一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法，包括以下步骤：取生物指示剂，加入无菌水得到一次稀释液，分装到多支无菌试管；水浴热击；取出并迅速冷却至室温，对每一支无菌试管进行以下操作：采用10倍递增稀释法逐级稀释至适宜梯度得到二次稀释液，取二次稀释液2份分别注入两个无菌平皿内，再分别注入大豆酪蛋白琼脂培养基，凝固后培养；对所有无菌平皿内嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数，再将所有计数结果进行平均计算并再除以上述适宜梯度对应的稀释级，得到初始孢子数量，完成测定。本发明所述方法经过验证稳定可行，解决了以前生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量无法测定的问题，便于推广应用。
【专利说明】一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法。
【背景技术】
[0002] 生物指示剂是一类特殊的活微生物制品，通常为细菌的孢子，因其对特定灭菌处 理有确定的抗力，可用于确认灭菌设备的性能，灭菌工艺的验证，生产过程灭菌效果的监控 等。生物指示剂的使用使得消毒灭菌监测手段更加完善，灭菌效果更加直观、有效，安全性 高更，目前已广泛应用于医疗保健产品、卫生检疫、制药企业、医院制剂生产、食品生产等各 行业，对各种无菌生产工艺、无菌产品、无菌包装材料等灭菌效果的评估、验证。生物指示剂 中包含一定数量的细菌孢子，形式多样，如芽孢悬液、芽孢条、自含式、工业生物指示剂等。 生物指示剂中芽孢含量是生物指示剂的重要质量指标。
[0003] 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus)属嗜热性需氧芽孢杆菌，但 兼有厌氧的特性，细菌繁殖体G兰氏染色阳性呈紫色，细菌芽胞孔雀绿着色。其细菌繁殖体 对培养基要求低，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生长良好，表面粗糙呈米黄色。其最低生 长温度为28°C，最高生长温度70?77°C。最适生长繁殖温度为56?65°C，培养24h即可 形成菌落，37°C下24h看不到菌落。
[0004] 嗜热脂肪芽孢杆菌作为生物指示剂中的一部分，其初始孢子数量到目前为止还没 有一套行之有效的测定方法，用户只能根据其出厂产品的标示孢子数量了解，无法根据应 用需求自主测定，尤其对于未知嗜热脂肪芽孢杆菌孢子数量的生物指示剂更是束手无策。 所以，市场需要能够自主测定生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢 杆菌的初始孢子数量测定方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] 本发明所述生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法，包括以下 步骤：
[0008] (1)取生物指示剂，加入无菌水并混合均匀后得到一次稀释液，一次稀释液中的生 物指示剂与无菌水之间的体积比为1 : (3-5)，将一次稀释液分别按相同体积装入多个无 菌试管，得到供试品，另取1支无菌试管装入同体积的无菌水备用；
[0009] (2)将上述供试品和装有无菌水的无菌试管共同进行水浴热击，水浴温度为 95-KKTC，水浴时间为10-20分钟，在此过程中把温度计插入装有无菌水的无菌试管内以 测定水浴温度；
[0010] (3)水浴热击完成后取出供试品，迅速冷却至室温，对每一支装有一次稀释液的无 菌试管进行以下操作：根据生物指示剂标示初始孢子数量采用10倍递增稀释法，逐级稀释 至适宜梯度得到二次稀释液，该适宜梯度使其菌落数范围为30?300cfu/ml，在该适宜梯 度对应的稀释级下，以无菌操作方法用灭菌吸管吸取二次稀释液两份，每份的体积为A ml， 分别注入两个无菌平皿内，再分别向两个无菌平皿内注入体积为（15?20)A ml温度不超 过450°C的溶化的大豆酪蛋白琼脂培养基，混合均匀，待其凝固后将两个无菌平皿倒置培 养，培养温度为55?60°C，培养时间为40-60小时；
[0011] (4)完成培养后，对所有的无菌平皿内的嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数， 再将所有计数结果进行平均计算，平均后的结果再除以步骤（3)中所述适宜梯度对应的稀 释级，得到最终的初始孢子数量，完成测定。
[0012] 作为优选，所述步骤（1)中，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比 为1 : 4 ;所述步骤⑵中，水浴时间为15分钟；所述步骤⑶中，培养时间为48小时。
[0013] 所述步骤（1)中，每支所述无菌试管内的一次稀释液的体积为10ml，装有所述稀 释液的所述无菌试管的数量为12支；所述步骤（3)中，所述适宜梯度对应的稀释级为10Λ 分别注入两个无菌平皿内的每份二次稀释液的体积为lml，向每个无菌平皿内注入的大豆 酪蛋白琼脂培养基的体积为15?20ml。
[0014] 本发明的有益效果在于：
