中度嗜热芽孢杆菌对蔗糖的发酵的制作方法
【专利说明】中度嗜热芽孢杆菌对蔗糖的发酵
[0001] 本申请是申请号为201080037269. 7中国专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及中度嗜热芽孢杆菌（Bacillus)菌株的遗传修饰，以将利用蔗糖的能 力提供给最初不具有该能力的芽孢杆菌菌株。
[0003] 中度嗜热芽孢杆菌菌种，优选为兼性厌氧和同型乳酸的那些菌种，是用于乳酸的 工业生产的理想生物体。
[0004] 在本发明的内容中，中度嗜热芽孢杆菌菌种能够在37至65°C下生长，并且可以在 高于50°C的温度下进行工业发酵。这种高发酵温度在以工业规模发酵时具有几个优点：感 染的风险较低，并且因此产物纯度较高、反应较快等等。此外，这些细菌的营养需求比那些 乳酸细菌（如，乳杆菌属（Lactobacillus)菌种）的需求要低，这还使得工业过程相对廉 价。
[0005] 中度嗜热芽孢杆菌菌种包括需氧菌种和兼性厌氧菌种。优选使用兼性厌氧菌种， 因为这些菌种使得可以在厌氧条件下，或至少在低氧分压下进行发酵，这对于工业规模是 理想的。这样的条件不需要高成本的通风，并且能够使用低成本培养基，同时最小化污染风 险，乃至允许非无菌生产程序。
[0006] 还优选使用同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌菌种。同型乳酸性质使得可以从烃源 (包括己糖和戊糖；参见W004/063382)生产乳酸，而没有形成超过15wt%的副产物，如甲 酸和乙酸。同型乳酸表型的遗传修饰可以用于将同型乳酸菌株转化成同型发酵菌株，用于 可从糖酵解，如从磷酸烯醇丙酮酸和/或丙酮酸获得的其他工业产物。这些化合物的实例 是丙酮酸、乙酰乳酸、双乙酰、醋偶姻、2, 3- 丁二醇、1，2-丙二醇、醋酸、甲酸盐、乙醛、乙醇、 L-丙氨酸、草酰乙酸、S-苹果酸、琥珀酸盐、延胡索酸、2-酮戊二酸、草酰琥珀酸、异柠檬酸、 柠檬酸、乙醛酸。
[0007] 优选地，这些生产菌株是产孢缺陷型的。
[0008] 中度嗜热且兼性厌氧芽孢杆菌菌种的实例是凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans)、史氏芽孢杆菌（Bacillus smithii)、热嗜淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans)和热阴沟芽抱杆菌（Bacillus thermocloacae)，至少头两种菌种也是 同型乳酸的。优选的菌种是凝结芽孢杆菌。
[0009] 在工业发酵中，理想的是在发酵培养基中使用廉价的原材料。例如，蔗糖或含蔗糖 物质常常被用作用于工业发酵的低成本碳源。然而，发现了不是所有用于工业发酵的中度 嗜热芽孢杆菌菌株都具有利用蔗糖作为碳源的能力。这是个缺陷，尤其是如果这样的菌株 已经经过改造来提高它们以工业规模的发酵能力或生产潜能。例如，凝结芽孢杆菌菌株DSM 1看来是非常差的蔗糖发酵菌。使用蔗糖作为唯一碳源时，观察到仅有很少的生长和酸形 成，这可能是由于系统对利用其他糖的非特异性活性引起的。
[0010] 在文献中，提及凝结芽孢杆菌的蔗糖利用能力是可变的Oe Clerck，E.， M. Rodriguez-Diaz, G. Forsyth, L. Lebbe, N. Logan,2004 ：Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains.(凝结芽孢杆菌菌株的多相表征）），Syst. Appl. Microbiol. 27:50-60)。然而，没有任何可获得的关于蔗糖分解代谢中所涉及的基因的 信息，并且在凝结芽孢杆菌36D1基因组序列中不存在任何为蔗糖分解代谢注释的基因 (http://genome, jgj-psf. org/draft microbes/bacco/bacco. home, html)。
[0011] 因此，本发明的一个目的是对最初不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌 株进行遗传修饰，以提供具有利用蔗糖作为碳源的能力的菌株。本发明的另一个目的是利 用一种方法来生产目标化合物，包括依靠含蔗糖的碳源来培养中度嗜热芽孢杆菌菌株。
[0012] 不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株可能缺少一个或多个蔗糖利用 中所涉及的基因。
[0013] 现在本发明公开了蔗糖分解代谢中所涉及的并且可获自中度嗜热芽孢杆菌菌种 的新的基因和多肽，优选获自中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种，最优选获自是同型乳 酸的中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种。
[0014] 新的多肽令人惊讶地展示出与来自其他芽孢杆菌菌种的相应多肽具有相当低的 同源性，而观察到与来自乳杆菌菌种的相应多肽具有较高的同源性。新的基因和多肽可以 将蔗糖利用能力引入与从其可以获得新基因和多肽的菌种相同（或密切相关）的菌种的非 蔗糖利用中度嗜热芽孢杆菌菌株中。特别地，新基因可以通过自体无性繁殖（即，利用物种 特异性遗传物质）来引入遗传物质。
[0015] 因此，在本发明的一个方面中，提供了从不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热 芽孢杆菌菌株构建能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热杆菌菌株的方法。
