col 位点，SEQ ID NO:9)，以及来自蔗糖 发酵凝结芽孢杆菌菌株的基因组DNA作为模板DNA，产生了启动子部分。使用引物组合（正 向）5, -CACAAAAAGAAAAGAACGGGGTGGACCCATGGACTTTAATAAAATTGATTTAG-3,(引入 Nco I 位 点，SEQ ID NO: 10)和（反向）5，-CGCAGATCTCCTTCTT CAACTAACGGG-3，（引入 Bglll 位 点，SEQ ID NO: 11)，使用pMH3作为模板，产生了 cat基因。将两个产物都用作新PCR反应中 的模板，使用启动子正向和cat反向引物。该片段还可以作为具有SEQ ID NO: 18中所示序 列的合成DNA产生。将所得到质粒命名为pMH71。为了能够多重使用Cre-lox系统，使用引 物 5，-CCCGTCGACGCTAGCTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTGGATAAGACAACAGGATTCG -3，（引入 lox66，SalI 和 Nhel 位点，SEQ ID NO: 12)和 5，-CGCAGATCTTACCGTTCGTATAGCAT ACATTATACGAAGTTATCCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAG-3，（引入 lox71 和BglII 位点，SEQ ID NO: 13)以及pMH71作为模板，通过PCR，在启动子-cat片段两侧引入了 lox66和lox71位点 (Langer,S. J. ,A. P. Ghafoori,M. Byrd,和L. Leinwand,2002:A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites, Nucleic Acids Res. 30:3067-3077. , Lambert, J. M. , R. S. Bongers,和 M. Kleere-bezem,2007 :Cre-lox-basedsystem for multiple gene deletions and selectable-market removal in Lactobacillus plantarum, Appl. Environ. Microbiol. 73:1126-1135)。所得到的PCR产物用 Bglll-Sall 消化并用于与pMH71 的Bglll-Sall启动子-cat片段交换，产生质粒pMH77。使用引物5' -CGCCTCGAGAGATCTGG CCGGGCTTTATGGGAGG-3'(引入Xhol 和BglII 位点，SEQ ID NO: 14)和 5' -GCCGAGCTCGCATG SCCCTGATCAACCGGGTCAGTGC (引入 SacI 和 SphI 位点，SEQ ID NO: 15)以及凝结芽孢杆菌 DSM 1染色体DNA作为模板，通过PCR，产生了整合位点的上游片段。使用SacI和Xhol，在pMH77 中克隆 PCR 产物。这产生了 pMH82。使用引物 Y -CCCGCTAGCCGTTTCAATCACATAGTCGTATTG (引入Nhel 位点，SEQ ID NO: 16)和 5' -CCGGTCGACGGCCTTCATGTGCTTTTGCCGCAAATTC(引入 Sail位点，SEQ ID NO: 17)以及凝结芽孢杆菌DSM 1染色体DNA作为模板，通过PCR，产生了 整合位点的下游片段。作为Sall-Nhel片段，在pMH82中克隆了 PCR产物，产生pMH83。在 用相同的酶消化的PMH83中，作为SphI和SacI片段，克隆了含有scrAB基因的DNA片段， 这产生了整合载体PMH84。分离质粒pMH84并且通过DNA序列分离证实了 scrAB基因簇、上 游和下游区域以及lox位点的完整性。
[0049] 实施例2.凝结芽孢杆菌DSM1中scrAB的基因组整合
[0050] 为了 scrAB基因通过基因组整合至凝结芽孢杆菌DSM1中，通过电穿孔将质粒 PMH84转化至该菌株中，并涂布于补充了氯霉素的BC平板上。通过菌落PCR筛选转化体中 质粒的存在。将阳性菌落进行培养，用于质粒分离，并通过限制性分析证实了质粒的完整 性。选择一个转化体用于进一步的实验。在60°C下培养并且选择氯霉素抗性菌落后，建立 了通过双重交叉交换的蔗糖基因的整合。选择一个整合体用于进一步的研究并且作为甘油 储液进行贮存。通过融合位点的PCR分析和序列分离证实了该正确的整合。将该菌株命名 为凝结芽孢杆菌DSM l::scrAB。
[0051] 实施例3.使用凝结芽孢杆菌的蔗糖发酵
[0052] 在该实施例中，发明人证明了怎样能够修饰不能有效蔗糖发酵的凝结芽孢杆菌菌 株以变成蔗糖发酵的。将来自甘油储液的凝结芽孢杆菌DSM 1和DSM l::ScrAB接种于10ml 不含糖的BC肉汤中，并且在120rpm下，在50°C下培养。将过夜培养物转移（2% v/v)至 l〇ml补充了葡萄糖的CDM中。过夜培养后，使培养物成团，并且将团状物重悬浮于10ml不 含糖的CDM中。对于每个菌株，从重悬浮的培养物接种（2%v/v)10mlCDM的三个重复部分 中，所述CDM补充了 5g葡萄糖/升，5g蔗糖/升，或不含糖。在螺帽试管中50小时静止培 养后，测定了肉汤上清液在600nm处的浊度、pH和有机酸含量（表1)。结果证明了适当的 厌氧生长需要糖，并且凝结芽孢杆菌DSM1: :scrAB能够将蔗糖发酵成乳酸，而凝结芽孢杆 菌DSM1不能。糖的不存在导致两种凝结芽孢杆菌菌株都没有生长且没有酸化。在蔗糖的 存在下，DSM1显示出没有生长且没有酸化，而凝结芽孢杆菌DSM1: :scrAB具有良好的生 长和酸化。乳酸是培养物上清液中检测到的唯一一种有机酸。这证明了引入凝结芽孢杆菌 scrAB基因盒对于使用凝结芽孢杆菌的有效蔗糖发酵是足够的。