[0015] 本发明所述方法经过验证稳定可行，解决了以前生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌 的初始孢子数量无法测定的问题，便于用户根据应用需求自主测定生物指示剂中嗜热脂肪 芽孢杆菌的初始孢子数量，尤其适用于未知嗜热脂肪芽孢杆菌孢子数量的生物指示剂的测 定，便于推广应用。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明作进一步具体描述：
[0017] 实施例1 :
[0018] 按以下步骤进行试验：
[0019] (1)取生产批号为"VM328674"的德国默克的生物指示剂15支，每支2ml，采用漩涡 混合仪混合5min后，将15支生物指示剂放置于无菌蓝盖瓶中，用玻璃棒把指示剂的安瓿瓶 全部捣碎，加入无菌水120ml配成一次稀释液，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间 的体积比为1 :4,边加无菌水边冲洗玻璃棒；待冲洗完成后，将无菌蓝盖瓶内的一次稀释液 采用漩涡混合仪混合5min后，取13支无菌试管，分别取无菌蓝盖瓶内的IOml -次稀释液 转移至12无菌试管内，分别标为A1-A12,得到供试品A ;另外1支无菌试管（一般称为"空 白对照管"）取IOml无菌水转入，标为1-0,做水浴热击时升温计时用。
[0020] (2)将上述供试品A和装有无菌水的无菌试管（即空白对照管）共同进行水浴热 击，水浴温度为95-KKTC，水浴时间为15分钟，在此过程中把温度计插入空白对照管内以 测定水浴温度；
[0021] (3)水浴热击完成后取出供试品A，迅速冷却至室温，对每一支装有一次稀释液的 无菌试管A1-A12进行以下操作：根据生物指示剂标示初始孢子数量采用10倍递增稀释法， 逐级稀释至适宜梯度得到二次稀释液，该适宜梯度使其菌落数范围为30?300cfu/ml，本 例中的适宜梯度对应的稀释级为1〇_ 4,以无菌操作方法用灭菌吸管吸取二次稀释液两份， 每份的体积为lml，分别注入两个无菌平皿内，再分别向两个无菌平皿内注入体积为15? 20ml温度不超过450°C的溶化的大豆酪蛋白琼脂培养基，混合均匀，待其凝固后将两个无 菌平皿倒置培养，培养温度为55?60°C，培养时间为48小时；
[0022] (4)完成培养后，对所有的无菌平皿内的嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数， 再将所有计数结果进行平均计算，平均后的结果再除以步骤（3)中所述适宜梯度对应的稀 释级，得到最终的初始孢子数量，完成测定。
[0023] 完成测定后，按下面的公式计算初始孢子数量回收率：
【权利要求】
1. 一种生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法，其特征在于：包括 以下步骤： (1) 取生物指示剂，加入无菌水并混合均匀后得到一次稀释液，一次稀释液中的生物 指示剂与无菌水之间的体积比为1 : (3-5)，将一次稀释液分别按相同体积装入多个无菌 试管，得到供试品，另取1支无菌试管装入同体积的无菌水备用； (2) 将上述供试品和装有无菌水的无菌试管共同进行水浴热击，水浴温度为 95-KKTC，水浴时间为10-20分钟，在此过程中把温度计插入装有无菌水的无菌试管内以 测定水浴温度； (3) 水浴热击完成后取出供试品，迅速冷却至室温，对每一支装有一次稀释液的无菌 试管进行以下操作：根据生物指示剂标示初始孢子数量采用10倍递增稀释法，逐级稀释至 适宜梯度得到二次稀释液，该适宜梯度使其菌落数范围为30?300cfu/ml，在该适宜梯度 对应的稀释级下，以无菌操作方法用灭菌吸管吸取二次稀释液两份，每份的体积为A ml，分 别注入两个无菌平皿内，再分别向两个无菌平皿内注入体积为（15?20) A ml温度不超过 450°C的溶化的大豆酪蛋白琼脂培养基，混合均匀，待其凝固后将两个无菌平皿倒置培养， 培养温度为55飞(TC，培养时间为40-60小时； (4) 完成培养后，对所有的无菌平皿内的嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子进行计数，再 将所有计数结果进行平均计算，平均后的结果再除以步骤（3)中所述适宜梯度对应的稀释 级，得到最终的初始孢子数量，完成测定。
2. 根据权利要求1所述的生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方法， 其特征在于：所述步骤（1)中，一次稀释液中的生物指示剂与无菌水之间的体积比为1 : 4; 所述步骤（2)中，水浴时间为15分钟；所述步骤（3)中，培养时间为48小时。
3. 根据权利要求1或2所述的生物指示剂中嗜热脂肪芽孢杆菌的初始孢子数量测定方 法，其特征在于：所述步骤（1)中，每支所述无菌试管内的一次稀释液的体积为l〇ml，装有 所述稀释液的所述无菌试管的数量为12支；所述步骤（3)中，所述适宜梯度对应的稀释级 为1〇_ 4,分别注入两个无菌平皿内的每份二次稀释液的体积为I ml，向每个无菌平皿内注入 的大豆酪蛋白琼脂培养基的体积为15?20 ml。
【文档编号】C12Q1/06GK104212875SQ201410455570
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】邓茂林, 伍丹, 谭鸿波, 吴小愚, 刘文军, 罗成鑫, 刘思川, 程志鹏, 万阳浴, 葛均友 申请人:四川科伦药业股份有限公司