[0016] 特别地，通过用实现蔗糖的利用必需的多核苷酸（基因）转化不能利用蔗糖作为 碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株从所述亲本菌株产生能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜 热芽孢杆菌菌株。如在此所公开的，这种必需多核苷酸包括编码如下多肽的DNA序列，所述 多肽具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性和具有i)SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或ii)与SEQ ID NO: 1的序列具有至少70%，优选至少75、80、85、90、95%同一性的氨基酸序列，和/或包括 编码如下多肽的DNA序列，所述多肽具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具有i i i) SEQ ID N0:2 的氨基酸序列或iv)与SEQ ID勵:2的序列具有至少70%，优选至少75、80、85、90、95%同 一性的氨基酸序列。
[0017] 可以使用本领域技术人员已知的任何合适的转化程序来进行将用于实现蔗糖的 利用的多核苷酸引入目标中度嗜热芽孢杆菌菌株中，所述转化程序包括原生质体转化或 原生质体融合、电穿孔、生物射弹转化、接合或天然感受态细胞的转化。例如，可以使用如 W02007/085443中公开的转化程序，在此将该文献引入作为参考。
[0018] 可以使用自主复制质粒或通过染色体整合来引入用于实现蔗糖的利用的多核苷 酸。对于工业应用，优选后者，因为通常认为染色体整合更稳定，并且将确保多核苷酸在后 代细胞中的稳定分配。蔗糖发酵自身可能是维持用于实现蔗糖的利用的多核苷酸的选择压 力。可以通过非同源性以及同源性重组来进行多核苷酸引入染色体中。
[0019] 优选同源性重组，因为其打开了将功能性引入细菌染色体中、从细菌染色体中除 去功能性或同时将功能性引入细菌染色体中和从细菌染色体中除去功能性的机会。当试图 进行同源性重组时，转化多核苷酸进一步含有与待工程化的特定芽孢杆菌的基因组目标序 列同源的DNA序列。对于该目的，可以选择任何合适的目标序列。例如，合适的基因组目标 序列位于基因组的非编码区。本领域技术人员将理解不需要100%的同一性来获得同源性 重组。约90%的同一性百分比也将满足要求。通常，待通过同源性重组插入染色体中的目 标DNA序列两侧为具有足够长度的同源性序列，以能够进行同源性重组。这样的长度可以 是至少约l〇〇bp，例如，约200至约1500bp，优选约200至约lOOObp。
[0020] 为了完成用于实现蔗糖的利用的多核苷酸的表达，给多核苷酸的编码序列提供了 必需的调控序列。这些调控序列可以是天然调控序列或可以是与所讨论的编码序列异源 的。
[0021] 在进一步的方面中，提供了新的多肽，即，具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性的多肽 和具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性的多肽。具有蔗糖特异性磷酸转移酶活性的多肽具有i) SEQ ID N0:1的氨基酸序列或ii)与SEQ ID N0:1的序列具有至少70%，优选至少75%， 更优选至少80%，再更优选至少85%，再更优选至少90%，最优选至少95 %同一'丨生的氨基 酸序列。具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性的多肽具有i)SEQ ID N0:2的氨基酸序列或ii)与 SEQ ID N0:2的序列具有至少70%，优选至少75%，更优选至少80%，再更优选至少85%， 再更优选至少90%，最优选至少95%同一'丨生的氨基酸序列。
[0022] 具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蔗糖特异性磷酸转移酶多肽与来自戊糖片球 菌（Pediococcus pentosaceus)和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)(在蛋白质水 平上都是62 %的同一性）以及其他乳酸细菌的蔗糖特异性PTS系统EIIBCA组成部分享 有显著的同源性。令人惊讶地，与其他芽孢杆菌菌种的同源性低得多，与克劳氏芽孢杆菌 (Bacillus clausii)同源物具有最高的同一'丨生（在蛋白质水平上为44%同一'丨生）。
[0023] 具有SEQIDN0:2的氨基酸序列的蔗糖-6-磷酸水解酶多肽与来自清酒乳杆菌 (Lactobacillus sakei)(在蛋白质水平为50%同一'I"生）以及其他乳酸细菌的鹿糖_6_磷 酸水解酶享有显著的同源性。对于这种多肽，也令人惊讶地看到了与其他芽孢杆菌同源物 的同源性低于与乳酸细菌的。最接近的芽孢杆菌同源物来自克劳氏芽孢杆菌（在蛋白质水 平上为41 %同一性）。
[0024] 对于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度指的是两个序列之间相 同氨基酸的百分比。使用BLAST算法确定同一性程度，所述算法描述于Altschul等， J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)。用于进行BLAS