，55°C 恒温培养。采用平板3区划线法，多次挑取单菌落纯化，直至获得菌落形态一致的纯菌株。 [0082] 2)多项筛选试验:应用H培养基活化纯培养细胞，55 °C恒温培养1天，离心收集新鲜 的菌体细胞，无菌水清洗3次以除去残留碳源。按1 %接种量，将菌体细胞转接入液体摇瓶筛 选基础培养基中，以不接菌的液体摇瓶筛选基础培养基做空白对照，120r/min、55 °C恒温 培养21天，观察摇瓶中原油在水溶液中的分散状况、培养基浊度变化等表观现象，并记录试 验结果。选取原油分散较明显、培养基浊度增加显著的菌株，重复上述筛选试验，直至筛选 到效果稳定的菌株，即为苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus)HNMC 11117。
[0083] 实施例2HNMC 111 17菌株的原油降解性能
[0084] 分别采用H培养基、无机盐培养基和含1%酵母膏的无机盐培养基，均添加 lwt%原 油，以不同的温度、盐度和pH值的条件，120r/min，恒温培养21天，从菌株对原油分散的表观 现象和培养液的浑浊程度，分析菌株对原油降解的最佳作用条件。即部分摇瓶中的培养液 呈现浑浊状态，原油无挂壁现象，能够完全分散于液体培养基中。
[0085] 综合其培养条件和理化因素可以看出，菌株HNMC 11117在pH7.0、55°C、1.0%NaCl 含量条件下，以无机盐培养基和含1%酵母膏的无机盐培养基为降解培养基，对原油降解的 表观现象最为显著。结果如表4所示，其中，表示无明显分散，"+"表示明显分散，"++"表 示显著分散。
[0086] 表4在不同的温度、盐度和pH值下的原油降解性能
[0088] 石油烃降解率和选择性的测定方法采用气相色谱法。气相色谱法由于原油组分测 定条件的限制，将在摇瓶实验中选择样品进行原油组分的测定，主要为原油中全烃含量的 变化。以不接入菌种的样品做对照，采用GC-MS联用技术进行全烃组分的测定，确定原油组 分中正构烷烃的浓度变化。
[0089]全烃色谱测定采用执行标准：SY/T 5779-2008《原油全烃气相色谱分析方法》。气 相色谱仪为\^1^113700(細61'；[0311)，色谱柱为弹性石英毛细柱，长30111，内径0.221]11]1。设置气 相色谱仪和色谱数据处理机的分析条件:载气:99.999 %氮气;进样口 ： 300 °C ;检测器FID: 300 °C ;色谱柱:HP-I弹性石英毛细柱(60m X 0 · 25mm X 0 · 25μπι);柱温:初温40°C保持IOmin，4 °C/min升温至70°C，8°C/min升温至300°C，保持30min;载气流速:恒流lmL/min;分流60:1。 [0090]通过摇瓶筛选后，对石油烃的降解作用采用GC-MS测得石油全烃组分的变化图谱。 如图4、图5和图6所示，通过测定全烃相关成分、相对含量和数据分析发现，原油处理前后C 16 和C17显著增加，C3q有所减少，尽管C3q在处理前后的比值并不明显低于其他的烃类，但由于 长链烃分子量大的原因，因而认为该比值表明C 3q较显著地减少;又由于C3q减少的同时C16和 Cn增加，认为C16和C17应是C3q降解的部分产物。HNMC 11117菌对石油烃，特别是链长C16~C30 的长链烃有较好的降解能力。
[0091 ]实施例3与常温菌株原油降解性能比较
[0092] 本发明中，以小于C16的液态烃类为唯一碳源，采用液体摇瓶筛选基础培养基，通过 接入相同的菌体量，经过一段时间的培养后，通过OD值测定其菌体最终的生长量，以比对常 温菌株SHY-33和菌株HNMC 11117的生长差异，进而确定原油降解性能的差异。液态烷烃为 正己烷，正辛烷，正癸烷，十二烷，十四烷，十六烷。
[0093] 将菌株在最适温度下，活化培养12h。实验前先将液态烷烃用0.22μπι滤膜过滤之 后，以2%的量加入到经过高温灭菌后的50mL液体摇瓶筛选基础培养基中，然后将目标菌株 活化后的菌体细胞收集后用无菌水清洗三次，以除去菌体细胞中残留的碳源，以10%的接 种量接入液体摇瓶基础培养基中培养。装有烷烃培养基的三角瓶用橡皮塞封口，以防止高 温和光照的条件下，液态烷烃的挥发。接种完毕的摇瓶，常温菌株SHY-33在30 °C，菌株HNMC 11117在55 °C，150r/min条件下，摇床培养7d后，以相应不加任何烷烃的接菌液体摇瓶筛选 基础培养基做空白对照，取样测定各样品的OD 63q值，结果如表5所示。菌株HNMC 11117能高 效利用C6-C16直链烷烃进行生长，而代表菌株SHY-33利用率较低。OD63Q值测定是以空白样品 为"0"进行计算的。
[0094] 表5HNMC 11117与常温菌株原油降解性能比较