[0053]表1. 50小时培养后的发酵特征a
【主权项】
1. 用于生产目标化合物的方法，包括依靠含蔗糖碳源培养中度嗜热芽孢杆菌菌株，其 特征在于，通过用多核苷酸转化不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株从所 述亲本菌株产生所述中度嗜热芽孢杆菌菌株，所述多核苷酸包括编码具有蔗糖-特异性磷 酸转移酶活性和具有i)SEQIDNO: 1的氨基酸序列或ii)与SEQIDNO: 1的序列具有至少 90 %同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列和包括编码具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具 有iii)SEQIDNO: 2的氨基酸序列或iv)与SEQIDNO: 2的序列具有至少90%同一性的氨 基酸序列的多肽的DNA序列。
2. 根据权利要求1的方法，其中目标化合物是乳酸。
3. 用于构建能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株的方法，包括用多核苷酸 转化不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株，所述多核苷酸包括编码具有蔗 糖-特异性磷酸转移酶活性和具有i)SEQIDNO: 1的氨基酸序列或ii)与SEQIDNO: 1的 序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列和包括编码具有蔗糖-6-磷酸 水解酶活性和具有iii)SEQIDNO: 2的氨基酸序列或iv)与SEQIDNO: 2的序列具有至少 90 %同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
4. 根据之前任一项权利要求的方法，其中中度嗜热芽孢杆菌菌株是兼性厌氧的。
5. 根据之前任一项权利要求的方法，其中中度嗜热芽孢杆菌菌株是同型乳酸的。
6. 根据之前任一项权利要求的方法，其中中度嗜热芽孢杆菌菌株是凝结芽孢杆菌 (Bacilluscoagulans)〇
7. 多肽，具有蔗糖-特异性磷酸转移酶活性和具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列或与SEQ IDNO: 1的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
8. 多肽，具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具有SEQIDNO: 2的氨基酸序列或与SEQID NO: 2的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
9. 编码权利要求7或8的多肽的多核苷酸。
10. 权利要求9的多核苷酸，具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的序列。
【专利摘要】本发明公开了构建能够利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株的方法，包括用多核苷酸转化不能利用蔗糖作为碳源的亲本中度嗜热芽孢杆菌菌株，所述多核苷酸包括编码具有蔗糖-特异性磷酸转移酶活性和具有i)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或ii)与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列和/或包括编码具有蔗糖-6-磷酸水解酶活性和具有iii)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或iv)与SEQ ID NO:2的序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。本发明进一步公开了用于生产目标化合物的方法，包括依靠含蔗糖碳源培养转化的中度嗜热芽孢杆菌菌株。最后，公开了能够利用蔗糖的新的多肽和多核苷酸。
【IPC分类】C12R1-07, C12N15-54, C12N9-10, C12N15-75, C12N9-16, C12P7-56, C12N15-55
【公开号】CN104694564
【申请号】CN201510103715
【发明人】R·范科拉南伯格, M·范哈特斯坎普
【申请人】普拉克生化公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2010年7月15日
【公告号】CN102482335A, CN102482335B, EP2275436A1, EP2275436B1, US8663954, US20120208248, WO2011006966A1, WO2011006966A9