[0096] 实施例4与耐热菌株原油降解性能比较
[0097] 本发明中，以小于C16的液态烃类为唯一碳源，采用液体摇瓶筛选基础培养基，通过 接入相同的菌体量，经过一段时间的培养后，通过OD值测定其菌体最终的生长量，以比对耐 热菌株P388-53和菌株HNMC 11117的生长差异，进而确定原油降解性能的差异。液态烷烃为 正己烷，正辛烷，正癸烷，十二烷，十四烷，十六烷。
[0098]将代表菌株在最适温度下，活化培养12h。实验前先将液态烷烃用0.22μπι滤膜过 滤之后，以2%的量加入到经过高温灭菌后的50mL液体摇瓶筛选基础培养基中，然后将目标 菌株活化后的菌体细胞收集后用无菌水清洗三次，以除去菌体细胞中残留的碳源，以10% 的接种量接入液体摇瓶基础培养基中培养。装有烷烃培养基的三角瓶用橡皮塞封口，以防 止高温和光照的条件下，液态烷烃的挥发。接种完毕的摇瓶在55°C，150r/min条件下，摇床 培养7d后，以相应不加任何烷烃的接菌液体摇瓶筛选基础培养基做空白对照，取样测定各 样品的OD 63q值，结果如表6所示。菌株HNMC 11117能高效利用C6-C16直链烷烃进行生长，而代 表菌株P388-53利用率较低。OD 63q值测定是以空白样品为"0"进行计算的。
[0099] 表6HNMC 11117与耐热菌株原油降解性能比较
[0101] 由上述实施例可知，分离出的具有烷烃降解功能的嗜热苍白空气芽孢杆菌HNMC 11117,在最适降解原油条件为55°(：，？!17.0，似(：1浓度1.0%下，比已有的采油微生物菌，无 论是常温菌还是耐热菌，对原油和石油污染中的长链烃类具有更好的选择性降解能力。
[0102] 以上结合【具体实施方式】和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并 不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明 的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。
【主权项】
1. !1匪(：11117菌，保藏编号为〇61〇：叱.12204。2. 根据权利要求1所述的菌，其特征在于，所述菌为苍白空气芽孢杆菌，芽孢杆菌属。3. 根据权利要求1或2所述的菌，其特征在于，所述菌可降解石油烃，优选长链烷烃，更 优选链长Cl6~C3Q的烷烃。4. 根据权利要求1至3之一所述菌的分离、筛选方法，包括以下步骤： (1) 分离纯化:取油田采出液，在培养基平板上培养，多次挑取单菌落纯化，直至获得纯 菌株； (2) 筛选:纯化菌体细胞，将菌体细胞接入液体摇瓶筛选基础培养基中培养，选取原油 降解率高的菌株。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1)中菌的培养温度为45-65°C，优选 50-60°C ;步骤(2)中菌的培养温度为45-65°C，优选50-60°C。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述培养基包括以下重量配比 的组分： 酵母膏 8-12份， 乳酸 0.5-2份， NaCl 8'12份， H2〇 1000 份， 其pH为7.0-7.5。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述液体摇瓶筛选基础培养基 包括以下重量配比的组分： NaCl i 6份， K；5P〇t 0.8-1.2份， NH tHaPO t 0.8_1·2份， (NH Ji-iSO -t 0.8-1.2份， MgSOrTH^J 0.1-0.3 份， KNOs 2-4 份， Η20 1000 份， 其pH为7.5-8.5。8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述液体摇瓶筛选基础培养基 中加入原油，基于培养基的总重量，原油为〇.5*1:%-2.(^1:%。9. 根据权利要求1至3之一所述的菌用于降解长链烷烃的用途。10. 根据权利要求9所述的菌的用途，其特征在于，菌的降解条件如下： 温度45-65 °C，优选50-60 °C，更优选55 °C ;和/或 pH6 · 0-8 · 5，优选 pH6 · 5-7 · 5，更优选 pH7 · 0;和/或
【文档编号】C12N1/20GK105861388SQ201610361364
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】王亚南, 安明理, 何蔚荭
【申请人】河南省科学院生物研究所有限责任公司